一种玉米须多糖的脱色工艺的制作方法

本发明涉及保健食品化学领域，特别是采用棉状deae纤维素对玉米须多糖的一种脱色工艺。

背景技术：

玉米须主产东北地区，含有很多对人体有益的成分，包括：挥发性生物碱、黄酮、皂苷、甾醇、多糖等，其中玉米须多糖具有抗氧化，抗疲劳，增强机体免疫力，抑制肿瘤细胞增值等功效。但是在提取玉米须粗多糖时，色素也很容易被提取出来，较深的颜色不仅干扰多糖的纯度，还影响多糖的定性定量、分离纯化及活性方面的研究，所以需要对多糖进行脱色处理。在玉米须多糖的提取、分离纯化过程中，多糖的脱色是一个重要环节。经查阅相关文献后，目前国内外对多糖脱色的报道较多，但由于多糖来源不同，脱色方法也不尽相同，有活性炭吸附法，大孔树脂法，过氧化氢脱色法。彭雅玲等比较了6种树脂对紫果西番莲果胶多糖脱色的效果，确定了聚酰胺树脂脱色效率最佳，最佳条件为：进样量3.5bv，流速3bv/h，ph3.5，脱色率为52.78%，半乳糖醛酸保留率为85.62%，结果表明聚酰胺发对多糖的脱色效果较好。但是脱色操作复杂，处理困难，多糖损失率大。周鸿立等人采用活性炭探究了玉米须多糖的脱色工艺，活性炭用量为2%，脱色时间为80min，加热温度为60℃，脱色率是14.76%，损失率是13.01%，活性炭吸附法具有安全、无毒、不会破坏多糖的理化性质等特点，但脱色率低。宫春宇等人采用d301r树脂探究了玉米须多糖吸附法的脱色工艺，多糖浓度2mg/ml、脱色时间40min、树脂添加量7g(湿重，0.35g/ml)、脱色温度40℃，实际脱色率为79.6%，结果表明大孔树脂具有良好的脱色效果，但多糖浓度增大后，脱色效果就会变得很不理想。然后宫春宇等人采用响应面优化了过氧化氢对玉米须多糖脱色的工艺，过氧化氢添加量0.15∶1（v∶v），ph为12，脱色3h，脱色温度40℃。采用此工艺，在多糖浓度10mg/ml时，玉米须多糖实际脱色率达69.3%，多糖保留率60.1%。结果显示过氧化氢具有良好的玉米须脱色作用，但过氧化氢反应条件剧烈，会破坏多糖，且在脱色过程中，由于过氧化氢会产生大量气泡，因此采用此法时，对设备和操作的要求高于吸附脱色法。赵文竹等人采用反胶束溶液脱色法去除玉米须多糖中的色素类物质，脱色率达到91.43%，多糖回收率达到77.59%，测定了纯化后玉米须多糖的单糖组成为甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和果糖五种单糖。孙晓雪等人探究了deae纤维素纯化玉米须总多糖的工艺，最佳纯化工艺为上样量0.75bv，分别用10bv水和15bv的0.1mol/lnacl溶液洗脱，可较充分地将中性总多糖和酸性总多糖洗脱下来；中性多糖和酸性多糖分别占总多糖的30.43%和58.88%，纯度分别提高了约2.5和2倍，该方法效果纯化效果较好，但deae-52价格昂贵，不适合玉米须多糖的大批量纯化。而且多糖常以酸性杂多糖糖醛酸的形式存在，糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖和多糖，显示出十分重要的生物活性，所以在多糖纯化过程中，应尽量提高糖醛酸的保留率。为解决这一难题，本工艺采用棉状deae纤维素对玉米须多糖进行脱色，响应面分析法优化。棉状deae纤维素是阴离子交换树脂，更有利于糖醛酸的保留，且比较廉价，可再生，纯化效果比较好，适合多糖的纯化。

技术实现要素：

本发明提供一种棉状deae纤维素对玉米须粗多糖的脱色工艺。

本发明的目的在于：提供一种采用棉状deae纤维素对玉米须粗多糖的脱色方法，该方法便捷，无污染，价格低廉，可重复利用，脱色效果良好，多糖保留率高，提高了玉米须粗多糖的纯化效率，可以用于工业化生产。

本文采用棉状deae纤维素对玉米须多糖进行脱色，并以脱色率和多糖保留率为响应值，采用响应面分析法优化脱色工艺的最佳参数。为玉米须多糖的纯化提供了高效便捷的纯化方法。

一种如权利要求1所述采用棉状deae纤维素对玉米须多糖脱色的工艺，其特征在于按如下步骤进行：

（1）玉米须粗多糖的制备：取干燥玉米须30g按照1：30液料比90℃提取1h，重复两次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/10，加入95%乙醇至80%，4℃下静止12h，离心，沉淀部分用丙酮洗涤，冷冻干燥，得粗多糖粉末，玉米须粗多糖中多糖含量为18.82%（g/g）。

（2）棉状deae纤维素的预处理：称取一定量的deae纤维素，用充足的蒸馏水浸泡24h，然后用0.5mol/l的naoh浸泡3h，抽滤，用蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/lhcl浸泡3h，洗至中性，抽干备用。

（3）先通过单因素试验找出脱色的单因素最优条件，如洗脱液体积，洗脱速度，棉状deae纤维素用量。

（4）在单因素实验的基础上，以料液比、提取时间、ph值为影响因素，各取3个水平，采用中心组合实验box－behnken设计三因素三水平的响应面分析实验对脱色工艺进行优化，得最优工艺，即洗脱液体积为100~110ml，洗脱速度为2.5~3.5ml/min，棉状deae纤维素用量为6.5~7.5g。

（5）对响应面得到的最优工艺进行验证，此工艺脱色率达到85%~91%，多糖保留率达到90%~93.61%，多糖纯度达到70%~76%。

附图说明

图1是洗脱液体积对玉米须多糖脱色效果的影响；图2是洗脱速度对玉米须多糖脱色效果的影响；图3是deae用量对玉米须多糖脱色的影响。

具体实施方式

以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。

实施方案一玉米须粗多糖的制备

取干燥玉米须30g按照1：30液料比90℃提取1h，重复两次，合并滤液，浓缩至滤液体积的1/10，加入95%乙醇至80%，4℃下静止12h，离心，沉淀部分用丙酮洗涤，冷冻干燥，得粗多糖粉末2.232g，多糖纯度为18.82%。

实施方案二脱色率及多糖保留率的测定及计算

对玉米须进行脱色纯化后，在420nm处测定脱色前后多糖溶液的吸光度，计算脱色率。采用苯酚-硫酸法在490nm处测定脱色前后的多糖含量，计算多糖保留率。采用间羟基联苯法在528nm处测定脱色前后多糖中糖醛酸的含量，计算糖醛酸保留率。

脱色率（%）=（a脱色前-a脱色后）/a脱色后×100%

多糖保留率（%）=m脱色后多糖/m脱色前多糖×100%

糖醛酸保留率（%）=m脱色后糖醛酸/m脱色前糖醛酸×100%

实施方案三ab-8大孔树脂对玉米须多糖脱色

ab-8大孔树脂预处理：用95%的乙醇浸泡24h，使其充分溶胀和初步除杂后湿法装柱，用95%乙醇流动清洗，不时检查，至流出液与水混合（1:5）无白色浑浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇味。

树脂体积为50ml，配制2mg/ml的玉米须多糖溶液，上样体积为50ml流速为2~3bv/h。

ab-8大孔树脂对玉米须多糖进行脱色，其脱色率为76.92%±2.34%，多糖保留率为52.2%±1.89%，糖醛酸保留率为41.89%±1.45%

实施方案四棉状deae纤维素的处理

称取一定量的deae纤维素，用充足的蒸馏水浸泡24h，然后用0.5mol/l的naoh浸泡3h，抽滤，用蒸馏水洗至中性，再用0.5mol/lhcl浸泡3h，洗至中性，抽干备用。

实施方案五确定脱色工艺最佳单因素条件

为了探究玉米须多糖多色工艺的最佳单因素条件，选取洗脱液体积，洗脱速度，棉状deae纤维素用量三个因素为影响因素，以多糖脱色率和多糖保留率为响应值，找出单因素的最佳水平。

（1）洗脱液体积对玉米须多糖脱色效果的影响

取上述粗多糖100mg，加入10ml蒸馏水，待全部溶解后上棉状deae纤维素层析柱，控制洗脱速度为2ml/min，棉状deae质量为7g，考察洗脱液体积（60ml，80ml，100ml，120ml，140ml）对多糖纯化的影响。

由说明书附图图1可知，在洗脱液体积为100ml时多糖脱色率达到最大值，多糖保留率都是逐渐增大的，但100ml时增加幅度最大，随着体积增加保留率并没有太大的效果，随着洗脱液体积增加，多糖保留率逐渐减小，所以洗脱液体积选择100ml时脱色效果最好，多糖保留率也较高。

（2）洗脱速度对玉米须多糖脱色效果的影响

取上述粗多糖100mg，加入10ml蒸馏水，待全部溶解后上棉状deae纤维素层析柱，控制洗脱液体积为100ml，棉状deae质量为7g，考察流速（1ml/min，2ml/min，3ml/min，4ml/min，5ml/min）对多糖纯度的影响。

说明书附图图2可知，随着洗脱速度提高，多糖保留率和脱色率均有明显的变化，且大体趋势是相同的，在洗脱速度为3ml/min时，脱色率和多糖保留率达到最大值，所以选择3ml/min为最佳流速。

（3）deae用量对玉米须多糖脱色的影响

取上述粗多糖100mg，加入10ml蒸馏水，待全部溶解后上棉状deae纤维素层析柱，控制洗脱速度为2ml/min，洗脱液体积100ml，考察棉状deae的用量（3g，5g，7g，9g，11g，13g）对多糖纯化效果的影响。

由说明书附图图3可知，随着deae质量的增加，脱色率一直在提高，而多糖保留率在deae质量为7g时多糖保留率增加之后又降低了，为了减少多糖损失，又可以有较好的脱色效果，选择7g为最佳deae质量。

由单因素实验结果可知，玉米须多糖脱色工艺的最佳单因素条件为；洗脱液体积100ml，洗脱速度为3ml/min，棉状deae用量为7g。

实施方案六box-benhnken中心组合实验设计探究脱色最优工艺

在单因素实验的基础上，采用中心组合实验box-behnken设计方案，选取洗脱速度、洗脱液体积、棉状deae质量三个因素，以玉米须多糖溶液脱色率为响应值，设计三因素三水平的响应面分析实验，各因素的三个水平采用-1、0、1进行编码，如表1。

表1响应面实验因素水平表

响应面实验设计及结果由design－expert8.0.6统计分析软件的实验设计功能可知，以玉米须多糖的脱色率为响应值，以洗脱速度（a）、洗脱液体积（b）、deae质量（c）为变量，建立三因素三水平的中心组合设计包括17组实验方案，每个实验方案进行三组测量取平均值。具体实验设计如表2。

表2box-behnken实验设计及结果

表3box-behnken试验统计分析

注：p>0.05不显著，p<0.0001极显著

模型的建立及显著性及检验

利用design－expert8.0.6软件分析通过回归分析表2中数据进行拟合回归，得到洗脱速度（a）、洗脱液体积（b）、deae用量（c）三个因素对多糖的脱色率的二次回归方程脱色率=90.82-1.48a-0.70b-0.11c-1.46ab-1.93ac+1.4bc+0.059a²-1.06b²-6.06c²。为了检验玉米须多糖纯化工艺回归方程的有效性，对上述方程进行显著性检验，结果如表3，由方差分析回归方程可以，其虚拟相不显著（p>0.05），模型组极其显著（p<0.0001），脱色率的r²=0.9866，r（adj）²=0.9694，说明该模型拟合良好，模型成立。影响多糖脱色效果的主次因素为棉状deae纤维素用量>洗脱液体积>洗脱速度。

通过回归模型的分析，可以确定脱色的最优工艺为洗脱液体积为100~110ml，洗脱速度为2.5~3.5ml/min，棉状deae纤维素用量为6.5~7.5g。经过验证试验，此工艺的脱色率达到85%~91%，多糖保留率达到90%~93.61%，糖醛酸保留率达到75%~84%。与ab-8大孔树脂的脱色效果相比，棉状deae纤维素的脱色率及多糖保留率均比较高。采用棉状deae纤维素脱色后，多糖纯度达到70%~76%。

实施方案七纯化后玉米须多糖中单糖组分及其分子量的测定

1、单糖组成的测定

准确称取纯化后的玉米须多糖样品，置于反应釜中，加入3ml2mol/l的三氟乙酸（tfa）溶液，封口放入110℃烘箱中水解5h，取上清液蒸干，用甲醇重复洗涤3次，蒸干水解产物。

取上述水解产物，加水溶解定容至10ml，准确移取0.2ml与玻璃离心管中，分别加入0.2ml0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑琳酮（pmp）的甲醇溶液和0.2ml0.3mol/l的氢氧化钠溶液于70℃水浴加热60min，冷却后加入0.2ml0.3mol/l的盐酸溶液中和，再加入1ml氯仿萃取，离心去上上清液，重复3次，用水稀释定容至5ml备用。

hplc条件：分离柱：ods2c18柱（250×4.6mm²，5μm），流动相：乙腈-0.05mol/ml磷酸盐缓冲ph=6.8（18:82），流速：0.8ml/min，柱温：30℃，紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为20μl。甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖作为标准品。

测得纯化后玉米须多糖中的单糖及其摩尔比为man:rib:rha:glua:gala:glu:gal:xyl:arab:fuc=27.9:1:10.2:7.3:13.2:41.6:51.4:8.6:14.7:3.7。

与其它的脱色方法相比，棉状deae纤维素纯化后的玉米须多糖所含单糖组成更为丰富，含有糖醛酸和半乳糖等具有活性作用的单糖。

2．玉米须多糖分子量的测定

配制2mg/ml的玉米须多糖溶液，用0.45μm滤膜过滤，备用。数据处理采用n2000gpc色谱工作站进行记录。分别用t-40、t-70、t-100、t-400等不同分子量大小的葡聚糖作为标准品建立校正曲线

hplc条件：分离柱：ks-804葡聚糖凝胶柱（8.0×300mm²），流动相：超纯水，流速：0.8ml/min，柱温：50℃，检测器温度：35℃，示差折光检测器。

纯化后玉米须多糖分子量范围为30~1230kda。

由实验结果可知，采用棉状deae对多糖进行脱色，工艺操作便捷，且脱色率和多糖保留率极高，大大地提高了多糖的纯化效率，为多糖的分离纯化提供了一种新的高效便捷的纯化方法。