黄连SDIR转录因子在提高植物抗旱中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种转黄连sdir基因提高植物抗旱的方法。

背景技术：

干旱胁迫是影响植物生产发育最重要的非生物胁迫之一。严重影响植物的生理及代谢过程，干旱会诱导植物体内活性氧的积累，使植物产生氧化胁迫应答，最终都将导致植物细胞脱水和渗透压失衡。为避免过量产生的活性氧对自身的伤害，植物在进化过程中形成了一套去除及中和活性氧的防御体系，包括抗氧化酶系统和非酶系统的抗氧化剂类。

泛素化是蛋白质翻译后修饰的一个类型，参与植物发育和逆境胁迫的许多方面的生理调控。植物的泛素化过程涉及到泛素活化酶(e1)、泛素结合酶(e2)和泛素连接酶(e3)这3种泛素化酶，泛素化蛋白最后被26s蛋白酶体特异性的识别和降解。其中，泛素连接酶e3在泛素化途径中起到识别底物与呈递泛素分子的作用，是泛素化过程最关键的转录因子。e3家族主要分为3大类，分别为hect蛋白家族、u-box蛋白家族以ring-finger型蛋白家族，其中数量最为庞大的泛素连接酶是ring指蛋白家族。ring类型e3连接酶有个类似于zincfinger的ring结构域，ringfinger结构域中具有保守的氨基酸序列c-n2-c-n(9-39)-c-n(1-3)-h-n(2-3)-c/h-n2-c-n(4-48)-c-n2-c(其中c代表半胱氨酸残基，h代表组氨酸残基，n为任意氨基酸)。而ring-finger蛋白家族主要分为两大亚类，分别为ring-h2(c3h2c3)型和ring-hc(c3hc4)型。ring类型中的多种转录因子在细胞进程中发挥非常重要的作用，包括植物激素信号转导、光形态建成、自交不亲和、花发育、衰老以及在缺氮条件下植物生长发育的调控。从干旱处理的拟南芥的芯片数据中分离出来的sdir(saltanddroughtinducedringfinger)，其属于ring-h2(c3h2c3)型ringfinger类型的转录因子e3，具有环指结构域的sdir可以正向调控拟南芥胁迫的脱落酸传导途径。近年来已有研究表明拟南芥和水稻等的转录因子sdir可以显著提升植物的抗旱耐盐能力。拟南芥sdir的过表达改变了一系列脱落酸aba和干旱胁迫相关基因的表达，提高了拟南芥植物体内aba诱导叶片气孔关闭的敏感性，通过介导aba信号转导正调控植物的干旱胁迫响应过程；另外sdir基因在烟草和水稻中的异源表达显示，过表达与对照相比耐旱性明显增强，实验结果表明该基因在单子叶和双子叶植物中功能保守。多个研究表明转录因子sdir参与的泛素化作用对提高植物抗逆有明显作用。

不同的物种的sdir基因由于序列不同，其能对植物产生的抗旱能力有强有弱。而黄连作为我国传统中药材，试验结果表明黄连sdir(ccsdir)能显著提高转基因植物抗旱性。该研究有助于通过基因工程手段对中药材(如黄连)进行内源基因过表达，增强其培育工程中的抗逆性，且不改变中药材的整体成分，特别是有效成分。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种新的sdir基因，并通过将其转基因的方式来提高植物抗旱。

本发明提供了一种基因片段，核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种重组载体，它包括seqidno.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述重组载体是重组pyg8198载体。

本发明还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。

进一步地，所述重组菌为重组农杆菌，优选为重组农杆菌gv3101。

本发明还提供了前述的基因片段、重组载体、重组菌在提高植物抗旱中的用途。

前述的用途中，所述植物为烟草。

本发明还提供了一种提高植物抗旱的方法，它是取前述的基因片段、重组载体、重组菌，转入植物中，获得稳定表达对应蛋白的植株或者种子，即可。

前述的方法中，所述植物为烟草。

本发明提供的一种转sdir提高植物抗旱能力的方法，采用烟草转入本发明ccsdir基因片段，得到稳定遗传的转基因材料，并且验证试验表明ccsdir基因能显著提升转基因植物抗旱，因此可将所述基因和重组质粒在品种选育和组织培养工厂化中应用，从植物基因工程这一条新途径服务于应用和生产。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1是黄连总rna、5′race扩增产物和3′race扩增产物电泳图。

图2是ccsdir基因orf的克隆图。

图3是ccsdir推测氨基酸与其它同源蛋白氨基酸的多序列比对图；黑色框为sdir蛋白的ring环指结构域。

图4是ccsdir重组蛋白的诱导表达与纯化；m：蛋白质markersm0431；1：诱导的pet28空载细菌；2：诱导的pet28-ccsdir重组菌沉淀；p：纯化的pet28-ccsdir重组蛋白。

图5是ccsdir基因在黄连各器官中表达的相对定量分析图。

图6是盐胁迫对野生型及t2代转基因烟草表型的影响图。

图7是盐胁迫下野生型烟草与转基因烟草的相关生理指标测定图；a：mda含量；b：gr酶活测定；c：cat酶活测定；d：apx酶活测定。

图8是干旱处理下烟草叶片的伊文思蓝染色照片与细胞活性检测图。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

若未特别指明，实施例和实验例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子生物学实验手册》(马文丽，2011)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

主要的缩写：

ccsdir，黄连sdir。

主要实验用品如下所示：

1.实验材料

1.1植物材料

黄连(coptischinensis)；烟草。

1.2菌株和载体

大肠杆菌(escherichiacoli)top10、bl21(de3)、农杆菌gv3101；克隆载体peasy-t(北京全式金生物技术有限公司)，原核表达载体pet28a(+)。

1.3各种酶、试剂盒及试剂

酶：rtaq酶、primestar^tm酶、反转录酶m-mlv、各种dna限制内切酶均购于takara公司。

试剂盒：胶回收试剂盒、植物基因组dna提取试剂盒、植物总rna提取试剂盒购于北京天根公司，反转录试剂盒购于takara公司，荧光定量试剂盒购于biorad公司，质粒提取试剂盒购自omiga公司，蛋白浓度检测试剂盒购于thermo公司，蛋白纯化试剂盒购于海狸生物科技公司，；mda、gr、apx、cat试剂盒等购自南京建成生物工程研究所；

琼脂糖、琼脂粉、tris、sds、购于amersham，其它化学药品为进口或国产分析纯和色谱纯试剂。

1.4实验引物

本实验所用引物用于基因克隆、原核表达载体构建、真核表达载体构建以及rt-pcr分析(引物信息如表1所示)，均在成都擎科生物技术有限公司合成。

表1实验所用引物

1.5主要仪器设备

pcr仪：美国伯乐公司；

荧光定量pcr仪：qtower2.2real-timepcr仪德国耶拿；

凝胶成像仪：美国伯乐公司；

蛋白电泳仪：美国伯乐公司；

电泳仪：dyy-iii1型稳压仪(北京六一仪器厂)；

电泳槽：jy-cz5垂直电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；

超速低温离心机：centrifuge5804r(eppenderf公司)；

超微量分光光度计：nanovue(ge)；

超低温冰箱：thermo；

光照培养箱：宁波江南仪器厂。

实施例1本发明sdir基因的克隆

1.黄连叶片总rna和基因组dna的提取

取0.1g黄连幼嫩叶片，加液氮研磨成粉末，使用trizol提取黄连总rna，用nanovue超微量分光光度计测定浓度，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性(图1a)。叶片基因组dna的提取使用北京天根公司植物基因组dna提取试剂盒(dp305-03)。

2.黄连cdna的合成

以提取的总rna为模板，以oligo(dt)18为反转录引物，采用m-mlvrtase进行反转录，反应体系如表2。先将样品在pcr仪上70℃，变性10min后，取出后冰浴2min后在冰上加入提前配制好的6.8μl混合物。混合均匀后再次放入pcr仪42℃反应1h，90℃反应10min。

表2反转录体系

3.黄连sdir基因(ccsdir基因)cdna全长的获得

3.1ccsdir基因的3′端部分片段克隆

根据黄连转录组数据搜索得到黄连sdir1基因保守序列，设计正向引物sdir3-1和sdir3-2。利用引物sdir3-1和ap，以cdna为模板，primestartm酶进行3′-racepcr扩增，扩增反应如下：94℃预变性5min，然后30个循环(94℃40s，54℃50s，72℃1min)，72℃延伸7min。将所得产物用ddh2o稀释20倍为模板，以sdir3-2和ap1为引物和primestartm酶，相同程序进行第二轮pcr，凝胶电泳成像结果见图1c。所得产物经回收后克隆到pmd19-t载体上，转化e.colitop10感受态细胞。菌落经pcr验证后，挑取阳性菌落送往公司测序。将所得序列在ncbi上进行比对分析。

3.2ccsdir基因的5′端部分片段克隆

利用引物sdir5-1和ap，以cdna为模板，primestartm酶进行5′-racepcr扩增，扩增反应如下：94℃预变性5min，然后30个循环(94℃40s，56℃50s，72℃1min)，72℃延伸7min。将所得产物用ddh2o稀释20倍为模板，以sdir5-2和ap1为引物和primestartm酶，相同程序进行第二轮pcr，凝胶电泳成像结果见图1b。所得产物经回收后克隆到pmd19-t载体上，转化e.colitop10感受态细胞。菌落经pcr验证后，挑取阳性菌落送往公司测序。将所得序列在ncbi上进行比对分析。

3.3ccsdir基因全长cdna克隆

引物设计：前面所得的3′、5′端和中间片段经软件vectornit10.0拼接后，得到全长cdna序列。根据数据结果，分别设计两对特异引物ccsdir-r和ccsdir-f以cdna为模板，94℃预变性5min，然后30个循环(94℃40s，56℃60s，72℃1min)，72℃延伸7min。扩增ccsdir基因cdna全长并用电泳观察结果(图2)。

3.4pcr产物的回收与连接

将切下的含有目的片段的琼脂糖凝放入1.5ml的离心管中，采用天根公司dna柱式胶回收试剂盒回收片段，将回收片段连接到peasy-t载体(transgene)上，反应体系为：peasy-t载体1μl，胶回收产物4μl。混匀后，放置于25℃连接10min，连接好的片段用于转化。

扩增得到的ccsdir基因cdna序列(seqidno.16)为：

前述的ccsdir基因全长可以通过采用上述方法获得，也可以直接合成。

3.5氨基酸序列的同源性分析

将ccsdir基因推测的氨基酸序列在ncbi上进行blastp搜索发现：黄连ccsdir和已有的其他植物的sdir1氨基酸序列间有较高的同源性。其中与荷花(nelumbonucifera，xp_010256868.1)、苹果(malusdomesticaxp_008343569.1)、麻疯树(jatrophacurcasxp_012088886.1)、香瓜(cucumismelo，xp_008441380.1)、拟南芥(arabidopsisthaliananp_191112.1)等的同源性分别为81％、80％、80％、79％、72％。从图中可以看出不同植物中sdir的同源蛋白之间相似性很高，n端的两个跨膜结构域和c端的ringfinger结构在植物中很保守(图3)。

实施例2转基因烟草构建

1植物表达载体的构建

本研究采用pyg8198载体进行转化烟草实验，该载体含有2xcamv35s启动子和gus报告基因。用bamhi和xholi酶切pcr产物和pyg8198质粒，t4连接酶连接过夜后转化大肠杆菌top10，过夜培养后挑选菌落进行pcr鉴定，并将阳性菌落进行测序分析。将鉴定完全正确的重组top10扩大培养提取质粒转化农杆菌。

2农杆菌培养

从-80℃冰箱中取出gv3101原始菌株，冰上溶化，取10μl于1ml的yeb液体培养基中(100μg/ml)，28℃，220rpm，震荡培养6h。涂布与yeb固体培养基中(100μg/ml)，28℃，培养两天。

3农杆菌感受态的制备

1)挑取gv3101单克隆于5ml含100gg/mlrif的yeb液体培养基中，28℃，200rpm培养过夜；

2)取1ml菌液，加入到50mlyeb液体培养基中，28℃，200rpm培养至od600值约为0.5；

3)将菌液转至无菌离心管中，冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min；

4)弃上清，收集菌体，重悬于10ml0.1mnacl中，4℃，5000rpm离心10min；弃上清，沉淀用1ml20mmcacl2悬浮，按15％比例加入冰浴的甘油后，分装，每管50μl，于-80℃保存。

4农杆菌的转化(冻融法)

1)将农杆菌感受态置于冰上，加入10μl经双酶切鉴定过的重组质粒，轻轻混匀，冰上放置30min；

2)将含有农杆菌和质粒的1.5mlep管置于液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴热激5min；

3)加1ml无抗生素的yeb液体培养基于28℃，200rpm培养2-4h；

4)3000rpm，离心2min，收集菌体，将上清吸去，100μl培养菌液直接涂布于含抗生素的yeb平板(100μg/mlkan，100μg/ml)上吹干，28℃培养48h；

5)挑选单克隆，进行菌落或菌液pcr验证后用于植物转化。

5无菌苗的组织培养

烟草种子消毒程序：70％酒精浸泡30s，0.1％升汞浸泡5min，无菌水冲洗5遍，接种于ms培养基上，28℃培养，光周期16h/8h。

6农杆菌的活化

将含有目的基因载体的农杆菌菌液100μl接种到10mlyeb培养基中，28℃，200rpm过夜培养。取活化菌液100μl加50mlyeb液体培养基，28℃，200rpm继续振荡培养至od600值0.6-0.8。菌液收集到50ml离心管中，5000rpm离心5min，浓缩菌体，稀释到1/2ms，od为0.2-0.3，用于侵染。

7转化烟草

1)烟草叶片预培养：将无菌烟草叶片剪成2mm×2mm大小，在ms固体培养基预培养3天；

2)农杆菌菌液侵染烟草叶片：预培养叶片在含有农杆菌的1/2ms液体培养基中侵染10-15min后取出，灭菌滤纸吸干；

3)共培养：将侵染过的叶片放到ms基本培养基上暗培养2d；

4)筛选培养：分为三轮进行筛选培养，逐渐降低头孢霉素的浓度；

①分化培养基+500mg/l头孢霉素+80mg/l卡那霉素，培养2周；

②分化培养基+400mg/l头孢霉素+80mg/l卡那霉素，培养2周；

③分化培养基+200mg/l头孢霉素+80mg/l卡那霉素，培养1周。

5)生根培养：待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基：1/2ms+200mg/l头孢霉素+80mg/l卡那霉素。

6)移栽培养：生根的烟草长到约5cm高时，进行转基因检测，选择确定的阳性植株取部分叶片切成碎片后重新在含有激素的选择培养基上进行诱导扩大培养，第二代再生苗长到约5cm高时，打开瓶盖，在温室中炼苗1周，移栽到营养土中。

8转基因检测

提取烟草叶片dna，以此为模板并以ccsdir-qf和ccsdir-qf为引物进行pcr扩增，同时以野生型的烟草基因组dna为阴性对照，此法用于检测目的基因ccsdir是否整合到烟草基因组中。pcr反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，72℃延伸7min，用1％琼脂糖凝胶电泳作分析。

9纯合子获得

收集检测为阳性的t0代转基因烟草种子，经无菌消毒后，将种子种植在含有kan(50mg/l)的1/2ms固体培养基上萌发和培养，然后再将筛选得到的t1代阳性株系的种子继续用高浓度的kan(150mg/l)进行抗性筛选，通过观察t2代株系的kan抗性，选择萌发率约为100％且无黄化现象出现的株系，即可能为转基因烟草纯合子。

为了体现本发明中ccsdir基因确实能表达出蛋白，也确实能增强植物的抗旱能力，以下将以实验例的方式进一步说明。

实验例1ccsdir基因的原核表达

1.方法

1.1原核表达载体的构建

本研究采用pet28a(+)载体，用引物ccsdir-p28-b和ccsdir-p28-x扩增含有黄连ccsdir基因并测序正确的重组质粒，用bamhi和xhol内切酶对pcr产物和pet28载体进行双酶切，胶回收后，用t4连接酶在16℃连接过夜，转化大肠杆菌top10，pcr及酶切鉴定筛选阳性克隆pet28-ccsdir。

1.2e.colibl21原核表达的诱导与聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)检测

将构建好的重组质粒pet28-ccsdir转化到原核表达菌株bl21(de3。挑取单克隆接种到5ml含amp(100mg/ml)的lb液体培养基中，37℃，250rpm摇床中培养过夜。取0.5ml菌液接种到5ml含amp(100g/ml)的lb培养基中，37℃，250rpm培养至od600达到0.6，加入终浓度为1mm的iptg，诱导4h后离心收集菌体，加入上样缓冲液，振荡悬浮，沸水中加热破碎10min，12000rpm离心10min，取上清进行12％聚丙烯酰胺凝胶(sds-page)电泳检测。电泳方式采用浓缩胶90v，分离胶120v。当溴酚蓝迁移至距离凝胶底部1cm处时停止电泳。取出凝胶用考马斯亮蓝r250进行染色过夜，再用脱色液脱色至获得清晰的蛋白条带。

2.结果

将经过鉴定的bl21表达菌株转化子用iptg诱导，对诱导的重组菌裂解液通过sds-page电泳检测。电泳图谱显示出现了一条大量表达的蛋白条带，由于带有his表达标签，该蛋白分子量约为31.08kda(图4)，除去载体上的部分残基和his标签的分子量约20kda，与ccsdir蛋白的理论分子量大小(11.08kda)接近。重组菌表达的ccsdir蛋白在上清中表达较高，便于后续的蛋白纯化。

实验例2黄连sdir基因组织特异性表达研究

1.方法

1.1实时荧光定量pcr引物设计

根据克隆出的ccsdir全长序列设计ccsdir-qf和ccsdir-qr(表1.1)作为荧光定量pcr引物，选取黄连18s作为内参基因，引物为cc18s-qr和cc18s-qf(表1)。

1.2rna的提取

分别从黄连的根、叶、茎及中提取rna，所得rna立即反转录。

1.3荧光定量pcr扩增

本研究所用的荧光定量pcr反应体系如表3所示。反应程序为95℃变性10s后，进入95℃10s，65℃15s，72℃10s的40个循环，最后在72℃延伸5min。从55℃到95℃进行溶解曲线分析，去除引物二聚体和其他非特异性扩增。每个样品均重复三次以避免加样误差，分析方法为2^-δδct法。

表3实时荧光定量pcr反应体系

2.结果

结果如图5所示。该基因在这些组织器官中都有表达，在根中表达量相对较高，在叶中表达量相对低。

实施例3转基因烟草耐盐性鉴定

1.方法

1.1转基因烟草在盐胁迫条件下的形态观察

将培养4周左右长势相同的对照组野生型烟草和t2代转基因烟草分别浇灌0、10％、20％和30％peg6000溶液。每三天浇灌一次，处理两周，数码相机拍照记录。

1.2转基因烟草相关指标检测

丙二醛含量测定和氧化氢酶(cat)、抗坏血酸专一性过氧化物酶(apx)以及谷胱甘肽还原酶(gr)三种抗氧化酶的活性。具体测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.3植物细胞活性的检测

采用伊文思蓝(evansblue)作为细胞活性染料，检测胁迫处理后野生型烟草和t2代转基因烟草第四叶片的细胞活性。具体方法参照刘楠[22]，将处理的叶片取出并用纯净水清洗、抹干，浸泡在0.5％(w/v)的伊文思蓝溶液中24h。随后取出叶片，用纯净水清洗叶片表面的蓝色染液，吸去叶面水分后放入煮沸的无水乙醇∶甘油(9∶1)中30min，除去叶绿素至叶片底色显白色为止。将脱掉叶绿素而呈现有明显蓝色斑的叶片平展，用数码相机拍照，随后将叶剪碎，放入4ml的1％sds的水溶液中萃取伊文思蓝2d。以沸水煮15-20min杀死细胞后被伊文思蓝全部染上蓝色的叶片作对照，提取液在600nm下测定吸光度。细胞相对活性计算公式v＝[1-(a/ad)]×100％，，细胞相对活性(v)，其中a为胁迫处理后的叶片染色提取液吸光度，ad为沸水煮死的叶片染色提取液吸光度。

2.结果

2.1盐胁迫对野生型及t2代转基因烟草幼苗生长的影响

如图6所示，转基因烟草均比野生烟草生长状况好，随着盐浓度的增高，野生植株变的相对矮小，叶片萎蔫枯黄，生长畸形，而转基因植株整体受损情况要小很多。初步确认黄连ccsdir基因的导入增加了转基因烟草的抗旱性。

2.2盐胁迫对丙二醛含量和三种抗氧化酶活性的影响

未受到胁迫的野生型烟草和转基因烟草的两类生理指标都变化不大，随着干旱浓度的不断增加，转基因烟草的mda含量也有所提高，但均低于相应野生对照烟草(图7a)。比较在0，10％，20％和30％peg6000胁迫下生长的各个株系烟草的抗氧化酶活性(gr、cat和apx)，可以看出低浓度的peg6000对酶活性有诱导作用，高浓度胁迫下酶活性都有不同程度的降低，但在相同胁迫下，转基因烟草的相应的酶活性都比野生型烟草的高(图7b-e)。

2.3伊文思蓝染色法检测干旱胁迫下野生型烟草与转基因烟草叶片的细胞活性

叶片染色情况结果显示经干旱胁迫处理的烟草叶片蓝色染色区域各有差异，蓝色区域即细胞失去活性的区域，对比之下，转基因烟草的叶片染色面积较野生型要小(图8)。将拍照的烟草叶片剪碎并用sds水溶液萃取后，溶液吸光度和叶片的相对活性见图下排，可见该结果与拍照结果基本一致，仍然是野生型烟草伤害最为严重。因此，进一步认定ccsdir基因的表达增强了植物抵抗高盐的能力。

综上，本发明制备得到了ccsdir基因以及重组菌，将其转入植物中，可以有效提高植物的抗干旱能力，应用前景良好。

sequencelisting

<110>成都中医药大学

<120>黄连sdir转录因子在提高植物抗旱中的应用

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