一种相隔离的油包水透明粗乳液及其应用的制作方法

本发明属于数字链式酶反应检测
技术领域：
，更具体地，涉及一种相隔离的油包水透明粗乳液及其应用，该相隔离的油包水透明粗乳液尤其是一种水油两相物质隔离的稳定的透明粗乳液，并且应用该透明粗乳液系统可实现数字定量检测，相应的检测方法尤其可以实现高特异性数字式封闭核酸定量检测。
背景技术：
：数字链式酶反应是目前世界上最灵敏和精确的核酸定量方法。其中的数字式检测，是指将待测含有目标物，如核酸、蛋白质等生物大分子，或者细菌、细胞等的溶液或者悬浮液分隔成一个个彼此隔绝但是体积相同的独立反应空间，从而让目标被随机分散在这些微反应器中独立进行检测反应。当待测目标的个体数与微反应器数目相当或者前者小于后者时，就会出现部分的微反应器出现阳性信号而其余的则是阴性(由于此分隔内不含目标物)。待数出阳性分隔的数目就可以利用泊松分布统计模型算出待测物的浓度。虽然链式酶反应作为最常见的检测反应应用最广，由于该反应是热循环的，要求较为精密的变温控温设备；而环介导扩增、滚环扩增、重组聚合酶扩增、多重置换扩增等恒温反应也因为反应灵敏、操作简单、设备要求低，在许多场景中得到应用。数字式的检测由于可以在单个核酸分子、单个蛋白分子或者单个细胞、细菌级别上定量，可以说是最为准确的定量手段，同时可以区分核酸序列中单个碱基的区别，在许多场景中有明显优势。为提高数字链式酶反应的反应通量，需要设置多个独立的反应空间。目前已有多种能够形成独立反应空间的手段，其中有利用微流控芯片等微加工器件做出微米级别的微坑等“硬分隔”，用油包水形成的均匀液滴的“软分隔”。后者由于简便容易操作、成本低廉，逐渐在科研与实际应用中占据更大的市场份额。在“软分隔”中，乳液液滴是化学生物领域中实用并且正在迅速发展的有力工具之一，在生命科学和材料领域应用众多。乳液液滴的尺寸通常在数微米到几百微米之间，在特定表面活性剂的作用下稳定存在于油相液体中。由于当前手段限制和技术惯例等原因，科研以及生产中的乳液液滴一般处于1微米到300微米之间。乳液液滴能够将样品液滴(多为水溶液)均匀的分散为多份体积近乎相同的分隔，这些相互隔绝的分隔能够形成独立的反应空间，从而可以极大的提高反应的通量，可以用于合成微小尺度的并且数目众多的结晶颗粒、聚合物小球等，形成的固态颗粒物大小相近，并且合成过程容易调控。在schulman等人在1961年6月发表的文章【1】以及沈钟等著有的教材《胶体与表面化学》【2】中提到了乳液中的分类，其中根据乳液的颗粒大小分为了乳状液和微乳液(microemulsion)，前者又叫做粗乳液(macroemulsion)。本发明将延用该粗乳液的定义。微乳液，一般指的是分散颗粒尺寸很小，直径小于0.1μm的液体分散系统，由于颗粒大小小于可见光波长，所以透过的光受到较小的折射以及散射干扰，通常外观呈现出透明或者微微半透明的稳定体系。而粗乳液一般颗粒更大，在0.1μm以上，在自然条件下会让经过的光发生散射和折射，所以粗乳液一般呈现不透明的乳白色。微乳液通常包含至少四个成分，水、油、表面活性剂以及助表面活性剂，其中助表面活性剂多为醇类，特别是多羟基的化合物。而粗乳液中不含助表面活性剂，含有其余的三个成分。微乳液的天然透明特性在化妆品中被青睐，其中有许多专利利用透明特性提高产品外观，如文献【4-7】中都加入了脂肪醇或者多羟基的物质作为助乳化剂，如甘醇、山梨酸与peg、ppg的酯，这些物质往往hbl值大于10，才能保证在水油中都有较好的溶解度。微乳液虽然外观整体上面稳定，肉眼不可见变化，但是其内部是由hbl值大于10的乳化剂和助乳化形成的大量的柔性薄膜，由于助乳化剂的存在，薄膜的形成与溶解时刻处于动态变化中，同时水油中的物质时刻与这层薄膜发生物质交换。文献【8-9】中提到，利用透明微乳液实现不互溶的两个液相之间的化学反应(酯交换反应)，这里的透明乳液不是为了实现更好的光学特性或者产品外观，而是这样的透明微乳液为不互溶的两个液相提供极大的接触机会，从而极大的改善改化学过程的反应速率。微乳液系统如文献【4-7】常应用于化妆品领域，主要用于提升产品外观和用户体验，其中胶束大小不可控、不均一或者根本不是胶束而是许多分子薄膜，不能经受热循环，液滴通透性高(溶质可以在水油两相中交换)而达不到相分离。此外，微乳液中加入了许多抑制生物酶活性的组分(如脂肪醇、甘油等多羟基物质)，因此不适于生化反应，更不适于数字化反应。而粗乳液系统中有明显的相分离，也就是大部分的水油两相的物质不会进入到另一个相中：这是由于粗乳液中形成的稳定的液滴，其中表面活性剂有序排列而形成的界面有一定的刚性和隔绝性能。由于粗乳液的相分离特性，其能够形成多个独立的反应空间，而且具有更好的热稳定性且液滴大小适合数字化反应体系，相对于微乳液而言，粗乳液体系更适于数字化反应。相分离的粗乳液液滴可以让数字链式酶反应等基于极限稀释策略的检测定量方法极大程度的提高精确度和分辨率。目前常见的数字细菌计数、数字细胞计数、数字聚合酶链式反应等数字式定量技术都是基于粗乳液滴的均匀分隔特点，其策略分为三步：样品液滴化分隔、信号放大反应以及计数处理。其中荧光液滴的计数处理常有两种办法：液滴逐个通过微流通道并在荧光探测点的时序性计数，以及液滴平铺在一个平面或者旋转圆柱表面上，通过荧光成像的办法获取荧光液滴的位置和数目等信息。以上两种，逐个探测计数以及平面拍照方法都存在不足。逐个探测计数中的液滴处于流动状态，需要稳定乳液的流速，因此需要额外微流体控制，对于黏度高或者液滴致密的乳液，还需要在乳液进入探测点前加入稀释油以间隔液滴。平面拍照的方法只能拍到至多三层液滴，由于折射的原因，如果不做特别处理，更加深层的液滴的成像几乎无法实现。除此之外，两种计数方法都需要在特定的容器内成像，此中必将涉及扩增后产物的转移。这一做法将极有可能污染后续的实验，使得后续实验出现假阳性的概率大大增加。因此，急需一种能够对深层粗乳液液滴进行原位封闭成像检测的方法。参考文献【1】j.k.schulman和j.b.montage,formationofmicroemulsionsbyaminoalkylalcohols,annalsnewyorkacademyofsciences，vol.92,issue2,366-371，1961年6月.【2】沈钟，赵振国，康万利，《胶体与表面化学》，化学工业出版社，2011年版。【3】j.z.sun,m.c.e.erickson,和j.w.parr,refractiveindexmatchingandclearemulsions,j.cosmet.sci.,56,256-265,2005年7/8月【4】us5925338,clearantipersprirantordeodorantgelcompositionwithvolatilelinearsiliconetoreducestaining，nancym.karassik等,1999.【5】us6403069,highoilclearemulsionwithelastomer,sumanchopra等，2002【6】us6387357,highoilclearemulsionwithdieneelastomer,sumanchopra等，2002.【7】transparentoil-in-wateremulsion,michelf.mercier等，2009.【8】us3480616，esterificationofpolyhydriccompoundsinthepresenceoftransparentemulsifyingagent,lloydi.osipow,1969.【9】us3644333,transeterificationinthepresenceofatransparentemulsion,lloydi.osipow,1972.【10】中国专利，申请号cn201610409019.0，公开号cn106076443a，黄岩谊等，2016.【11】中国专利，公开号cn106053346b，一种光片显微成像装置，费鹏等，2016.技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种相隔离的油包水透明粗乳液及其应用，利用该特定的透明粗乳液配方，相应透明粗乳液液滴的制备方法，以及透明粗乳液液滴的成像检测方法，通过控制用于相隔离的油包水粗乳液的水相和液相两者的组成，尤其通过调整粗乳液液滴中水相的折射率，使粗乳液液滴透明化，使光线可以穿过浅层透明液滴达到深层液滴，从而实现深层粗乳液液滴的原位封闭成像检测。本发明通过控制用于相隔离的油包水粗乳液的水相和液相(例如油相体系和水相体系各自的具体成分种类及相应配比等)，得到的相隔离的油包水粗乳液首次实现了在透明液滴中同时拥有诸多有利性能：(1)大小可控均一；(2)透明，在紫外-可见光波段做到厘米级别的穿透；(3)相分隔作用明显，水相和油相中溶剂不轻易交换，反应封闭；(4)不影响聚合酶等生物大分子的活性；(5)机械稳定和热稳定，液滴不会因循环加热和移动破碎。由于这些优点，该体系使深层粗乳液液滴的原位封闭成像检测成为可能，有广泛的应用前景。为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种相隔离的油包水透明粗乳液，其特征在于，该透明粗乳液由水相和油相乳化分散得到，其中分散于油相中的水相液滴其平均直径不低于0.2μm；并且，水相中还溶解有折射率增强剂，该折射率增强剂成分在所述水相整体中所占的质量百分数不低于20％；所述油相中还溶解有hbl值不大于8的表面活性剂；此外，所述水相和所述油相两者折射率之差的绝对值不超过0.1。作为本发明的进一步优选，所述折射率增强剂成分在所述水相整体中所占的质量百分数为25％～40％；所述水相和所述油相两者折射率之差的绝对值不超过0.01；所述水相在该油包水透明粗乳液整体中所占的体积百分数为5％～90％，更优选为10％～30％。作为本发明的进一步优选，所述油相中的油相基体为氟油、碳氢基油或硅基油，优选为黏度不低于0.5cst的硅基油，优选的，该硅基油的黏度不高于10cst，该油相基体更优选为黏度为1cst的硅基油。作为本发明的进一步优选，所述表面活性剂在所述油相整体中所占的质量百分数为0.1％－20％，优选为2％～10％；所述油相中的油相基体具体为硅基油，并且，所述表面活性剂为硅基的表面活性剂，优选为dow5200formulationaid，dow9011siliconeelastomerblend，dow5225cformulationaid，dowby11-030，dowby25-337，dowes-5612formulationaid，dowfz-2233，dowes-5226dmformulationaid，dowes-5227dmformulationaid,massocaresil系列，kf-6017p，kf-6028p，chemsilk-12，em97，或silcarewsi。作为本发明的进一步优选，所述相隔离的油包水透明粗乳液中不含甘醇、聚乙二醇及相对分子质量不超过1000的小分子脂肪醇，以及hbl值大于8的表面活性剂。作为本发明的进一步优选，所述折射率增强剂选自无机盐、单糖、二糖、多糖衍生物、氨基酸、极性有机化合物、二甲亚砜、甲酰胺、氯化四甲基铵以及牛血清蛋白中的至少一种；优选的，所述无机盐为钾元素、钙元素、钠元素、镁元素、锌元素、锰元素或铁元素的氯化物或者硫酸盐；所述单糖为葡萄糖、果糖或山梨糖；所述二糖为蔗糖；所述多糖衍生物为醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；所述氨基酸为甘氨酸、精氨酸、苏氨酸或赖氨酸；所述极性有机化合物为乙酰胆碱、胆碱、甜菜碱或神经酰胺；所述折射率增强剂优选为甜菜碱、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、赖氨酸。按照本发明的又一方面，本发明提供了用于形成油包水透明粗乳液的组合试剂，其特征在于，该组合试剂同时包括水相组合试剂和油相组合试剂，其中，所述水相组合试剂包括水溶剂和能够溶解于水中的折射率增强剂，该折射率增强剂在所述水相组合试剂整体中所占的质量百分数不低于20％；所述水相组合试剂包括油相基体和hbl值不大于8的表面活性剂；所述水相组合试剂用于混合形成水相，所述油相组合试剂用于混合形成油相，所述水相和所述油相两者折射率之差的绝对值不超过0.1，所述水相和所述油相两者则用于进一步乳化分散得到油包水透明粗乳液。按照本发明的又一方面，本发明提供了制备相隔离的油包水透明粗乳液液滴的方法，其特征在于，该相隔离的油包水透明粗乳液液滴属于上述相隔离的油包水透明粗乳液，该方法包括以下步骤：(1)分别配制水相和油相，该水相和油相均用于形成上述相隔离的油包水透明粗乳液；(2)进行乳化分散处理使所述水相进入所述油相形成透明粗乳液液滴。作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述乳化分散处理具体是震荡乳化处理、微流控十字共流处理、微流t型流道法液滴化处理或者离心液滴乳化处理，优选离心液滴乳化处理。按照本发明的又一方面，本发明提供了上述相隔离的油包水透明粗乳液在提供独立的微小包裹环境上的应用；该相隔离的油包水粗乳液优选是为特异性数字链式酶反应提供独立的微小包裹环境；优选的，所述特异性数字链式酶反应是为了检测；优选的，提供所述提供独立的微小包裹环境的目的为了数字化的细菌计数检测，或者为蛋白质或核酸的检测或定量分析，或者为蛋白质结晶、处理或观察，或者为细菌或细胞在三维环境中分子通信的研究。按照本发明的再一方面，本发明提供了一种基于特异性数字链式酶反应的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照上述制备相隔离的油包水透明粗乳液液滴的方法形成粗乳液液滴，在配制其中的水相时，加入待测浓度的核酸、蛋白质分子、生物活性分子、细菌或细胞；(2)将所述步骤(1)得到的粗乳液液滴进行特异性数字链式酶反应；(3)对所述步骤(2)中反应所得的粗乳液液滴进行光学检测，即可得出所述待测浓度的核酸、蛋白质分子、生物活性分子、细菌或细胞的数量和/或浓度；优选的，所述步骤(2)中，所述特异性数字链式酶反应为聚合酶链式反应、多重置换扩增反应、重组酶聚合酶等温扩增反应、环介导等温扩增反应或滚环扩增反应；所述步骤(3)中，所述光学检测优选为光片扫描成像。本发明通过控制粗乳乳液中水相和油相的具体组成(以及相应用于形成油包水透明粗乳液的组合试剂的具体配方)，尤其通过调整粗乳液液滴中水相的折射率使粗乳液液滴透明化，使光线可以穿过浅层透明液滴达到深层液滴，从而实现深层粗乳液液滴的原位封闭成像检测。粗乳乳液中含有两相物质，水相以及油相。一般情况下的粗乳乳液大多是不透明的，呈乳白色或者灰白色，这是因为油水两相的折射率不同，同时乳液液滴尺寸大于光波长的四分之一、比表面积大，两相界面在粗乳液内部处处存在，光在接触两相界面时经过折射散射，有时候还有液滴内部的吸收，不能直线通过。而当水油两相折射率相同或相近时，两相界面消失，光线可直线通过，乳液变得透明。乳液的透明化程度随油水两相折射率之差变化，若想得到透明化乳液，油相和水相的折射率差为±0.1以内(此时即可认定水油两相折射率相近)，优选±0.01以内。另外，当该相隔离的油包水透明粗乳液液滴在具体应用时，可以在水相中加入待测浓度的核酸、蛋白质分子、生物活性分子、细菌或细胞等，此时的乳液液滴也有可能变得不再透明。表1液体(20℃)折射率水1.330全氟烷烃(fluorinerttm系列产品)1.238～1.303硅基油1.375～1.430苯，甲苯1.501，1.497正辛烷，异辛烷1.398，1.391c8-c12脂肪酯1.43～1.46本发明中所使用的折射率增强剂用于调节水相折射率，使水相的折射率满足与油相折射率匹配的要求，并需要能够自然条件下(20～40℃)溶解于水中；折射率增强剂可选自各种常用生物反应添加剂。水和一些常见油相的折射率见表1。由表1可见，水相的折射率小于大部分油相的折射率，要想提升水相折射率使其与油相折射率相同或相近，需要加入折射率增强剂。要在提高水相折射率的同时保持液滴界面刚性大，隔绝度高(通透性低)以形成封闭的独立反应室，就要求折射率增强剂是不破环相隔离效果的。即便与水差值最小的硅烷也有0.4以上的折射率差异，若想达到折射率匹配需要添加摩尔级别的增强剂，如果是分子量不大的有机小分子，通常添加量要在2摩尔以上——这个浓度足以干扰大部分的生物反应。本发明尤其通过使用既不破环相隔离效果、又不干扰生化反应的特定种类的水相折射率增强剂(包括：无机盐，如钾、钙、钠、镁、锌、锰以及铁等氯化物或者硫酸盐，葡萄糖、蔗糖、山梨糖、果糖等单糖或者二糖，醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等多糖衍生物，精氨酸、苏氨酸、赖氨酸等氨基酸，乙酰胆碱、胆碱、甜菜碱、神经酰胺等强极性有机化合物，二甲亚砜、甲酰胺、氯化四甲基铵以及牛血清蛋白等常用生物反应添加剂等)，通过优选添加这些特定的水相折射率增强剂，可以使得水相折射率升高到和硅基油折射率一致，从而得到透明粗乳液滴。尤其是，当需要在液滴体系中进行生化反应时，折射率增强剂优选甜菜碱。甜菜碱作为一种常用生化反应中的添加剂，已知其能帮助dna分子消除二级结构影响和gc碱基比例对熔解温度的影响。该分子是一种兼性有机盐，对水溶液的离子强度影响较少，对生物酶干扰较小，是常用的核酸扩增反应和蛋白稳定反应液添加剂中添加浓度最高的，一般常用浓度在1～2摩尔每升，远远高于其他添加剂的0.2摩尔每升。我们发现甜菜碱较大的允许浓度给折射率调节提供了灵活的空间，使得水相反应液的折射率得到足够的提升，从而使得甜菜碱可以成为生化反应水相液体的主要折射率调节物质。我们的实验发现，在体相反应中，甜菜碱的最高添加浓度一般低于3摩尔每升，多在2摩尔每升左右，而高于3摩尔每升时会使得生物酶(如核酸扩增反应中的常用聚合酶等)失效，导致反应失败。但是，在粗乳液滴这个体积极小的体系中，甜菜碱的添加量达到4摩尔每升时仍然不明显影响链式酶反应的进行。其中原因是小体系更大的比表面积可以增加分子碰撞几率，另一方面扩增产物被限制在微小环境中，使得局部环境浓度比体相反应中高出几个数量级，能够克服酶活性下降带来的负面影响。此外，与甜菜碱有类似折射率增强效果的小分子有机兼性离子盐如氨基酸在乳液体系中也具有较高的可添加浓度，也可作为合适的折射率增强剂。另外，折射率增强剂的添加浓度根据折射率要求确定，添加浓度越高，水相折射率增加越多，与油相的折射率差越小，乳液越透明。除了使用单一一种折射率增强剂成分外，本发明可以同时使用多种折射率增强剂。本发明优选将折射率增强剂成分在水相整体中所占的质量百分数为25％～40％，可根据单位摩尔浓度带来的折射率增量计算所需的添加浓度；对于大部分生化反应兼容的折射率增强剂来说，折射率要提高0.1，水相中折射率增强剂的浓度要提高1摩尔每升到5摩尔每升。折射率增强剂的加入不会干扰液滴的相隔离性能，无需额外在乳液配方中的水相加入表面活性物质。为使油相和水相的折射率更易于匹配，需要尽量选择折射率与水相接近的油相。粗乳液的油相可以是硅基油或其衍生物。本发明首选硅基油作为乳液的油相。硅基油是聚二甲基硅氧烷的液态聚合物，其聚合程度可高可低。在硅油产品中，硅油的聚合度越高，分子链越长，其折射率越高，黏度越大，但是折射率的变化速度远小于黏度的变化速度，所以硅油较大的黏度选择范围可以使其适应较大范围的微流体流变学要求。使用硅基油作为油相基体，相较于全氟烷烃，溶解其他物质的能力更强，更容易调整折射率；相较于辛烷或与其碳原子数目相近的烷烃，则更容易形成稳定的、且能够兼容生物学反应的乳液系统，好处明显。本发明通过将水相在该油包水粗乳液整体中所占的体积百分数优选控制为5％～90％(更优选控制为10％～30％)，可保证粗乳液的热稳定和机械稳定性。为了获得稳定的透明粗乳液，除油水两相的折射率匹配外，还需要合适的疏水亲油表面活性剂，本发明通过在油相中使用hbl值不大于8的表面活性剂。溶解于硅油的表面活性剂可以硅基的，这样有助于稳定硅油-水的界面。硅基表面活性剂有范围宽广的化学修饰，可以适应不同化学生物体系的兼容要求。表面活性剂也可以是氟碳基或者是碳氢基，或者是聚二甲基硅氧烷的衍生物。当需在要乳液滴中进行后续生化反应时，需考虑后续反应对表面活性剂的要求，例如多回合热循环下的热稳定性，生物兼容性，不起泡，无显著蛋白吸附，无重金属，无核酸或蛋白等生物残留等，本发明优选使用以peg(聚乙二醇)、ppg(聚丙二醇)作为亲水基的硅氧链表面活性剂(如dow5200formulationaid等)，以及silcarewsi等以丙三醇酯作为亲水基的硅氧链表面活性剂。本发明还通过将表面活性剂在油相整体中所占的质量百分数为0.1％－20％(优选为2％～10％)，可以带来增强油—水界面稳定性的优点。与透明微乳液不同，本发明的透明粗乳液中不必要包含小分子脂肪醇，因为脂肪醇的加入使得生成粒度小于0.2μm的微乳体系，同时影响乳液隔离性能、生物相容性及后续检测。要在液滴中发生数字化检测，需要介质性质温和，酸碱性适中，离子强度不干扰生物化学反应，同时要求介质能保证液滴大小均一，在升温或者反复高低温转换中不融合不破碎，同时对于机械震荡有一定抵抗能力。脂肪醇的加入会干扰酶促反应，并且其表面活性容易造成微乳液滴大小不一，同时破坏热稳定性。本发明可针对液滴化方法不同选择不同的油相。例如，采用离心液滴乳化时，首选没有化学修饰的短链低黏度硅油作为油相，这样可以避免液滴撞击油表面时产生的碎片，具体黏度不高于10cst，但是考虑到黏度越低越低越易燃，从安全角度出发，黏度在1cst左右即可。如果利用微流控芯片产生液滴，则可以调节硅油的黏度(由于硅油产品一般不会标明聚合度，可以利用黏度表征聚合链长)达到调节液滴尺寸等设计目的，具有脂肪链修饰的硅油一般具有更高的黏度，有利于产生小的液滴，但是黏度过大会增加流量控制难度。为了增加油相中气体的溶解度，满足水相与外界的气体交换等要求，同时减小油相对水相中微溶于油的小分子的萃取，可以采用氟代修饰或者其他卤代修饰的硅烷。例如，可以使用多种互溶的硅烷的混合物作为油相，以满足多方面需求。本发明中的相隔离的油包水透明粗乳液尤其可应用于高特异性数字链式酶反应和检测，以及其他需要单独的微小包裹环境的化学生物反应(考虑到生物分子的大小，相隔离的油包水粗乳液液滴中的水相液滴其平均直径不低于0.2μm；平均直径的最高上限可根据实际情况调整，例如平均直径不超过200μm等)。本发明也给出了用透明化的乳液进行高特异性数字链式酶反应的方法，通过光学检测手段即可实现检测。透明粗乳液液滴的光学检测方法可根据透明化程度和所需的成像深度进行选择，可以是现有技术中已有的成像手段，如光片扫描成像(如参考文献【11】)，宽场扫描，明场成像，共聚焦成像等，优选光片扫描成像。相比于其他成像方式，用光片扫描成像可以获得更深的成像深度。检测的种类还可以包括荧光，吸收以及浊度或者其组合,其中荧光也可以是多色的。检测信号采集可以是终端信号采集，也可以是实时信号采集。总得来说，本发明取得了以下技术效果：第一，本发明的透明粗乳液配方使用hbl值小于8的表面活性剂，不加入小分子脂肪醇等助表面活性剂，使用生物兼容性好的折射率调节剂，形成了颗粒直径不小于0.2μm的油包水的相隔离粗乳液体系，其内部液滴形貌和相分离性能具有良好机械稳定性和热稳定性，适于生物学反应，为实现彼此隔离的微小包裹环境的化学生物应用，尤其是在高特异性数字链式酶反应中的应用提供了基础。第二，本发明优选选取甜菜碱或氨基酸作为折射率增强剂，在调整折射率的情况下保证透明液滴成分兼容后续生物化学反应。第三，本发明能够通过液滴的透明化实现原位封闭成像，省去了常规检测方法需要的复杂设备及产物转移步骤，提高了样品读取速度和通量，增加了用户操作简便度，减少了样品污染。第四，本发明将透明粗乳液配方(如控制油相体系和水相体系各自的具体成分种类及相应配比)与离心液滴乳化相结合，能够短时间内产生大量均一性良好的透明粗乳液液滴，通过离心液滴乳化的办法，液滴产生在反应容器中，无需样品转移即可进行反应，适于进行多个平行独立反应体系中的生物学反应，透明粗乳液液滴保证可深度成像，反应后无需样品转移，无需开盖，可直接进行成像检测。第五，本发明中利用透明粗乳液滴进行聚合酶链式反应的方法，通过数字pcr反应证明了本发明能够实现单碱基灵敏度的检测。第六，本发明将透明粗乳液滴与光片成像相结合，在距离样品成像侧300微米以上的深度仍可实现深层液滴成像，无需打开容器盖子，可进行深层液滴的封闭原位成像，大大减少了产品污染的概率。附图说明图1为改变折射率增强剂浓度后的粗乳液液滴其透明度示意图。由于折射率增强剂浓度的变化，粗乳液液滴将呈现出不同的透明度。图中从左至右折射率增强剂的浓度增加，透明度先增大后减小，在合适浓度时最为透明(右三)。图2为通过数字链式酶反应进行扩增后的荧光液滴图。图中可见添加折射率增强剂超过3摩尔/升之后仍不会影响数字链式酶反应的效果，荧光信号在阳性液滴中对比度明显，说明没有显著的液滴之间的物质交换。图3为系列梯度浓度(5摩尔/升的甜菜碱原液添加量从上至下线性升高)甜菜碱溶液的链式酶反应液得到的光片层析结果图。最右侧为各个组别折射率的直方图，横线代表乳化油的折射率。图4为不同折射率匹配条件下(梯度浓度的甜菜碱)、不同照明条件下的粗乳液成像结果图。其中，第一行：透射；第二行：宽场荧光成像；第三行：光片照明荧光成像。图5为折射率匹配的数字链式酶反应结果图。使用光片扫描成像时，不同深度处透明乳液液滴光片荧光照片。该图由序号1到9这9个小图拼接成，序号从1到9代表不同深度的激发平面的荧光图像，可以看出，尽管到最后图像有些许信噪比的下降，但不影响荧光液滴数目的计数。图6为使用透明粗乳液液滴通过数字链式酶反应进行单碱基突变检测的结果图。该图由序号1到3这3个小图拼接成，其中序号1的小图是序号2的小图和序号3的小图两者信号叠加后得到的，序号2的小图和序号3的小图是同一样品的同一层面的荧光图像，其中序号2的小图是488nm通道的荧光信号，序号3的小图是532nm的荧光信号。部分液滴中出现明显荧光增强，可见虽然加入的折射率增强剂甜菜碱溶液的浓度高达3.15m，仍然发生了聚合酶链式反应，说明折射率增强剂不会使链式酶反应的特异性降低，有能力实现存在单个碱基差异的dna检测和定量。此实验中的使用两条探针检测一个基因位点，二条探针的差别仅有一个碱基，同时使用两种的荧光分子分别对应两个基因型，使用的样本是杂合子个体的dna，所以两个探针都会出现荧光信号。由于每个液滴中大多数情况下只有一条dna分子，如果此方法足够灵敏，则在一个液滴中仅仅出现一种信号；而出现两种信号，则说明此方法不能区分单个碱基的差别，灵敏度不够。可以看出，序号2的小图和序号3的小图中亮点的位置是不同的，液滴中只有单一信号的产生，表明该方法灵敏度极高，可以有效的区分同一位点的两个不同碱基。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。本发明中透明化粗乳液，其配方如下：粗乳液包含水相和油相，水相可以占乳液体积的5％－90％(优选10％－30％)，水相中添加折射率增强剂，其中增强剂可以占水相总质量分数20％以上，油相中添加hbl值8以下的表面活性剂，水相和油相的折射率相同或相近，乳化之后的液滴直径在0.2μm以上。油相和水相的折射率差可控制在±0.1以内，优选±0.01以内，可得到透明化乳液。为了保证粗乳液的热稳定和机械稳定性，水相占乳液的比例不宜太高或太低，一般体积占比在5％～90％，优选10％～30％。既不破环相隔离效果、又不干扰生化反应的合适的水相折射率增强剂包括无机盐，如钾、钙、钠、镁、锌、锰以及铁等氯化物或者硫酸盐，葡萄糖、蔗糖、山梨糖、果糖等单糖或者二糖，醋酸纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等多糖衍生物，精氨酸、苏氨酸、赖氨酸等氨基酸，乙酰胆碱、胆碱、甜菜碱、神经酰胺等强极性有机化合物，二甲亚砜、甲酰胺、氯化四甲基铵以及牛血清蛋白等常用生物反应添加剂等。通过添加上述水相折射率增强剂，可以使得水相折射率升高到和硅油折射率一致，从而得到透明粗乳液滴。折射率增强剂的加入不会干扰液滴的相隔离性能，无需额外在乳液配方中的水相加入表面活性物质。粗乳液的油相可以是硅油或其衍生物。随着聚合度变化其黏度可以从0.5cst到上千万cst。硅油可为317667硅油或378321硅油(sigma)以及gelestdms-t01、dms-t01.5等低黏度油。可通过化学修饰调节硅油的诸多性质，如折射率，对某些溶质的溶解率，润湿能力，密度和黏度等。在硅氧烷骨架上面的修饰可以是氟、氯等卤原子，乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、辛基等直链或支链脂肪，直链或支链的卤代脂肪基，苯基、氟代苯基、苄基、卤代苄基等芳香基团，寡聚乙二醇基、寡聚丙三醇基、n-吡啶丙基、四氢呋喃醇丙基、丁氰基等极性基团。为了获得稳定的透明粗乳液，除油水两相的折射率匹配外，还需要合适的疏水亲油表面活性剂，本发明通过在油相中使用hbl值不大于8的表面活性剂。溶解于硅油的表面活性剂可以硅基的，也可以是氟碳基或者是碳氢基，或者是聚二甲基硅氧烷的衍生物。当需在要乳液滴中进行后续生化反应时，需考虑后续反应对表面活性剂的要求，例如多回合热循环下的热稳定性，生物兼容性，不起泡，无显著蛋白吸附，无重金属，无核酸或蛋白等生物残留等，本发明优选使用以peg(聚乙二醇)、ppg(聚丙二醇)作为亲水基的硅氧链表面活性剂(如dow5200formulationaid等)，以及silcarewsi等以丙三醇酯作为亲水基的硅氧链表面活性剂。本发明还通过将表面活性剂在油相整体中所占的质量百分数为0.1％－20％(优选为2％～10％)。本发明中透明粗乳液液滴的制备方法，所述透明粗乳液液滴是上述水相液体乳化分散在油相中形成的稳定球状颗粒，其制备方法概括来说包含如下步骤：(1)分别配制水相(内含折射率增强剂等)和油相(亲油表面活性剂)液体，(2)乳化分散形成透明粗乳液液滴。乳化分散水相进入油相形成液滴的方法可以是震荡乳化，微流十字共流法或者t型流道液滴法或者是现有技术(如参考文献【10】)中离心液滴乳化的办法，用这些方法可获得直径可调、均一性良好的液滴。另外，可针对液滴化方法不同选择不同的油相。采用离心液滴乳化时，首选没有化学修饰的短链低黏度硅油作为油相，这样可以避免液滴撞击油表面时产生的碎片，具体黏度不高于10cst，但是考虑到黏度越低越低越易燃，从安全角度出发，黏度在1cst左右即可。如果利用微流控芯片产生液滴，则可以调节硅油的黏度(黏度表征聚合链长)达到调节液滴尺寸等设计目的，具有脂肪链修饰的硅油一般具有更高的黏度，有利于产生小的液滴，但是黏度过大会增加流量控制难度。为了增加油相中气体的溶解度，满足水相与外界的气体交换等要求，同时减小油相对水相中微溶于油的小分子的萃取，可以采用氟代修饰或者其他卤代修饰的硅烷。为了满足多方需求，可以使用多种互溶的硅烷的混合物作为油相。本发明还提供了一种具有上述配方的粗乳液或上述制备粗乳液液滴的方法制备的乳液液滴在数字化反应、检测中的应用，其中数字化反应例如细菌计数，蛋白质及核酸的检测和定量，蛋白质结晶、处理、观察，细菌或细胞在三维环境中分子通信的研究或者其他需要单独的微小包裹环境的化学生物反应。数字链式酶反应是目前最灵敏的核酸检测手段。由于采用极限稀释策略，被称作“数字”检测。此处的极限稀释策略是指，将待定量检测的目标物(多为生物大分子如dna、rna等核酸以及蛋白，或者如分散的细胞、病毒以及细菌等)稀释并且分散到彼此独立的相同检测环境中，并使得待检测目标物的数目(分子数之于dna、rna及蛋白，细胞数，病毒数或者细菌数)不超过分隔反应的数目太多(最好在3倍一下)，而后通过计数各个分隔反应中的阳性分隔数，利用泊松分布公式得到目标数目的浓度。采用此策略的检测定量方法具有在分子级别的分辨率，在生物医学方面被广泛使用，关于此原理的新技术也在被广泛研究。本发明的透明化乳液滴尤其适用于高特异性数字链式酶反应和检测。本发明中使用透明粗乳液进行高特异性数字链式酶反应的方法，具体可以包含如下步骤：(1)配制包含水相和油相的透明粗乳液配方，其中水相中包含例如核酸，(2)将反应水相溶液液滴化得到透明粗乳液液滴，使得绝大部分液滴中有0个或1个核酸分子，(3)对透明粗乳液液滴进行聚合酶链式反应，(4)对反应所得的透明粗乳液液滴进行光学检测。将包含核酸样品的乳液液滴化后，有的液滴中含有核酸分子，有的则不含。为了保证泊松分布校正的置信度，最好使得核酸分子数目不超过液滴总数，使得绝大部分液滴中有0个或1个核酸分子。液滴经过30到50轮的热循环或者恒温的核酸复制后，核酸分子将呈现指数级别的扩增。扩增的核酸利用合适的荧光信号发生办法，会在含有核酸分子的液滴中产生足够强的荧光信号，通过对荧光液滴的计数，可得到样品中核酸的浓度，其结果的精度是分子级别。使用常规的方法进行高特异性数字链式酶反应，反应结束后对反应所得的透明粗乳液液滴进行光学检测。透明粗乳液液滴的光学检测方法可根据透明化程度和所需的成像深度进行选择，可以是光片扫描成像(如参考文献【11】)，宽场扫描，明场成像，共聚焦成像等，优选光片扫描成像。相比于其他成像方式，用光片扫描成像可以获得更深的成像深度。检测的种类还可以包括荧光，吸收以及浊度或者其组合，其中荧光也可以是多色的。检测信号采集可以是终端信号采集，也可以是实时信号采集。以下为具体实施例：实施例1为了验证合适的折射率增强剂浓度，将gelestdms-t01.5硅油与表面活性剂dowcorninges5612,按照质量比19:1配制，混合均匀后在20,000rcf条件下离心10分钟，得到上层清液用于下一步的乳化油。水相中甜菜碱为折射率增强剂，每个样本水相体积为20μl，体系中加入240μl上述配制好的油，图1由左至右示出分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0摩尔每升折射率增强剂的情况(此处的浓度是指在最终形成的水油混合物中的浓度)。由图1可见随着折射率增强剂的浓度增加，透明度先增大后减小，在折射率增强剂的浓度为3.0摩尔每升时最为透明(即图1中的右三)。实施例2与实施例1不同的是以甘氨酸作为折射率增强剂。将不同浓度(0.5、1、1.5摩尔/升)的甘氨酸溶液用离心的办法形成粗乳液滴。随着甘氨酸浓度增加，透明度先增大后减小，在折射率增强剂的浓度为2.8摩尔每升时最为透明。实施例3此实施例中包含透明粗乳液液滴的数字链式酶反应，反应结束后对粗乳液液滴进行光片扫描成像检测。利用mgb(appliedbiosystemtm)探针检测基因组单碱基突变。单碱基突变中仅有一个碱基的差别，是核酸检测中要求最高的。在所测志愿者的基因组在8号染色体上存在一个突变，其snp号为rs10092491，突变序列为：attccagatagagctaaaactgaag[c/t]tttccttatagagatttatcctagt1.检测用的引物和探针将上述寡核苷酸按照上表第三列中的浓度配制成20x混合液。2.配制链式酶反应液*均由产品中附带。3.乳化油配制将gelestdms-t01.5硅油与表面活性剂dowcorning5612,按照质量比19:1配制，混合均匀后在20,000rcf条件下离心10分钟，得到上层清液用于下一步的乳化油。4.离心液滴生成采用现有技术如中国专利(申请号cn201610409019.0，即参考文献【10】)所述的方法生成液滴，本发明采用离心液滴乳化的方法进行透明化乳液的液滴化，详见相关现有技术，其大致步骤是：在离心机中，让水相液处在一个玻璃板的上方，该玻璃板上有数个大小相同，直径在数微米的小孔，在离心力的作用下，水相液通过小孔形成一个个相同大小的液滴进入下面的油相中，为油相中溶解的表面活性剂所稳定，形成稳定的均一乳液，通过调整小孔直径和离心机转速可获得不同直径的液滴。为便于后续反应和观察，我们可以生成的液滴直径为30～120微米，在具体的实践中，由于检测过程中诸多考虑，选择的液滴直径为48微米。本发明采用37孔，6μm的微通道阵列孔板，向微通道阵列板和收集装置的配合物中加入16μl配制好的链式酶反应液，收集装置为200μlpcr管，在pcr管中盛有240μl上述乳化油，离心速度15,000rcf，离心时间4分钟，生成约44万个直径为41微米的透明化液滴。(注：此处提到的200μlpcr管是指离心管的规格，此种pcr用离心管实际容积在300μl左右，但是生物反应中一般添加量不超过200μl)5.热循环将上述液滴置于热循环仪中，按下表中程序加热。热盖105℃循环前热盖开启步骤1静置25℃120s步骤2酶热激活95℃120s步骤3热循环40轮步骤3.1变性92℃15s步骤3.2退火58℃30s步骤4低温保存4℃持续经计算，链式酶反应液待检测样品dna的数量符合预期。液滴大小为41μm,总计数目4.43×105个。投入dna分子数目利用商业数字pcr定量后约为1.26×104，本发明的检测方法中得到约1.23×104个荧光液滴，符合泊松分布预期。热循环反应结束后使用光片扫描成像的方法进行检测。如图2所示。部分液滴中出现明显荧光增强，可见虽然加入的折射率增强剂甜菜碱溶液的浓度高达3.15m，仍然发生了聚合酶链式反应，说明液滴透明化的方法不会造成链式酶反应特异性的降低，有能力实现存在单个碱基差异的dna检测。实施例4使用光片扫描对加入不同体积浓度5摩尔/升的甜菜碱溶液的链式酶反应液进行成像，如图3所示。图3左侧数字为甜菜碱5摩尔/升溶液占总样本液的比例(即，54％、57％、61％、64％、67％、71％，均为体积百分数)，上方数字为成像深度(到相机的距离)。从上到下甜菜碱溶液加入量依次增加，对应折射率增加，右侧灰色横条代表该样品水相折射率，右侧虚线是油相的折射率。从左到右时光片激发面与最外层液滴的距离依次增加。可见第1、2、5和6行由于折射率不够匹配，透射深度不够，成像深度小于200微米时就不能识别荧光亮点，而3、4两行的成像深度在300微米以上时仍然可见清晰荧光信号。可见折射率匹配程度不同时穿透深度受到影响。实施例5对加入不同体积浓度5摩尔/升的甜菜碱溶液的链式酶反应液在分别在几个照明条件下进行成像，如图4所示。以2％为浓度间隔，从第一列到第十列甜菜碱5摩尔/升溶液占总样本液的比例为47％，49％，51％…65％。每列是同一个样品的不同成像方式，成像的位置和采集设备距离保持不变；其中第一行是明场成像，第二行是宽场照明荧光成像，第三行是光片扫描成像。可见明场无法得到荧光信号，而宽场照明由于多层信号叠加不利于的液滴识别，对于光片扫描成像，当折射率增强剂添加量不足时，无法使水相的折射率提升至和油相匹配的程度，导致只有浅层液滴得以成像(第三行第一至第五列)，当折射率增强剂添加量多到足以使水相和油相折射率匹配时，浅层和深层液滴能够同时成像(第三行第六至第十列)。折射率匹配的样品具有更好的透明度，从而可以得到更加清晰的荧光图片(第三行第七列折射率匹配最好，荧光图片最清晰)。同时相比于宽场照明，光片照明能够避免多层荧光信号的叠加，得到的内部荧光细节。另外，除硅基油外，油相中的油相基体也可以为氟油或碳氢基油，只是硅基油溶解其他物质的能力更强，更容易调整折射率，也更容易形成稳定的、且能够兼容生物学反应的乳液系统。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12