一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法与流程

本发明涉及活性药物的技术领域，尤其涉及一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法。

背景技术：

丁香酸，又称3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸。丁香酸及其衍生物是重要的医药中间体、农用化学品以及光敏剂等，在国际市场上需求量较大。丁香酸是石斛中提取的化学单体,因含有酚性羟基，故较易发生氧化、聚合、宿合等变化，具有较好的抗氧化、清除自由基的能力。丁香酸也具有药化作用。药化作用主要包括抗菌作用和中枢抑制作用。其中抗菌作用体现在丁香酸为白蒿的主要抗菌有效成分，有抗细菌和真菌的作用；中枢抑制作用体现在丁香酸有镇静和局部麻醉作用；丁香酸广泛的运用于医药、香料、农药化学和有机合成工业。但在现有技术中，尚未有报道丁香酸存在于螺旋藻中。

有鉴于此，本发明人研究和设计了一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提后，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的多次色谱分离，以最终从螺旋藻中制得丁香酸。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：

一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、称取50g螺旋藻粉置于1l的三角瓶中，加入500ml无水乙醚摇匀，浸提4h，抽滤，收集滤液；再向沉淀中加入500ml无水乙醚进行第二次浸提4h，抽滤，收集滤液；如此浸提3次，合并滤液，真空减压浓缩蒸干，得粗提物；

步骤二、将粗提物用甲醇溶解后，上sephadexlh-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为8s/drop，每0.5h收集一管，共收集216管，每管组分用薄层层析tlc分析，合并含有相同物质的组分；再将合并组分用甲醇稀释至浓度为5mg/ml，用dpph法测定合并组分的抗氧化活性，选用抗氧化活性最高的合并组分标记为t1，蒸干，4℃贮藏备用；

步骤三、组分t1用适量甲醇溶解后，上c18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为95％水：5％甲醇、75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；控制流速为8ml/min，前四个梯度中，每个梯度收集5管，最后一个梯度收集16管，每管收集7min，共收集36管；每管组分用薄层层析tlc分析，合并含有相同物质的组分；选择量较大的合并组分，标记为t2，用甲醇稀释至浓度为5mg/ml，用dpph法测定组分t2的抗氧化活性，蒸干，4℃贮藏备用；

步骤四、组分t2用适量甲醇溶解后，上sephadexlh-20凝胶柱，用甲醇作为洗脱剂进行洗脱，控制流速为13s/drop，每0.5h收集一管，共收集40管，每管组分用薄层层析tlc分析，合并含有相同物质的组分，标记为t3；再将组分t3用甲醇稀释至浓度为5mg/ml，用dpph法测定组分t3的抗氧化活性，蒸干，4℃贮藏备用；

步骤五、组分t3加适量甲醇溶解后，上c18反相硅胶柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为25％水：75％甲醇、15％水：85％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；控制流速为8ml/min，前三个梯度中，每个梯度收集5管，最后一个梯度收集8管，每管收集7min，共收集23管；每管组分用薄层层析tlc分析，合并含有相同物质的组分，标记为t4，组分t4用甲醇稀释至浓度为5mg/ml，用dpph法测定组分t4的抗氧化活性，蒸干，4℃贮藏备用；

步骤六、组分t4加适量甲醇溶解后，过正相硅胶柱分离；用硅胶粉拌样，硅胶用石油醚饱和后装柱，样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为石油醚和丙酮的体积比为300：1、250：1、200：1、150％：1、80：1、50：1、20：1、10：1、5：1；首先用石油醚：丙酮为300：1的洗脱液洗脱，共用洗脱液300ml，每9ml收集一管，同时用tlc追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚：丙酮为10:1的洗脱液被洗脱下来，继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用tlc显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第3至第8管，进行tlc分析，经过真空减压浓缩，得化合物a；

步骤七、将化合物a装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以tms作为内标，使用400mh核磁共振仪测定化合物a的核磁谱，经过对核磁谱的数据解析，得知化合物a为丁香酸，即制得丁香酸。

根据本发明实施例，本发明采用上述技术方案后，通过在螺旋藻中加入抽提液逐步抽提，并通过反相硅胶柱及正相硅胶柱的多次色谱分离，以最终从螺旋藻中制得丁香酸，本发明从螺旋藻中首次分离到了丁香酸。

作为实施例的优选方式，所述步骤六中包括：

a、硅胶粉活化：

取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用；

b、拌样：

根据样品：硅胶粉为1:1.2对样品进行拌样，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈均匀粉末状，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用；

c、装柱：

采用湿法装柱，称取1.8g硅胶粉用石油醚饱和后装柱；

d、上样：

采用干法上样，将吸附有样品的硅胶粉装至层析柱中，使其均匀沉降于硅胶层表面，待样品沉降完全，打开阀门，收集洗脱液。

作为实施例的优选方式，所述薄层层析tlc追踪为：将gf254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和碘缸染色、硫酸乙醇显色剂进行显色。

附图说明

图1是化合物a的薄层层析结果；

图2是本发明化合物a的结构图；

图3是本发明化合物a的¹h-nmr的核磁共振谱图；

图4是本发明化合物a的¹³c-nmr核磁共振谱图。

具体实施方式

本发明所使用的仪器设备如下表1所示：

表1实验用主要仪器和生产厂家

本发明所使用的主要试剂及药品如下表2所示：

表2实验用主要的试剂和药品

本发明所使用的显色试剂的配制：

(1)碘显色试剂：碘粒与硅胶混合比例约1:3，即10g碘粒配30g硅胶粉，配大约500ml的玻璃缸半瓶，充分的摇匀使碘蒸汽充满瓶体。

(2)5％硫酸乙醇溶液：取25ml浓硫酸加入到500ml无水乙醇中，混匀。

本发明所使用抗氧化测试方法：

(1)dpph自由基清除率实验

dpph测试液的配制

取dpph1mg溶于约20ml乙醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1ml该dpph溶液，在519nm处测吸光值，使a＝1.2-1.3之间最佳。该dpph溶液最好避光保存，3.5小时内用完。

样品液的配制

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/ml浓度。

a0值的测量

取dpph溶液2ml加入到小试管中，加无水乙醇1ml，充分混合，测a值(519nm)，此a值为a0。

a值的测量

取dpph溶液2ml加入到小试管中，加样品液xμl，再加(1000-x)μl无水乙醇，混合，静置30分钟后，测a值(519nm)

dpph清除率计算

(2)总抗氧化能力的测定

96孔板的每个检测孔中加入180ulfrap工作液。

空白对照孔中加入5ul蒸馏水或pbs等适当溶液；标准曲线检测孔内加入5ul各种浓度的feso4标准溶液；样品检测孔内加入5ul各种样品或0.15-1.5mm的trolox作为阳性对照。轻轻混匀。

37℃孵育3-5min后测定a593。如果测定a593有困难，也可以在585-605nm范围内进行测定。

根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。如果样品测定出来的吸光度在标准曲线范围以外，需把样品适当稀释后再进行测定。

总抗氧化能力的表示方式：对于frap方法，总抗氧化能力用feso4标准溶液的浓度来表示。例如某血浆样品测定获得的吸光度和1mmfeso4标准溶液的吸光度相同，则该血浆样品的总抗氧化能力即为1mm；再如某血清样品测定获得的吸光度和0.65mmfeso4标准溶液相同，则该血清样品的总抗氧化能力为0.65mm；再如某细胞匀浆液测定获得的吸光度和0.3mmfeso4标准溶液相同，并且该匀浆液的蛋白浓度为0.15mg/ml，则该细胞样品的总抗氧化能力为0.3mm/0.15mg/ml，即2mmol/g；再如0.2mm的某抗氧化物其测定获得的吸光度和1mm的亚铁盐测定获得的吸光度相同，则其相对总抗氧化能力为5。

(3)黄嘌呤氧化酶抑制剂

磷酸盐缓冲液(0.1mol/lph7.0)

准确称取磷酸氢二钠(na2hpo4.2h2o)2.066g、磷酸二氢钠(nah2po4.12h2o)0.659g、氯化钠(nacl)0.900g，溶解后用蒸馏水定容至100ml，室温保存备用。

1mm的黄嘌呤(现配现用)

准确称取黄嘌呤粉末15.211mg，溶于2ml0.1mnaoh，再用0.1m的pbs缓冲液溶于100ml的容量瓶中，常温下保存。

黄嘌呤氧化酶

现有10u/ml的黄嘌呤氧化酶原液，用pbs配制成浓度为0.1u/ml，4℃避光保存备用。

别嘌呤醇(阳性对照，10μg/ml最佳)

准确称取10.000mg于的别嘌呤醇干粉，先溶于1ml0.1mnaoh，再溶解于10ml的容量瓶中即得1mg/ml的储备液，用时用pbs进行稀释即得工作液。

测试及计算

试剂c1c2c3c4；

pbs/ul175125100175；

样品/ul－－2525；

黄嘌呤氧化酶/ul252525－；

37℃，孵育10min；

黄嘌呤/ul－5050－；

振板30s，295nm波长处立即检测(uv-96well)。

式中：c1－调零组；

c2－完全反应组；

c3－样品反应组(阳性对照)；

c4－样品对照组。

实施例

本发明揭示了一种从螺旋藻中制备丁香酸的方法，包括以下步骤：

用乙醚富集螺旋藻多酚粗提物：

准确称取50g螺旋藻粉置于1l的三角瓶中，加入500ml无水乙醚摇匀，浸提4h，抽滤萃取液，收集滤液；再向沉淀中加入500ml无水乙醚进行第二次浸提4h，抽滤萃取液，收集滤液；如此浸提3次，合并滤液，真空减压浓缩蒸干，根据差量法得到粗提物的质量为6.6828g。

粗提物的第一次分离纯化：

粗提物的第一次分离选用sephadexlh-20凝胶柱，洗脱剂选用甲醇，首先用洗脱剂冲洗柱子，然后向6.6828g粗提物中加入适量的甲醇溶解，上样至冲洗好的sephadexlh-20凝胶柱，开始洗脱，控制流速为8s/滴，每0.5h收集一管，共收集216管；每管组分都要采用tlc进行物质追踪，经过摸索确定最佳展开剂为三氯甲烷：甲醇＝10:1，根据紫外分析、碘缸染色以及硫酸乙醇的显色情况，合并含有相同物质的组分，主要得到4种组分，将四种组分分别蒸干得y1(28-41)2.1733g、y2(42-53)0.3909g、y3(54-70)0.3018g、y4(71-83)0.2804g，将四种组分分别溶解稀释至浓度为5mg/ml，然后分别用上文所采用的三种方法测定四种组分的抗氧化活性，如表3-表5所示。选出抗氧化活性最高的是y4组分标记为t1；测完以后将组分t1蒸干，4℃贮藏备用。

表3y1-y4四种组分对dpph自由基的清除率

表4y1-y4四种组分的总抗氧化能力

表5y1-y4四种组分对xod酶的抑制率

粗提物的第二次分离纯化：

第二次纯化选用c18反相硅胶柱，加入适量的甲醇溶解组分t1，上样至预先处理好的rp-c18柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为95％水：5％甲醇、75％水：25％甲醇、50％水：50％甲醇、25％水：75％甲醇、100％甲醇；设定最大压力1mpa，控制流速8ml/min,前四个梯度中，每个梯度收集5管，最后一个梯度收集16管，每管收集7min，共收集36管；收集完毕后用5％水+95％甲醇冲洗柱子40min，再用100％甲醇冲洗柱子40min，分离完毕；将收集的每一管组分分别45℃真空减压浓缩转移至小试管中，分别点板进行tlc分析，根据紫外分析、碘缸染色以及硫酸乙醇的显色情况，合并含有相同物质的组分，真空减压浓缩后得到y5(第3个梯度的第2-4管)14.9mg和y6(第5个梯度的第2-3管)42.2mg，选择量较大的y6组分，标记为t2，加入适量甲醇溶解至浓度为5mg/ml，然后用dpph法测定其抗氧化活性，结果如表6所示；测完后将样品蒸干，4℃贮藏备用。

表6t2组分对dpph自由基的清除率

粗提物的第三次分离纯化：

将t2组分加入适量的甲醇溶解，上样至预先冲洗好的sephadexlh-20凝胶柱，选甲醇作为洗脱剂进行洗脱，调节流速为13s/drop，每0.5h收集一管，共收集40管；每管组分都分别点板进行tlc分析，分析三种显色情况，合并含有相同物质的组分，真空减压浓缩之后得到y7(15-17)15.2mg，标记为组分t3，加入适量甲醇溶解至浓度为5mg/ml，然后用dpph法测定其抗氧化活性，结果如表7所示；测完后将样品蒸干，4℃贮藏备用。

表7t3组分对dpph自由基的清除率

粗提物的第四次分离纯化：

第四次纯化选用c18反相硅胶柱，首先用25％水+75％甲醇冲洗柱子大概0.5h，加入适量的甲醇溶解样品之后，上样于已处理好的rp-c18柱，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为25％水：75％甲醇、15％水：85％甲醇、5％水：95％甲醇、100％甲醇；控制流速为8ml/min；设定最大压力1mpa，控制流速为8ml/min，前三个梯度中，每个梯度收集5管，最后一个梯度收集8管，每管收集时间为7min，共收集23管；收集完毕后用5％水+95％甲醇冲洗柱子40min，分离完毕；将收集的每一管组分分别45℃真空减压浓缩至小试管中，分别点板进行tlc分析，根据碘缸染色、硫酸乙醇的显色情况，合并含有相同物质的组分真空减压浓缩后得到y8(第3个梯度第2-3管)10.6mg，标记为组分t4，组分t4加入适量甲醇溶解至浓度为5mg/ml，然后用dpph法测定其抗氧化活性，结果如表8所示；测完以后将样品蒸干，4℃贮藏备用。

表8t4组分对dpph自由基的清除率

粗提物的第五次分离纯化：

根据前面的分离效果，此次纯化选用正相硅胶柱；先将硅胶粉活化：取200～300目硅胶粉于试剂瓶中，用扎孔的锡箔纸包好瓶口，置于110℃烘箱中活化2～3h，冷却后封好瓶口置于干燥器中，备用。再进行拌样：根据样品：硅胶粉为1:1.2对样品进行拌样，用胶头滴管吸取样品液滴至圆底烧瓶中的硅胶粉上，迅速搅拌均匀并间歇用电吹风给圆底烧瓶加热以使溶剂快速挥干，使样品呈松散的混合物，如此重复，直至样品全部吸附于硅胶粉上，继续加热，使样品中的溶剂完全挥发，用滤纸封口后置于干燥器中备用。接着将1.8g正相硅胶粉用石油醚饱和后装柱。样品上柱后，采用梯度洗脱的方式洗脱样品，梯度设置为石油醚和丙酮的体积比为300:1、250:1、200:1、150:1、80:1、50:1、20:1、10:1、5:1；首先用石油醚:丙酮为300:1的洗脱液洗脱，共用洗脱液300ml，每9ml收集一管，同时用tlc追踪目标点，若没有发现目标点，则换下一个洗脱梯度；目标点在石油醚:丙酮为10:1的洗脱液被洗脱下来，则继续用这个梯度的洗脱剂洗脱，用tlc显色判断洗脱终点，合并这个梯度的第3至第8管，进行tlc分析，经过真空减压浓缩，得化合物a。

另外，本发明所采用的tlc分析是将gf254硅胶板于110℃烘箱中活化2～3h，待其自然冷却至室温后取出，置于干燥器中备用，用玻璃毛细管吸取适量样品，点于硅胶板基线上，并在样点下端用铅笔做好标记，硅胶板上基线距板底端距离为0.8～1cm，两样点之间的距离不小于0.8cm，用吹风机吹干溶剂后，置于装有饱和层析液的层析缸中展开，待溶剂前沿展至距薄层板顶端约1cm时，用镊子取出，吹干溶剂，用紫外分析仪和其它显色剂进行显色。

化合物的结构鉴定：

首先用重铬酸钾浸泡核磁管，浸泡12h后，甩出重铬酸钾溶液再用甲醇清洗，若甲醇洗不干净再用三氯甲烷来洗，洗干净后再用色谱级的甲醇润洗几遍，核磁管洗完后吹干称其重量，将样品用氘代甲醇溶解吸入核磁管，然后用滤纸封口放在蒸发瓶真空减压蒸干溶剂，再称其重量，通过差量法可知最后检测的化合物a的重量为3.5mg，最后采用“400mhz-nmr”测定化合物的核磁谱。

将化合物a装入核磁管中，蒸干溶剂，加入氘代试剂，以tms作为内标，使用400mh核磁共振仪测定化合物a的核磁谱，化合物a核磁谱数据如表9所示。

表9化合物a的核磁谱数据

进行质谱测定后可知化合物a的esi-ms:m/z＝221.39，综合化合物a的核磁谱数据及质谱数据并与文献进行比对，推测化合物a(分子式c9h10o5，分子量为198.23)为丁香酸，其结构如图2所示。化合物丁香酸的¹h-nmr、¹³c-nmr核磁谱图如图3及图4所示。

本发明主要通过凝胶柱层析和正反相硅胶柱层析对螺旋藻中的活性成分进行分离，并首次分离出了丁香酸，丁香酸作为螺旋藻的活性成分，对于螺旋藻的二次开发意义重大。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。