肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用的制作方法

文档序号：17087959发布日期：2019-03-13 23:05阅读：926来源：国知局

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及肺炎链球菌pepo、zmpb673-863在抗肺炎链球菌感染中的应用，特别涉及肺炎链球菌肽链内切酶o作为皮下免疫佐剂的应用，zmpb673-863作为疫苗单独与其他佐剂混合的使用以及pepo与zmpb673-863混合或融合表达在抗肺炎链球菌感染中的应用。

背景技术：

肺炎链球菌可引起肺炎、脑膜炎和脓毒症，全世界每年有近40万名5岁以下儿童因为肺炎链球菌的感染死亡。肺炎球菌败血症是发展中国家婴儿死亡的主要原因，在发展中国家，每年约有25％的5岁以下儿童和120多万婴儿死亡是可以预防的死亡。目前的结合疫苗制剂(pcv7、10和13)自引入以来对减少儿童肺炎球菌病产生了重大影响。尽管pcv取得了巨大的成功，但其局限性已变得显而易见。最近几年，在消灭疫苗特异性肺炎球菌血清型之后，出现了新的非疫苗血清型菌株的感染。此外，pcv的生产成本很高，这使得在低收入国家难以大规模实施。基于上述原因，有必要制定一种与血清型无关的肺炎球菌疫苗策略。因此，需要研制一种廉价的、不依赖血清型的疫苗。

蛋白(多肽)疫苗(ppvs)对预防肺炎球菌病的效果是值得期待的。以蛋白质为基础的疫苗的优点在于，其在肺炎链球的血清型中保守性较好，用重组dna技术相对便宜，并且能够诱导持久的记忆反应，并且可以通过重新接种来增强。有多种候选疫苗抗原正在进行临床前评估，包括肺炎球菌表面蛋白a(pspa)、肺炎溶菌素(ply)、pht家族(phta、phtb、phtd和phte)、肺炎球菌胆碱结合蛋白a(pcpa)、肺炎球菌表面粘附a(psaa)、用恢复期人血清筛选出的(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和肺炎球菌细胞壁分离蛋白)和从蛋白质组学筛选出的(sp_2108、sp_0148和sp_1912)(13-21)鉴定的th17抗原，从蛋白质组学筛选出最高抗体靶标(sp_2108、sp_0148和sp_1912)。

然而，大部分蛋白质其免疫原性仍不够强，为了诱导持久的高免疫反应，都需要添加佐剂。然而目前适合于人用的免疫佐剂很少，铝佐剂(al佐剂)是目前绝大多数商品化人用疫苗的佐剂。但al佐剂的ctl反应较弱，且预防接种会导致固有免疫的不良反应，如红斑、皮下结节，还有肉芽肿等。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用，用于解决现有技术中大部分蛋白质其免疫原性仍不够强、会引起不良反应等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种肺炎链球菌蛋白质或多肽，其氨基酸序列含有如下片段中的至少一种：

a1)如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8所示多肽片段中的至少一种；

a2)氨基酸序列与seqidno.5-8所示多肽片段，具有80％以上同源性、且具有a1)限定的多肽片段的功能的多肽片段。

seqidno.5所示的氨基酸序列中，单波浪线标示的序列为his标签，具体序列为“glysergluphegluleuargarg”，单直线标示的序列为linker的序列，具体序列为“hishishishishishis”。

seqidno.6所示的氨基酸序列中，双波浪线标示的序列为his标签，具体序列为“glysergluphegluleuargarg”，双直线标示的序列为linker的序列，具体序列为“hishishishishishis”。

本发明第二方面提供一种分离的或纯化的上述蛋白质或多肽。

本发明第三方面提供一种分离的多核苷酸，编码如上所述的蛋白质或多肽。

可选地，所述多核苷酸的序列包括如下序列中的至少一种：

(1)如seqidno.1所示的片段或其rna等同物；

(2)与(1)中任意序列互补的序列；

(3)与(1)或(2)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；

(4)如seqidno.2所示的片段或其rna等同物；

(5)与(4)中任意序列互补的序列；

(6)与(4)或(5)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；

(7)如seqidno.3所示的片段或其rna等同物；

(8)与(7)中任意序列互补的序列；

(9)与(7)或(8)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；

(10)如seqidno.4所示的片段或其rna等同物；

(11)与(10)中任意序列互补的序列；

(12)与(10)或(11)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列。

本发明第四方面提供一种构建体，所述构建体含有上述分离的多核苷酸。

本发明第五方面提供一种表达系统，所述表达系统含有上述构建体或基因组中整合有外源的上述多核苷酸。

本发明第六方面提供上述蛋白质或多肽的制备方法，包括：在适合表达所述蛋白质或多肽的条件下，培养如上所述的表达系统。

本发明第七方面提供一种免疫原性和/或抗原性的组合物，该组合物含有上述蛋白质或多肽。

可选地，含有seqidno.8所示多肽片段。

可选地，所述组合物为疫苗。

可选地，所述疫苗含有一种或多种选自赋形剂、稀释剂、佐剂的其它组分。

可选地，所述佐剂选自铝佐剂、霍乱毒素(choleratoxin,ct)、不耐热稳定肠毒素(heat-labileentero-toxin,lt)、单磷酰脂质a(monophosphoryllipida,mpl)中的至少一种

铝佐剂是一种乳白色的冻胶状半固体，主要种类有氢氧化铝凝胶，磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾等，该试剂可以从市场上购买得到。

霍乱毒素(ct)是霍乱弧菌分泌的一种不耐热肠毒素,既是强黏膜免疫原，又具有很强的黏膜佐剂活性，是当今研究最多且最深入的黏膜免疫佐剂之一。然而，由于ct具有毒性，限制了其在人体的使用。

不耐热肠毒素(lt)是肠产毒性大肠杆菌分泌的一种热不稳定肠毒素。lt能有效地启动机体局部和全身的体液免疫和细胞免疫，具有很强的黏膜免疫原性和黏膜佐剂活性。然而，lt作为黏膜免疫佐剂，因其具有较强的毒性不适于人体使用。

单磷酰脂质a(mpl)是脂质a经酸控水解失去1-磷酸(或1-焦磷酸)所形成的一种类脂a衍生物，基本失去了内毒素(lps)的毒性，是一种新的佐剂。主要应用于商品化的人宫颈癌疫苗

上述佐剂仅仅是部分列举，其他类似佐剂也可用于本发明。

可选地，所述组合物包括如下组合中的至少一种：

1)含有如seqidno.5所示的氨基酸序列；

2)含有如seqidno.6所示的氨基酸序列；

3)含有如seqidno.7所示的氨基酸序列；

4)含有如seqidno.8所示的氨基酸序列；

5)含有如seqidno.7以及seqidno.8所示的氨基酸序列；

6)含有seqidno.8所示的氨基酸序列以及佐剂。

可选地，所述组合物包括如下组合中的至少一种：

1)含有如seqidno.5所示的氨基酸序列；

2)含有如seqidno.6所示的氨基酸序列；

3)含有如seqidno.7以及seqidno.8所示的氨基酸序列；

4)含有seqidno.8所示的氨基酸序列以及佐剂。

可选地，所述佐剂选铝佐剂、霍乱毒素(choleratoxin,ct)、不耐热稳定肠毒素(heat-labileentero-toxin,lt)、单磷酰脂质a(monophosphoryllipida,mpl)等中的至少一种。

本发明第八方面提供一种用于预防和/或治疗肺炎链球菌感染的佐剂，其含有如seqidno.7所示的氨基酸序列。

本发明第九方面提供一种用于预防和/或治疗肺炎链球菌感染的疫苗，其含有如seqidno.5、seqidno.6、seqidno.8中任一项所示的氨基酸序列。

可选地，上述疫苗还含有佐剂，该佐剂含有如seqidno.7所示的氨基酸序列。

本发明第十方面提供上述蛋白质或多肽、分离的多核苷酸、构建体、表达系统在制备预防和/或治疗肺炎链球菌感染药物中的应用。

可选地，所述肺炎链球菌包括但不限于cmcc31109(1型)、d39(2型)、cmcc31436(3型)、tigr4(4型)、cmcc31207(6b型)、cmcc31507(7f型)、cmcc31216(9v型)、cmcc31614(14型)、cmcc31687(18c型)、cmcc31693(19f型)以及cmcc31759(23f型)。肺炎链球菌有90多种血清型，其具体的分类可参考文献“hanagewp.2008.serotype-specificproblemsassociatedwithpneumococcalconjugatevaccination.futuremicrobiol3:23-30.”，上述肺炎链球菌均适用于本发明。也即是说，本发明的具体实施例中仅仅是选取了部分血清型肺炎链球菌进行实验，其他血清型肺炎链球菌也同样适用于本发明，在本发明的保护范围之内。

可选地，所述药物为皮下免疫药物。

本发明第十一方面提供一种抗体，所述抗体能与上述蛋白质或多肽或其同源物、衍生物或片段结合。

可选地，所述抗体为单克隆抗体和/或多克隆抗体。

可选地，所述抗体选自抗zmpb673-863特异性igg，可进一步筛选单抗或多抗。

如上所述，本发明的肺炎链球菌pepo蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用，具有以下有益效果：本发明蛋白(或多肽)及融合蛋白疫苗通过克隆表达肺炎链球菌毒力基因制备。将zmpb673-863及pepo蛋白融合表达及按相应比例进行混合，设置zmpb673-863混合铝佐剂作为阳性对照组。在不同抗原组合实验中，证实pepo和zmpb673-863的混合及融合蛋白疫苗能够显著增强抵抗肺炎链球菌感染，在减少肺炎链球菌定植保护实验中，与其它单一成分蛋白疫苗的效果相比具有统计学意义，且其保护效果不弱于zmpb673-863混合铝佐剂。此外，pepo和zmpb673-863融合蛋白疫苗相较于其他抗原组合能够显著提高机体igg抗体反应，并证实融合蛋白pepo-zmpb673-863能够诱导细胞免疫反应。

附图说明

图1显示为本发明实施例中重组质粒pet28a(+)-zmpb673-863和pet28a(+)-pepo的pcr鉴定及该蛋白的表达纯化。其中a图为pet28a(+)-zmpb673-863鉴定结果；m为dnamarker，泳道1为zmpb673-863核苷酸序列鉴定(570bp),泳道2为pepo核苷酸序列鉴定(1890bp)。b图为pepo的纯化表达(分子量为72kda)以及zmpb673-863的纯化表达(分子量为22kda)。

图2显示为本发明实施例中zmpb673-863蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的识别反应。a图：westernblot结果。b图：elisa结果。

图3显示为本发明实施例中zmpb673-863蛋白抗血清的调理吞噬作用。a图为调理吞噬实验荧光图，b图为吞噬指数，c图为吞噬实验菌载量。

图4显示为本发明实施例中zmpb673-863蛋白抗血清的抗粘附作用。a图为粘附实验荧光图，b图为粘附指数，c图为粘附实验菌载量。

图5显示为本发明实施例中重组质粒pet28a(+)-zmpb673-863-pepo以及pet28a(+)-pepo-zmpb673-863的pcr鉴定及融合蛋白的表达纯化。其中，a图为pet28a(+)-zmpb673-863-pepo以及pet28a(+)-pepo-zmpb673-863鉴定结果，泳道1、2为融合蛋白pepo段核苷酸序列鉴定(1890bp)，泳道3、4为融合蛋白zmpb673-863段核苷酸序列鉴定(570bp)。b图为纯化的两种融合蛋白(分子量都是94kda)。泳道1为pepo-zmpb673-863，泳道2为zmpb673-863-pepo。

图6显示为本发明实施例中融合蛋白的抗原表位鉴定。其中，a图为zmpb673-863与pepo抗血清分别对zmpb673-863-pepo和zmpb673-863-pepo的识别反应。b图为zmpb673-863-pepo和zmpb673-863-pepo抗血清对zmpb673-863与pepo单个蛋白的识别反应。

图7显示为本发明实施例中分析融合蛋白的与tlr2和tlr4受体的结合能力图。其中，a图为免疫荧光检测融合蛋白与tlr2和tlr4受体结合，b图为四种重组蛋白结合巨噬细胞数量的百分比。

图8a显示为本发明实施例中实验分组及免疫流程图。

图8b显示为本发明实施例中pepo作为皮下免疫佐剂对抗体的促进作用。

图8c显示为本发明实施例中pepo作为皮下免疫佐剂对细胞因子的促进作用。

图9显示为本发明实施例中小鼠抗原主动免疫定植保护实验图。左图为19f攻毒后小鼠鼻腔灌洗液菌载量，右图为19f攻毒后小鼠肺部的病理组织切片。

图10显示为本发明实施例中小鼠抗原主动免疫保护实验半数生存时间的统计学分析图，具体为d39腹腔攻毒后小鼠生存率统计图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

基于现有技术存在的缺陷，我们有必要发展一种新的皮下免疫佐剂。以toll样受体激动剂为基础的佐剂是商业疫苗中最先进的一种，它可以同时刺激抗体升高和细胞免疫。最近商业上批准了含有单磷脂a(mpl)的疫苗，mpl就是一种明确的tlr4配体激动剂。肺炎链球菌溶血素(ply)是肺炎链球菌的重要毒力因子，也是tlr4配体的激动剂。减毒ply(△a146ply)同样是一种有效和安全的佐剂。本发明发现，作为一种新发现的毒力蛋白和tlr2、tlr4配体的激动剂——肺炎链球菌肽链内切酶o(pepo)，具有促炎作用，能够增强巨噬细胞吞噬功能，其生物特性表明这是一个具有佐剂潜质的肺炎链球菌毒力蛋白。

因此有必要发展新的免疫佐剂。以toll样受体激动剂为基础的佐剂是商业疫苗中最先进的一种，它可以同时刺激抗体升高和细胞免疫。最近商业上批准了含有单磷脂a(mpl)的疫苗，mpl就是一种明确的tlr4配体激动剂。肺炎链球菌溶血素(ply)是肺炎链球菌的重要毒力因子，也是tlr4配体的激动剂。减毒ply(δa146ply)同样是一种有效和安全的佐剂。作为一种新发现的毒力蛋白和tlr2、tlr4配体的激动剂——肺炎链球菌肽链内切酶o(pepo)，具有促炎作用，能够增强巨噬细胞吞噬功能，其生物特性表明这是一个具有佐剂潜质的肺炎链球菌毒力蛋白。

锌金属蛋白酶b(zmpb)是肺炎链球菌基因组序列中四种同源锌金属蛋白酶之一，同时也是一种毒力因子。肺炎球菌感染的zmpb突变体感染的小鼠死亡率、鼻腔定植以及肺组织中的tnf-α明显降低。以往的研究显示抗重组蛋白zmpb364-654的igg存在于健康成人血清中，抗原片段与人抗体反应的比例为77％。此外儿科侵袭性肺炎链球菌患者中发现zmpb431-450具有b细胞免疫显性表位。然而zmpb这段肽段的在肺炎链球菌中保守性并不高，我们发现zmpb673-863的保守性较zmpb364-654更高，且与人血清具有高反应性，提示其可能是一段有保护效应的肺炎链球菌多肽疫苗。

本发明公开了肺炎链球菌肽链内切酶o(pepo)作为皮下免疫佐剂的应用，以及锌金属蛋白酶b(zmpb)n端的第673位至第863位氨基酸作为肺炎链球菌蛋白疫苗的应用，其基因包括核苷酸序列为seqidno.1的pepo和seqidno.2的zmpb673-863。本发明肺炎链球菌肽链内切酶o(pepo)可以为皮下免疫佐剂，与锌金属蛋白酶b(zmpb)第673位至第863位氨基酸肽段的混合及融合表达，制备的肺炎链球菌蛋白质疫苗对抵抗肺炎链球菌感染都具有良好的保护效果。

本发明显示，al与zmpb673-863混合免疫小鼠，能诱导高效价的抗zmpb673-863抗体，该抗体能与11种血清型肺炎链球菌发生反应，能增强巨噬细胞吞噬肺炎链球菌的能力，且能抑制肺炎链球菌对肺上皮细胞a549的粘附。同时al与zmpb673-863免疫后的小鼠，其鼻咽部和肺部的肺炎链球菌定植较单独zmpb673-863免疫组显著减少，在致死性肺炎链球菌感染后的生存率也显著上升，提示zmpb673-863是一段保守性高具有良好免疫保护作用的肺炎链球菌疫苗多肽。pepo蛋白与zmpb673-863混合或融合表达后免疫小鼠，均能诱导高效价的抗zmpb673-863抗体产生，其免疫后小鼠的鼻咽部和肺部定植细菌及致死性感染后的生存率均与al佐剂zmpb673-863混合免疫组相当，提示pepo具有良好的皮下免疫佐剂效应，当然，pepo作为佐剂时，所用的疫苗不限于含有zmpb673-863、zmpb673-863-pepo及pepo-zmpb673-863，例如，也可以是pepo和dnaj的融合或混合蛋白，或pepo和phtd的融合或混合蛋白等疫苗配方。

以下实施例中，采用的al佐剂购自sigma公司(adjuplex^tmvaccineadjuvant)。

以下实施例中，肺炎链球菌感染预防用的融合蛋白质疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)用引物修饰法分别从s.pn基因组中扩增zmpb673-863及pepo基因片段；

(2)分别构建含有pepo、zmpb673-863、zmpb673-863-pepo及pepo-zmpb673-863基因的pet28a(+)重组质粒；

(3)将重组质粒分别转化到bl21(de3)工程菌中，iptg诱导可高效表达pepo、zmpb673-863、zmpb673-863-pepo及pepo-zmpb673-863蛋白，获得表达目的蛋白的工程菌bl21-pet28a(+)-pepo、bl21-pet28a(+)-zmpb673-863、bl21-pet28a(+)-zmpb673-863-pepo和bl21-pet28a(+)-pepo-zmpb673-863；

(4)分离纯化pepo、zmpb673-863、zmpb673-863-pepo及pepo-zmpb673-863目的蛋白；

(5)将pepo及zmpb673-863两种蛋白抗原按融合蛋白中的分子比例制成特定的蛋白混合物。

实施例1

重组表达质粒pet28a(+)-pepo、pet28a(+)-zmpb673-863、pet28a(+)-zmpb673-863-pepo和pet28a(+)-pepo-zmpb673-863表达载体的构建。

(一)材料：

质粒pet28a(+)购自novagen公司，pcr使用的primestar高保真酶、dntps、buffer、mgcl2购自宝生物工程(大连)有限公司，ptc－200pcr仪为perkinelmer产品，荧光定量pcr仪rg－3000购自corbettresearch公司。

(二)引物的设计合成：

以肺炎链球菌d39基因组dna为模板，参照其全序列(genebank编号cp000410.2)，使用premier5.0设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

zmpb673-863:上游引物：5’-gccatggttgaagaagttgttgtt-3’，含ncoi位点；

下游引物：5’-ccctcgagatctccaagactgttaat-3’，含xhoi位点；

pepo:上游引物：5’-gccatggcacgttatcaagatgatttttat-3’，含ncoi位点；

下游引物：5’-ccctcgagccaaataatcacgcgctcctct-3’，含xhoi位点；

zmpb673-863-pepo与pepo-zmpb673-863引物：两个蛋白连接的方式不一样，前者是

zmpb673-863的c端与pepo的n端相连，后者是pepo的c端与zmpb673-863的n端相连。

zmpb673-863-pepo：f/r-zmpb673-863-n,f/r-pepo-c；

pepo-zmpb673-863：f/r-zmpb673-863-c,f/r-pepo-n。

表1

(三)pcr扩增目的基因：

zmpb673-863基因的扩增，扩增的zmpb673-863基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

扩增体系(zmpb-n)：

ddh2o30.5μl；

5×buffer(mg²⁺)10.0μl；

dntp(10mm)4μl；

p1(5pm)2μl；

p2(5pm)2μl；

dna模板1μl；

primestar0.5μl。

其中，“p1(5pm)2μl”是指：取浓度为5pm的引物f-zmpb673-863–n，加入量为2μl。

“p2(5pm)2μl”是指：取浓度为5pm的引物r-zmpb673-863–n，加入量为2μl。

条件：98℃1min、55℃45s、72℃90s、30cycle；72℃10min，1次。利用上述条件，扩增得到相应目的基因。

采取以上相同的扩增体系扩增zmpb-c，所用引物为f-zmpb673-863–c和r-zmpb673-863–c，反应条件不变。利用上述条件，扩增得到相应目的基因。

扩增的pepo基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

扩增体系(pepo-n)：

ddh2o30.5μl；

5×buffer(mg²⁺)10.0μl；

dntp(10mm)4μl；

p1(5pm)2μl；

p2(5pm)2μl；

dna模板1μl；

primestar0.5μl。

其中，“p1(5pm)2μl”是指：取浓度为5pm的引物f-pepo–n，加入量为2μl。

“p2(5pm)2μl”是指：取浓度为5pm的引物r-pepo–n，加入量为2μl。

条件：98℃1min、56℃2.5min、72℃90s、30cycle；72℃10min,1次。利用上述条件，扩增出了相应目的基因。

采取以上相同的扩增体系扩增pepo-c，所用引物为f-pepo–c和r-pepo–c。反应条件不变。利用上述条件，扩增得到相应目的基因。

(四)原核表达载体的构建

pcr产物回收按roche公司(即罗氏公司)提供的试剂盒说明进行，质粒pet28a(+)按omega小量质粒dna抽提试剂盒说明进行，然后对载体dna和外源dna进行双酶切及回收，最后连接回收产物，连接反应体系如下表2所示(zmpb673-863-n/-c即zmpb673-863在融合蛋白的n/c端对应的核苷酸序列，pepo-n/-c即pepo在融合蛋白的n/c端对应的核苷酸序列)：

表2连接反应体系1

反应条件：置0.2mlep管中，低速瞬时离心，置22℃连接1h。

将连接产物转化至大肠杆菌e.colidh5α感受态细胞：

取e.colidh5α菌划线接种lb平板；

37℃孵育过夜(12-14h)；

挑取单菌落，接种于3mllb中；

37℃200rpm过夜(12-14h)，取100μl加入2mllb37℃，300rpm3h；

取1.5ml菌液加入冰预冷ep管中，冰浴10min后4000rpm、5min收集菌体；

加入预冷的0.1mmcacl2150μl，重悬后9000rpm、2min收集菌体；

再加入预冷的0.1mmcacl2150μl，重悬；

加入10μl连接反应产物，混匀后，冰水浴30min；

42℃热击30s，冰水浴2min；

加入800μllb培养基，37℃，100rpm1h复苏；

取200μl菌液涂布于lk平板；

37℃孵育，13h；

挑取单菌落进行增菌鉴定。

在连接反应体系1连接反应完成且鉴定正确后，获得pet28a(+)-zmpb673-863-n和pet28a(+)-zmpb673-863-c质粒，将获得质粒以及pepo-c和pepo-n双酶切后用于连接反应体系2，反应体系2如下表3所示。

表3连接反应体系2

反应条件同连接反应体系1。

(五)pet28a(+)-pepo、pet28a(+)-zmpb673-863、pet28a(+)-zmpb673-863-pepo和pet28a(+)-pepo-zmpb673-863重组子的筛选及鉴定

挑取10个卡纳霉素抗性菌落，分别置2mllk(含50ug/mlkana的lb)培养基中，180rpm3h增菌，菌液pcr鉴定；选取3个可疑阳性菌落增菌，送往北京擎科新业生物技术有限公司作双向测序。

结果见附图1a和附图5a，均获得单一的pcr条带；pcr产物测序结果与预期序列比对完全吻合。

其中pepo的核苷酸序列如seqidno.1所示。

zmpb673-863的核苷酸序列如seqidno.2所示。

zmpb673-863-pepo的核苷酸序列如seqidno.3所示。

pepo-zmpb673-863的核苷酸序列如seqidno.4所示。

以上结果证实目的基因片段正确插入表达载体中。

实施例2

原核表达质粒pet28a(+)-pepo、pet28a(+)-zmpb673-863、pet28a(+)-zmpb673-863-pepo和pet28a(+)-pepo-zmpb673-863在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化。

(一)重组质粒pet28a(+)-pepo、pet28a(+)-zmpb673-863、pet28a(+)-zmpb673-863-pepo和pet28a(+)-pepo-zmpb673-863转化至宿主菌bl21(de3)中。

(二)iptg诱导pepo、zmpb673-863、zmpb673-863-pepo(融合蛋白)及pepo-zmpb673-863(融合蛋白)的大量表达。

(三)重组蛋白的纯化：超声破菌后，取细菌破碎液上清用于纯化；4℃，10000rpm×10min，上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。

亲合层析纯化：吸取2ml50％的ni²⁺-nta树脂混悬液于层析柱内，以20ml超声破碎缓冲液平衡；吸出平衡后的ni²⁺-nta树脂混悬液，与上述滤液充分混匀，冰浴1h，其间每间隔5min轻轻混匀一次；将悬液转入层析柱内，让液体自然流出，平衡柱床；不同咪唑浓度进行梯度洗脱，分别收集洗脱液。

(四)pbs超滤除去咪唑。

(五)重组蛋白的定量(bradford检测法)

⑴吸取20mg/ml的标准品牛血清白蛋白溶液6μl，以0.15mmo1/lnacl稀释40倍至0.5mg/ml，分别在两组各4支试管中加入10μl、20μl、30μl、40μlbsa溶液，然后以0.15mmol/lnacl将总体积定容为200μl，同时取一支试管仅加200μl0.15mmol/lnacl作为调零用；

⑵取纯化产物20μl，也以0.15mmol/lnacl补足至总体积200μl；

⑶每管加入考马斯亮蓝g-250染液2ml，振荡混匀后室温静置30min；

⑷于-series600全波长分光光度计中读取a590值，由仪器自动绘制标准曲线及计算样品蛋白含量。

结果显示(如图1b、图5b所示)：经sds-page和图像分析表明，四种重组蛋白纯度可达90％以上，经bradford法测得纯化透析后蛋白浓度如下：pepo为5.5mg/ml，zmpb673-863为3.6mg/ml，zmpb673-863-pepo为2.1mg/ml，pepo-zmpb673-863为3.25mg/ml。

本发明中蛋白的质量控制及使用方法为：

1.纯度分析：sds-page鉴定，纯度为90％以上。

2.鉴别实验：融合蛋白可以被zmpb673-863及pepo的抗血清识别，并且其抗血清可以识别zmpb673-863及pepo重组蛋白(如图6所示)。并且融合蛋白能够与巨噬细胞表面的tlr2和tlr4受体结合(如图7所示)。

3.溶血活性：与野生肺炎球菌溶血素相比，本突变体失去溶血活性，且融合蛋白也同样没有溶血活性。

4.内毒素测定：参照《中国药典》(2015年6月5日由中国医药科技出版社出版)，终点显色细菌内毒素检查法。各蛋白内毒素含量低于0.1eu/μg。

实施例3

westernblot检测zmpb673-863蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的识别反应。

(一)肺炎链球菌cmcc31109(1型)、d39(2型)、cmcc31436(3型)、tigr4(4型)、cmcc31207(6b型)、cmcc31507(7f型)、cmcc31216(9v型)、cmcc31614(14型)、cmcc31687(18c型)、cmcc31693(19f型)以及cmcc31759(23f型)。共11种不同血清型的细菌分别接种于30mlc+y培养基中，37℃，5％co2培养至细菌处于对数生长期od600＝0.4-0.6，收集细菌，12000g离心5min，用无菌pbs洗2次，菌体沉淀用100μlpbs重悬，按比例加入5×loadingbuffer，沸水中煮30min，12000g离心5min，取上清液用于westernblot分析上样。

(二)page电泳：每孔蛋白上样量为2μg，8％的分离胶+5％的浓缩胶，80v，30分钟，然后120v，90分钟；

(三)湿转法转膜：恒流210ma，180分钟；

(四)封闭：5％脱脂奶粉，37℃封闭1h；

(五)一抗孵育：用5％脱脂奶粉将zmpb673-863蛋白抗血清以1:1000稀释，4℃过夜；

(六)洗膜：用0.05％的tbst缓冲液洗四次，15min/次；

(七)二抗孵育：用5％脱脂奶粉将hrp标记的羊抗鼠igg二抗1:5000稀释，在蜡板上37℃孵育1h；

(八)洗膜：用0.05％的tbst缓冲液洗四次，15min/次；

(九)显色：在pvdf膜上加入现配的ecl反应液，在化学发光成像仪上扫描分析结果。结果如图2a所示。该结果显示zmpb673-863蛋白抗血清能够识别临床上常见11种肺炎链球菌的菌体蛋白。

实施例4

elisa检测zmpb673-863蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的识别反应。

(二)包被抗原：制备抗原包被液。称取na2co30.17g、nahco30.286g溶于100ml灭菌水中，调ph至9.6；抗原包被96孔板：将收集的菌液(od＝0.5)，用抗原包被液稀释至od＝0.1，100μl/孔加入96孔板，4℃过夜。

(三)封闭

配制0.1％pbst：小心吸取100μl吐温20加入100mlpbs缓冲液中，混匀备用；

配制封闭液2％bsa：称取2gbsa溶于100ml0.1％的pbst溶液中，混匀后4℃保存备用；洗板3次后，封闭液按200μl/孔加入96孔板，37℃封闭2h；洗板3次。

(四)加一抗：zmpb673-863蛋白抗血清在已包被的板上用2％bsa溶液进行连续倍比稀释，1:1000、1:2000、……、1:1024000(即从1:1000按连续倍比稀释至1:1024000)，100μl/孔，最后一孔为阴性对照(只加入100μl的2％bsa)；37℃孵箱孵育1h；洗板6次。

(五)加二抗：用2％bsa溶液将羊抗鼠二抗1:5000(igg1:5000稀释)后；100μl/孔加样，37℃孵箱孵育45min；洗板6次。

(六)显色：分别加入显色液a、b各50ul，37℃孵箱孵育15min。

(七)终止反应、比色：加终止液100ul/孔，450nm测定吸光度值。

(八)根据测定结果(界值＝空白均值x2.1，大于此值即为阳性)。zmpb673-863蛋白抗血清对肺炎链球菌菌体蛋白的结合滴度如图2b所示。该结果显示，zmpb673-863蛋白抗血清能够识别临床上常见11种肺炎链球菌表面的菌体蛋白，且结合能力明显大于正常血清(来自野生未处理小鼠)。

实施例5

zmpb673-863蛋白抗血清的调理吞噬作用。

(一)荧光吞噬实验

(1)小鼠腹腔巨噬细胞提取：1000μl无菌石蜡油腹腔注射小鼠诱导腹腔巨噬细胞，3～5d后，采用15ml无菌pbs分两次灌洗小鼠腹腔，1000r/min离心后轻轻吸走上层石蜡油，弃上清，含双抗的dmem培养基洗涤细胞两次；红细胞裂解液裂解其中红细胞2～3min，离心弃上清后dmem完全培养(10％fbs，100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素)重悬细胞，显微镜下计数细胞后铺板(5×10⁴cell/孔)。37℃，5％co2培养，1h后弃上清，pbs洗涤2遍，更换新鲜dmem完全培养基。37℃，5％co2培养6h。

(2)将制备得到的rzmpb673-863抗血清及阴性对照抗血清56℃、水浴30min灭活补体，pbs将抗血清稀释4倍。

(3)肺炎链球菌d39/tigr4/7f在哥伦比亚血平板上37℃生长过夜，无菌pbs洗涤3次，使用fitc溶剂配置fitc4mg/ml，重悬细菌至5×10⁶cfu/50μl，室温避光孵育30分钟。12000rpm离心1分钟，pbs洗涤4次，pbs重悬细菌至5×10⁶cfu/50μl。56℃水浴箱灭活30min。

(4)将rzmpb673-863抗血清及阴性对照抗血清各50μl分别同fitc标记的肺炎链球菌d39/tigr4/7f50μl，37℃，避光孵育30min。培养的巨噬细胞弃上清，无菌pbs洗涤3次后加入200μl培养基，设置实验组、阴性对照组和空白对照组，分别加入rzmpb673-863抗血清和阴性对照抗血清孵育过的肺炎链球菌d39/tigr4/7f、pbs100μl，37℃，100rpm，孵育60min。

(5)将细胞板取出，使用预热pbs洗涤细胞5次。500μl4％多聚甲醛固定10min，pbs洗涤3次，dapi染细胞核5-10min，pbs洗涤3次，封片。荧光显微镜下激发荧光。典型的荧光图如图3a所示，吞噬指数的结果如图3b所示。结果显示，相较于空白对照(pbs组)和正常血清，zmpb673-863蛋白抗血清能显著提高巨噬细胞对于肺炎链球菌血清型d39/tigr4/7f的吞噬能力。

(二)吞噬实验菌载量测定。

(1)同上述条件一致提取巨噬细胞后，将细胞均匀铺于24孔板细胞爬片上(5×10⁴cell/孔)。37℃，5％co2培养，1h后弃上清，pbs洗涤2遍，更换新鲜dmem完全培养基。37℃，5％co2培养6h。

(2)将制备得到的rzmpb673-863抗血清及阴性对照抗血清56℃，水浴30min灭活补体，pbs将抗血清稀释4倍。

(3)肺炎链球菌d39/tigr4/7f在哥伦比亚血平板上37℃生长过夜，无菌pbs洗涤3次，重悬细菌至5×10⁶cfu/50ul。

(4)将rzmpb673-863抗血清及阴性对照抗血清各50μl分别同50μl菌液于37℃孵育30min。培养的巨噬细胞弃上清，无菌pbs洗涤3次后加入200μl培养基，设置实验组、阴性对照组和空白对照组，分别加入rzmpb673-863抗血清和阴性对照抗血清孵育过的肺炎链球菌d39/tigr4/7f、pbs100μl，37℃，100rpm，孵育60min。

(5)将细胞板取出，使用预热pbs洗涤细胞5次，200μl/每孔加入青霉素(10μg/ml)和庆大霉素(200μg/ml)杀胞外细菌15min，弃上清，pbs洗涤5次。加入100μl无菌双蒸水裂解巨噬细胞10-15分钟至细胞裂解完全。

(6)细菌梯度稀释铺板于哥伦比亚血平板，37℃，5％co2孵育过夜，计数菌落数并进行统计分析。吞噬实验菌载量(cfu)结果如图3c所示。结果显示，相较与空白对照(pbs组)和正常血清，zmpb673-863蛋白抗血清能显著提高巨噬细胞对于肺炎链球菌血清型d39/tigr4/7f的吞噬能力。

实施例6

zmpb673-863蛋白抗血清的抗粘附作用：

(一)荧光粘附实验

步骤同“实施例5(一)荧光吞噬实验”。粘附实验中选用粘附性较强的肺炎链球菌菌株atccbaa-255(r6型)和19f。典型的荧光图如图4a所示，吞噬指数的结果如图4b所示。结果显示，相较于空白对照(pbs组)和正常血清，zmpb673-863蛋白抗血清能降低肺炎链球菌血清型19f/r6对a549细胞的粘附能力。

(二)吞噬实验菌载量测定

步骤同“实施例5(二)吞噬实验菌载量测定”，除去步骤(5)中“200μl/每孔加入青霉素(10ug/ml)和庆大霉素(200ug/ml)杀胞外细菌15min”。粘附实验中选用粘附性较强的肺炎链球菌菌株atccbaa-255(r6型)和19f。粘附实验菌载量(cfu)结果如图4c所示。结果显示，相较于空白对照(pbs组)和正常血清，zmpb673-863蛋白抗血清能降低肺炎链球菌血清型19f/r6对a549细胞的粘附能力。

实施例7

pepo作为皮下免疫佐剂的效果评价：

(一)将c57小鼠随机分为8组，分为佐剂组(共1组，为单独al佐剂组)、单一蛋白免疫组(共2组，分别为zmpb673-863组和pepo组)、两两混合免疫组(共2组，分别为zmpb673-863+pepo组和zmpb673-863+bsa组)和融合蛋白免疫组(2组，分别为zmpb673-863-pepo组和pepo-zmpb673-863组)以及al佐剂的阳性对照组(1组，为al+zmpb673-863组)。

(二)首次免疫时，用无菌pbs调整重组蛋白浓度，保证各蛋白组之间摩尔浓度相等。经皮下免疫实验组小鼠，每只100μl，含11μgzmpb673-863单独或增加37μgpepo/al佐剂/33μgbsa，融合蛋白为47μg。

(三)首次免疫2周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上。

(四)首次免疫4周后，第三次免疫，方法及剂量不变。

(五)末次免疫后2周，取小鼠血液进行抗体效价分析。

结果如图8a、图8b所示：与zmpb673-863单独免疫组相比，pepo-zmpb673-863组和zmpb673-863-pepo组血清中抗zmpb673-863特异性igg水平显著升高。说明pepo作为一种新的皮下佐剂，在融合状态，可以显著提高皮下免疫抗体的产生。在混合状态下pepo+zmpb673-863相较zmpb673-863单独免疫组血清中抗zmpb673-863特异性igg水平也有显著升高，但效果明显弱于融合蛋白。

pepo作为皮下免疫佐剂对相关细胞因子的作用：

(一)将c57小鼠随机分为8组，分为佐剂组(共1组，为单独al佐剂组)、单一蛋白免疫组(共2组，为zmpb673-863组和pepo组)、两两混合免疫组(共2组，分别为zmpb673-863+pepo组和zmpb673-863+胎牛血清白蛋白(bsa)组)、融合蛋白免疫组(2组，分别为zmpb673-863-pepo组和pepo-zmpb673-863组)以及al佐剂的阳性对照组(1组，为al+zmpb673-863组)。

(二)首次免疫时，用无菌pbs调整重组蛋白浓度，保证各蛋白组之间摩尔浓度相等。经皮下免疫实验组小鼠，每只100μl，含11ugzmpb673-863单独或增加37μgpepo/al佐剂/33μgbsa，融合蛋白为47μg。

(三)首次免疫2周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上。

(四)首次免疫4周后，第三次免疫，方法及剂量不变。

(五)末次免疫后2周，对al、pepo、zmpb673-863、zmpb673-863+bsa、zmpb673-863+pepo、zmpb673-863-pepo、pepo–zmpb673-863及al+zmpb673-863组小鼠取脾，每组3只，无菌不锈钢筛网分离脾细胞，以rpmi1640培养基洗涤两次后，重悬于含10％fbs的rpmi1640培养基中调整浓度为5×10⁶细胞/ml。调整好的细胞悬液培养于24孔板，每孔1ml，以5μgrzmpb673-863蛋白刺激，分别在5％co2、37℃环境中孵育12h、24h、48h、72h及96h，吸取上清-70℃冻存备用。以pbs为空白对照，刀豆蛋白a(concanavalina,cona)为阳性对照，按相同条件刺激脾细胞，收集上清-70℃冻存备用。

(六)采用biolegend细胞因子检测试剂盒，对收集的细胞上清进行检测。

结果如图8c所示：与zmpb673-863单独免疫组相比，pepo-zmpb673-863组脾细胞培养上清中il-17a、il-4、il-10以及ifn-γ水平均显著升高。说明pepo作为一种新的皮下佐剂，当c端融合蛋白时可显著刺激th17型免疫反应以及th1型免疫反应。

融合蛋白疫苗对肺炎链球菌定植的保护实验：

(一)将c57小鼠随机分为7组，其中6组小鼠分别用作免疫组，分为单一蛋白免疫组(共2组，分别为zmpb673-863组、pepo组)、两两混合免疫组(共2组，分别为zmpb+胎牛血清白蛋白(bsa)和zmpb673-863+pepo组)、融合蛋白免疫组(2组，为zmpb673-863-pepo组和pepo–zmpb673-863组)以及al佐剂的阳性对照组(1组，为al+zmpb673-863组)，另一组为pbs对照组。

(二)首次免疫时，用无菌pbs调整重组蛋白浓度，保证各蛋白组之间摩尔浓度相等。经皮下免疫实验组小鼠，每只100μl，含11μgzmpb673-863单独或增加37ugpepo/al佐剂/33ugbsa，融合蛋白为47μg。

(三)首次免疫2周后，进行第二次免疫，方法及剂量同上。

(四)首次免疫4周后，第三次免疫，方法及剂量不变。

(五)末次免疫后两周进行鼻腔攻毒实验，选择定植能力强的菌株：19f，攻毒剂量均为1x10⁸cfu滴鼻攻毒，3天后，取小鼠鼻腔灌洗液，连续稀释后进行铺板计数。并取肺组织做病理切片。

结果如图9所示：与zmpb673-863单独免疫组相比，融合蛋白组可以显著降低19f菌株在鼻咽部的定植，与阳性对照组无明显差异。而且，无论是融合还是混合组，均可显著减少肺炎链球菌对肺部的侵袭，有效的减轻肺损伤。

融合蛋白疫苗的主动保护实验。

小鼠末次免疫两周后进行腹腔攻毒实验，我们选择的攻毒菌株为d39。选用600cfu的d39腹腔攻毒。连续21天内观察小鼠的生存状态，计算小鼠的生存率。

结果如图10所示：无论融合蛋白组或混合蛋白组小鼠，半数生存时间显著高于zmpb673-863单独免疫组，同阳性对照组zmpb673-863+al无统计学差别。

从以上的实验结果可以发现：本发明成功制备出一种新型的皮下佐剂pepo并对其佐剂效果进行评价，成功地以此为佐剂制备了肺炎链球菌的融合蛋白疫苗zmpb673-863-pepo和pepo-zmpb673-863，通过定植及主动免疫保护试验证明了融合蛋白疫苗可以显著提高保护效果。本发明成功地开发了新型皮下佐剂pepo及肺炎链球菌融合蛋白疫苗zmpb673-863-pepo和pepo-zmpb673-863，该疫苗成分单一、保护效果好、易大规模生产、可推广使用。

综上所述，本发明显示肺炎链球菌溶血素突变体(pepo)具有皮下免疫佐剂效应，可用于增强蛋白疫苗的免疫效应。融合锌金属蛋白酶b(zmpb)n端的第673位至第863位氨基酸可用于制备肺炎链球菌蛋白疫苗，可有效抵抗肺炎链球菌感染。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

sequencelisting

<110>重庆医科大学

<120>肺炎链球菌蛋白在抗肺炎链球菌感染中的应用

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