本发明属于微生物的
技术领域：
，具体涉及一种米曲霉的鉴定方法。
背景技术：
：微生物研究中经常要进行菌种鉴定，而自然界大部分微生物都难以纯化培养，因此非培养的测序鉴定方法有很大优势。常用的测序鉴定方法难以区分米曲霉与黄曲霉。虽然全基因组测序可以鉴定区分，但周期长，费用高。因此需要发展一种特异的米曲霉测序鉴定方法，提高鉴定分辨率，降低检测费用。米曲霉(aspergillusoryzae)在食品酿造方面的应用历史悠久，广泛应用于食品、发酵等方面，是目前制作发酵酱油的主要菌株。黄曲霉(aspergillusflavus)产生黄曲霉毒素，具有致癌突变作用，对人和动物的健康构成巨大威胁。米曲霉与黄曲霉在分类学上共同属于黄曲菌群，生长条件相似，菌落形态特征相近，基因组也高度相同，较难辨别区分。因此，研究一种简单、快速鉴定米曲霉的方法，具有重要的意义。技术实现要素：为了解决以上技术问题，本发明提供了一种简单、快速鉴定米曲霉的方法，以将米曲霉与黄曲霉区别开来。具体的，一方面，本发明提供了一种米曲霉的鉴定方法，该方法包括以下步骤：(1)提取待测菌体基因组dna；(2)双酶切基因组dna和表达质粒，纯化后得到酶切纯化物；(3)将酶切纯化物连接，转化，克隆，测序，获得n条序列，n＝7-15；(4)将获得的序列进行blast比对分析，每条序列对应多个同源性最高的霉菌，n条序列对应的共有霉菌仅为米曲霉，就鉴定待测菌体为米曲霉。本发明通过双酶切待测菌体的基因组和表达质粒，连接，转化，克隆测序后进行比对分析，如果n条序列对应的共有霉菌为米曲霉，就鉴定为米曲霉。本发明可以仅利用n条常用序列，就能鉴定出米曲霉，能将米曲霉和黄曲霉区别开来，本发明方法操作简单，费用低。进一步的，步骤(1)中，将待测菌体划线培养后获得单菌落，挑取单菌落经纯培养离心收集菌体，液氮粉碎菌体后提取基因组dna。进一步的，步骤(2)中，双酶切所用的酶为psti内切酶和bamh内切酶。进一步的，步骤(2)中，双酶切后，将酶灭活，使用普通dna产物纯化试剂盒过柱纯化。进一步的，步骤(2)中，表达质粒为pmd18-t自连质粒。进一步的，步骤(2)中，使用依赖于atp的线性dna分解酶纯化质粒。进一步的，步骤(3)中，将酶切纯化物使用t4dna连接酶进行连接。进一步的，步骤(3)中，将连接产物转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞，使用氨苄青霉素进行抗性筛选。进一步的，步骤(3)中，将转化子抽提质粒进行双酶切鉴定，将鉴定为阳性的转化子送样测序。进一步的，步骤(4)中，将获得的序列在ncbi网站上进行比对分析。本发明的有益效果为：本发明通过双酶切待测菌体的基因组和载体质粒，连接，转化，克隆测序后进行比对分析，所有序列对应的共有霉菌仅为米曲霉，由此鉴定为米曲霉。本发明提供了一种全新的鉴定米曲霉的方法，能将米曲霉和黄曲霉区别开来。本发明的方法操作简单、特异性强，费用低，时间短，具有十分广阔的应用前景。具体实施方式下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例1一种米曲霉的鉴定方法包括以下步骤：(1)将米曲霉aspergillusoryzaecicc2080在pda平板上划线培养，获得单菌落，收集菌体，液氮研磨粉碎，使用n96plantgenomicdnakit提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组dna。(2)双酶切基因组dna，酶切体系包括(50μl)：dna200ng，10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。在氨苄抗性lb平板上，挑取载体pmd18-tvector(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(dp103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于atp的线性dna分解酶(atpdependentdnasetakara，biomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)酶解线性双链dna，去除宿主基因组dna，纯化质粒。双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：dna200ng，10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。(3)将上述双酶切纯化物用t4dna连接酶(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)连接，连接参考说明书。取连接产物转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子送样测序。使用通用引物bcabestsequencingprimerrv-m：gagcggataacaatttcacacagg进行测序，获得7条序列，如表1所示。(4)将获得的7条序列在ncbi网站上进行blast比对分析，结果见表2。每条序列同源性最高对应的霉菌有多种，7条序列最高同源性共有的菌株仅为米曲霉。由此鉴定所测菌为米曲霉(aspergillusoryzae)。表1表2序列编号比对菌株同源性1aspergillusoryzaerib4096.0％2aspergillusoryzaerib40100.0％2aspergillusoryzae100.0％2aspergillusflavusnrrl335748.0％2aspergillusoryzaerib4023.0％3aspergillusoryzaerib40dna99.0％3aspergillusoryzaerib4089.0％3aspergillusbombycis83.7％3aspergillusnomiusnrrl1313783.7％4aspergillusoryzaerib4099.0％4aspergillusoryzaerib4089.0％4aspergillusbombycis83.7％4aspergillusnomiusnrrl1313783.7％4aspergillusflavusnrrl335738.0％5aspergillusoryzaerib40100.0％5aspergillusflavusnrrl335799.0％5aspergillusoryzaerib4084.0％5aspergillusnomiusnrrl1313793.0％5aspergillusbombycis93.0％6aspergillusflavus100.0％6aspergillusoryzae100.0％6aspergillusoryzae100.0％6aspergillusoryzae100.0％6aspergillusoryzae100.0％6aspergillusoryzaerib40100.0％6aspergillusoryzaeisolateatcc46244100.0％6aspergillusoryzaestrainfrr2874100.0％6aspergillusoryzaestrainnrrl1808100.0％6aspergillusoryzae100.0％7aspergillusflavus100.0％7aspergillusoryzae100.0％7aspergillusoryzae100.0％7aspergillusoryzaerib40dna,sc026100.0％7aspergillustamarii98.0％由表2可知，7条序列在ncbi网站上进行blast比对分析后，得到每条序列对应菌株序列的覆盖率(querycover)和相似度(ident)，同源性的数值为两者相乘。每条序列同源性最高对应的霉菌有多株，7条序列最高同源性共有的菌株仅为米曲霉，由此鉴定待测菌体为米曲霉(aspergillusoryzae)。实施例2一种米曲霉的鉴定方法包括以下步骤：(1)将待测霉菌在pda平板上划线培养，获得单菌落，收集菌体，液氮研磨粉碎，使用n96plantgenomicdnakit提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组dna。(2)双酶切基因组dna，酶切体系包括(50μl)：dna200ng，10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。在氨苄抗性lb平板上，挑取载体pmd18-tvector(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(dp103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于atp的线性dna分解酶(atpdependentdnasetakara，biomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)酶解线性双链dna，去除宿主基因组dna，纯化质粒。双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：dna200ng,10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。(3)将上述双酶切纯化物用t4dnaligase(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)连接，连接参考说明书。取连接产物转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子经克隆扩培后，送样测序。使用通用引物bcabestsequencingprimerrv-m:gagcggataacaatttcacacagg进行测序，获得10条序列。(4)将获得的序列在ncbi网站上进行blast比对分析。每条序列同源性最高对应的霉菌有多株，10条序列最高同源性共有的菌株仅为米曲霉，由此鉴定待测菌体为米曲霉(aspergillusoryzae)。实施例3一种米曲霉的鉴定方法包括以下步骤：(1)将待测菌株在pda平板上划线培养，获得单菌落，收集菌体，液氮研磨粉碎，使用n96plantgenomicdnakit提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组dna。(2)双酶切基因组dna，酶切体系包括(50μl)：dna200ng，10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。在氨苄抗性lb平板上，挑取载体pmd18-tvector(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)自连质粒，液体扩培，提取纯化质粒(质粒小提试剂盒(dp103)，天根生化科技(北京)有限公司)。使用依赖于atp的线性dna分解酶(atpdependentdnasetakara，biomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)酶解线性双链dna，去除宿主基因组dna，纯化质粒。双酶切质粒，酶切体系包括(50μl)：dna200ng,10×kbuffer5μl，psti5u，bamhi5u。37℃酶切2h，80℃加热20min灭活，过柱纯化(普通dna产物纯化试剂盒(dp204)，天根生化科技(北京)有限公司)。(3)将上述双酶切纯化物用t4dnaligase(takarabiomedicaltechnology(beijing)co.,ltd.)连接，连接参考说明书。取连接产物转化入大肠杆菌dh5a感受态细胞。使用氨苄青霉素进行抗性筛选，所得转化子抽提质粒进行双酶切鉴定。鉴定为阳性的转化子经克隆扩培后，送样测序。使用通用引物bcabestsequencingprimerrv-m:gagcggataacaatttcacacagg进行测序，获得12条序列。(4)将获得的序列在ncbi网站上进行blast比对分析。每条序列同源性最高对应的霉菌有多株，12条序列最高同源性共有的菌株仅为米曲霉，由此鉴定待测菌体为米曲霉(aspergillusoryzae)。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>光明乳业股份有限公司<120>一种米曲霉的鉴定方法<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>751<212>dna<213>人工序列(未知)<400>1tttattcagaagatagcaggacgccattctgagcccaacataccggagcggagagtctgc60aatatgctccggtgtgatgcctagcgaatatacatgatccgacccacctagtagtggtgt120ttatgctagttcttggcaccaggtcaagcctttgagctaagctcttgccaagggttccac180tttacggagcctgtacttacagtacagtacagtttcttaggtaaatgcgcattcagtttc240ggtcaaccggcggatcaaaatcatagaagcatagacaatccaaacagtagattagccaag300acttcgagacagttcttcggcatctttgcttacccaagctactgtgggctagacttgctg360aacccttcgataaaaacgttgagtgatgccaagtctctcacttcggcatgcgaatcagct420atcaggctccgattgataatctattgttccattttgttgtagtctggaaaatgctagtat480cagatttgcacaacatagatttgaataaagggaatccagcatatatactggcttcaaaca540aatgacctaagatctcccccttctgcgataactcgagtaaattcgtgctaacttacgcga600attccgaagcaaatattcgttaaacaatgtgatgcatggttgaatatatcccgggggact660tccggctgttccgcaacatgtatctgattagattgataagagaaattgcgctcggaaagt720atatgctctttctgcaatggtttgttccctc751<210>2<211>427<212>dna<213>人工序列(未知)<400>2cctctcccagggaaggccaggtcactgttccgacgtccagactagtcgtgtgtcagtagc60ctgtgaggacatgaagtacgaaatagattcatacgttgcaaaaaccatcagggtgaacag120gcaagcaatagagaagttgatagccttctggtatgtgggccagttctatccagcaattct180cgtcagcttttattcggacaggctgagctgggccatcaatggatatatttcacacgtgca240aaacctaccaatggttcattgggatcgttcgatggttggggctgaagaataacatggccg300tcggcatcttgttcgactccgtccaaatctatgcgtccttgaggccgtcattgttagtct360cggtgtgtgaagtttgctatagaaagatgcaggatatctaccttctcccaaataaaccgt420cccaggt427<210>3<211>623<212>dna<213>人工序列(未知)<400>3gacgcctgagaagtcgaatgagacttcaggtgcaacgtattcgatgtcaaaggcgacgat60ctgttgttttagtatgagcaagtggctcatgagaaacagttggctgtctgtggcggattt120gctggcgatcagggagctcgcatgatgaagagagatgttggtttggtgaacgatttgatg180cgctaaatcatcaaatacagtggactatgaacaaacggtcagtatatacagattatctgc240ttaacaaagcgggttggggccctcgtacattcacaaggcggtagatcctgctcagaagcc300agatggctttccgtaatgtagggtaccagttgctcggtgagacctgtgattcgaagtccc360actttgagtcttgttctgacggagagtctgcgccgtcttcgggttgctttgcgggcttgg420ggaggtttgcgagagcatcggtagccgtaactttcctgcccgagatttgcccgtccgtaa480ctgatatggaagcctgtttgttgcgcgcagggtaatcaaggtcatcggggcgaggcttgt540acctttcgatttcgtcgcgaaggaaggcttgggcgcggaaaacaagccgagtttgaacat600cctccagcacaggttgaatcaat623<210>4<211>623<212>dna<213>人工序列(未知)<400>4acgcctgagaagtcgaatgagacttcaggtgcaacgtattcgatgtcaaaggcgacgatc60tgttgttttagtatgagcaagtggctcatgagaaacagttggctgtctgtggcggatttg120ctggcgatcagggagctcgcatgatgaagagagatgttggtttggtgaacgatttgatgc180gctaaatcatcaaatacagtggactatgaacaaacggtcagtatatacagattatctgct240taacaaagcgggttggggccctcgtacattcacaaggcggtagatcctgctcagaagcca300gatggctttccgtaatgtagggtaccagttgctcggtgagacctgtgattcgaagtccca360ctttgagtcttgttctgacggagagtctgcgccgtcttcgggttgctttgcgggcttggg420gaggtttgcgagagcatcggtagccgtaactttcctgcccgagatttgcccgtccgtaac480tgatatggaagcctgtttgttgcgcgcagggtaatcaaggtcatcggggcgaggcttgta540cctttcgatttcgtcgcgaaggaaggcttgggcgcggaaaacaagccgagtttgaacatc600ctccagcacaggttgaatcaatg623<210>5<211>636<212>dna<213>人工序列(未知)<400>5cgagctcacgctggaccgggactggcgggagtatggcgaataatgtccgtacgggtgcac60atgagcatgtgcatgcgtgcgacaccggtggtgtgtgcgacaagggcccctcgaggggtt120gctgtggatatgtaccgggcttttcatgaggtcgttaagattaacattaggcgggatatg180gaaacaggcgaatgaattagaaccagcgtcagtattcggtttgtcgacatggtcgcagtt240cgtgttttcgtgtacatgaaagttttgacaggcagaaaggtcaggacacattcccagcat300gtggaatacatctgccggattaacgccattctgagccgggaacggttggtgcatcatgtt360gccgtgagcgtctttagaagagtcatggaaatgaaaatgagggaaactgtgcgagtggca420atgggcaactgggatcgaatgctgagggaagagggagtccatagagggttgaggggccac480catgtccgaagtgatattaccggttggtttgggtagttgatctccttgcgattgtcccac540tgtgcatgccgaaagtaaatcattggattccagattaatggggcctgctagccctaaaag600agactcaagggtatggtctgcaacagctgtatcgtt636<210>6<211>872<212>dna<213>人工序列(未知)<400>6atagctgtacgagttgtgccagctcaaaagtgcgatgcaccaaggagaaaccggcctgtg60ctcggtgtatcgaacgtggtcttgcctgtcaatacatggtctccaagcggatgggccgca120atccgcgcgctcccagtccccttgattcaactcggcgaccatcagagagtcttccttcag180ccaggtcggaacagggacttccggcgcataacacgtactcaacgcctcatgctcataccc240aggcccacactcatgctcattctcatccgcaaccgcatccacaatctcatcctcaatcga300atcaaccaccacacgctctgcccaccccgaatggtagcagtagcgtctccgccatctttt360ctcatcagagtccgccgccacccgtggagacccagggccttggaggagatctggctggtc420aggagcaaagcaccctgtcttccctaacagtcgattcggaattcgggggctcgttgcagt480caatggaacacggaaaccatgccgatttcttggccgagtcgacggggagtcttttcgacg540cgtttttggaagtagggacccccatgatcgacccgttcctcgagtcggccccactaccac600cgtttcaggcgcgctattgctgcttttcgctagcactacaaacactgacccacctcttcc660cccacgccccgctgggctgtcaactacggctgacggacggtgaggacagttcgtacaacc720tgatgacgactgatatggtcatctcggggaacaagagggctaccgatgcggtccggaaga780tcctcgggtgttcgtgcgcgcaggatggctacttgctgagcatggtcgtccttatcgttc840tcaaggtgctggcatggtatgctgcggcagca872<210>7<211>710<212>dna<213>人工序列(未知)<400>7gaggatttactacgtataacattccatatctatatgccatcccctgaaaggcagtgcatt60aatcaatatataggacggattcttcgaggatgtgcccagcgcttcattttcgaggaggtt120gcccctgaccaatacgcccacacagatgcctcaaagatgctgcgagtgacgggtattcat180gccttggtaggattctcgtgagtctccttctttaacaataaactaccagatgtcctcacc240agggagaccgagttagatgtgacgaagtgatgc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