本发明属于降解壬基酚实验领域，更具体地说，涉及一种微藻有效降解壬基酚的实验方法。
背景技术：
由于壬基酚对生态系统存在许多严重的潜在危害，所以对壬基酚的降解和去除成为了研究热点。壬基酚降解的方法主要包括物理法(如活性炭等)，sasai等用hdtma改性蒙脱土(经0.20mm的滤膜过滤)制成的有机蒙脱土吸附np时发现，在10min以内1mg的有机蒙脱土就可以吸附约0.1mg的np分子，其对np分子吸附率几乎达到了100％，但采用该方法的缺点是会形成新的材料污染，吸附污染物的材料应如何处理仍是个问题。化学法(超声波化学氧化法等)利用200khz的超声频率、强度为6w·cm-2的条件下，用超声波可以降解30μmnp时，在利用氧气作为载气，ph>3的条件下，耗时100min，可降解90％的np。
但这些方法存在成本高，方法复杂等缺点。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供了一种微藻有效降解壬基酚的实验方法，设计合理，筛选出的4种海洋微藻对壬基酚具有吸收、吸附和降解作用。它们是球形棕囊藻，拟微绿球藻，杜氏盐藻和亚心型扁藻，四种微藻对壬基酚的去除率(包括吸附率、吸收率和降解率)范围为47.18％-96.36％，降解率范围达43.43％-90.94％，四种微藻中，亚心形扁藻对np的去除效果和降解能力最为显著。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
微藻有效降解壬基酚的实验方法，其特征在于：实验步骤如下：
1)、四种无菌微藻的培育；将处于对数生长期的微藻先接种于250ml锥形瓶中，培养基体积为100ml，藻细胞初始叶绿素a含量为0.08mg/l；锥形瓶在人工气候箱培养，光照强度为150μmol/m2·s，温度为23±2℃，光周期为12l：12d，每天定时摇瓶三次，并随机更换锥形瓶在培养箱的位置，以保证锥形瓶中微藻受光均匀；
2)、提取和测定叶绿素a；无菌微藻每天固定时间取样5ml，3500g离心15min，弃上清液，加入5ml抽提液(丙酮：乙醇＝1:1配制)，震荡摇匀，4℃冰箱黑暗处理24h后，同转速离心15min，取上清液于645nm，663nm波长下测定吸光值，空白抽提液为对照，叶绿素a浓度计算公式如下：
chlorophylla(mg/l)＝12.7od663-2.69od645；
3)、设置四组壬基酚实验组；每组壬基酚实验组包括有6个np浓度处理组，相同浓度的处理组包含有四组锥形瓶，每组有3个重复；六个处理组中的浓度分别为0mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、2.5mg/l；
4)、微藻对壬基酚的降解效应中微藻吸光值与细胞密度、生物量的相关性实验；
选择处于对数生长期的四种微藻，用灭菌后的培养液将其设置一系列的藻细胞浓度梯度，然后用紫外分光光度计测定浓度梯度藻细胞的吸光值a680；藻细胞密度通过显微镜在血球计数板在下对藻细胞进行计数；藻细胞干重的测定，先取每个浓度梯度的微藻藻液20ml，用孔径为0.45μm的玻璃纤维膜过滤，后在鼓风恒温干燥箱，60℃下烘干至恒重并称量；
5)、微藻对水中壬基酚的去除效应以及微藻对壬基酚的胞外吸附和胞内吸收效应；
处理组壬基酚浓度设置为0mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l、2.0mg/l、2.5mg/l，空白对照组设置为只添加壬基酚不加微藻；根据预实验的实验结果(预实验结果表明助溶剂甲醇的无效应浓度为不超过总体积的0.6％)，且为确保壬基酚能够均匀的分散溶解到培养基中，因此将助溶剂甲醇的浓度设置为0.4％；首先将处于对数生长期的四种微藻接种于250ml锥形瓶，接种密度测试为106cell/ml培养基体积设置为100ml，之后放到人工气候培养箱中进行培养，将光照强度设定为150μmol/m2·s，温度设置为23±2℃，光周期设定为12l:12d，每天在统一固定的时间摇瓶三次，还要随机的更换锥形瓶在培养箱中的位置，来确保锥形瓶中的微藻能够均匀的受到光照。
作为一种优化的技术方案，步骤5)中，
培养液中壬基酚的残留量测定：检测时间为0，24，48，72，96，120h；取5ml培养液样品注入0.2ml氯苯和丙酮(1：2)的混合物在10ml带圆锥底的螺旋盖玻璃管中；轻轻摇动后，在试管中形成乳白色混浊溶液(水/氯苯)；然后将样品在4500g下离心5min；使用50μl微型注射器取出沉降在锥形试管底部的分散相的细小提取相细颗粒；该提取过程重复三次，并将沉淀部分合并以用高效液相色谱(hplc)进一步分析；
微藻对壬基酚吸附量的测定：检测时间为在24，72，120h；测定步骤：将上述步骤所得到的藻细胞沉淀用5ml10％甲醇洗涤并振荡约60s；包含在水中的np可以被认为是表面吸附的np，然后如上所述提取水中np的方法提取np，并通过hplc分析；
微藻对壬基酚吸收量的测定：检测时间设定为24，72，120h；测定步骤为：将上述(2)部分处理后的藻细胞沉淀，先加入适量的无水na2so4，之后超声处理20min，再用3ml二氯甲烷-甲醇(1：2v/v)萃取三次(涡旋仪混匀)，并将样品放置在3500g下离心5分钟；将溶剂部分合并，用氮气吹干，并通过hplc分析；
将上述的提取的np样品，氮气吹干后，加入流动相(乙腈-超纯水80:20v/v)，用gf/f滤膜过滤，定容；用涡旋仪混匀，上机测定；或置于4℃冰箱保存至上机测定，保存时间不超过一周；
使用安捷伦1100系列hplc分析np浓度，色谱柱的型号是axdb-c18rscolumn(4.6×250mm，5μm)；采用乙腈-超纯水80:20v/v的流动相；进样体积设置为50μl，进样速度设定为1ml/min；激发波长调整在230nm，发射波长是305nm；停留时间为18min；最低检出限是5μg/l；该方法回收率为90-94％之间。
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明筛选出的4种海洋微藻对壬基酚具有吸收、吸附和降解作用。它们是球形棕囊藻，拟微绿球藻，杜氏盐藻和亚心型扁藻，四种微藻对壬基酚的去除率(包括吸附率、吸收率和降解率)范围为47.18％-96.36％，降解率范围达43.43％-90.94％，四种微藻中，亚心形扁藻对np的去除效果和降解能力最为显著。
本发明的测定指标：
1、细胞密度，采用血球计数板，利用光学显微镜计数；
2、生物量，采用干重法，先取定量藻液，后经孔径为0.45μm的玻璃纤维膜(whatmangf/f)过滤，利用鼓风恒温干燥箱设置60℃来烘干至恒重并称重；
3、od值，采用紫外分光光度计检测，在680nm波长下检测藻液的吸光值；
4、壬基酚标准曲线配制，称取2g壬基酚标准品再溶于甲醇中，配制的浓度为2g/l壬基酚储备液，后再用甲醇配制一系列的壬基酚浓度(0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0mg/l)，以0.22μm的微孔滤膜过滤并收集5ml滤液到螺口玻璃管中，置于4℃冰箱保存。hplc(fld荧光检测器)分析测定np浓度，得到壬基酚的标准曲线为：y＝0.0041x-0.0355，r2＝1；其中，x为峰面积，y为壬基酚浓度。
具体实施方式
实施例
壬基酚暴露在四种微藻后，向四种微藻中加入0.4％甲醇助溶剂，根据四种微藻的叶绿素a浓度的变化表征环境激素壬基酚对四种微藻的影响，四种微藻的叶绿素a含量与不加np不加甲醇只有微藻存在的对照组相比，加入0.4％甲醇助溶剂对微藻的生长没有影响。四种微藻的生长表现出显著的时间-剂量效应。当壬基酚浓度为0.5mg/l时，拟微绿球藻和亚心形扁藻表现出低浓度促进生长的现象，而球形棕囊藻和杜氏盐藻与对照组没有显著差异，都是随着培养时间的增加，叶绿素a的含量也在增加。在1.0mg/l的浓度处理中，观察到四种微藻受到壬基酚的诱导叶绿素a浓度均在下降，但0.5-1.0mg/l的壬基酚处理组之间对四种微藻的抑制作用的区别不显著(p>0.05)。当np浓度高于1.5mg/l时，叶绿素a含量显著下降，表明壬基酚对微藻的生长抑制作用在增强。并且随着np浓度的增加，抑制作用在不断增加。当壬基酚浓度高于2.0mg/l时，四种微藻出现生长缓慢或停止生长甚至出现死亡。当壬基酚浓度为2.5mg/l时，叶绿素a含量与初始加入的叶绿素a含量无明显差异，甚至更低，表明四种微藻均停止生长，被高浓度的np抑制了藻细胞的生长，藻细胞受到毒害而出现死亡。
根据叶绿素a的含量，计算出np对四种微藻的抑制率和微藻的生长速率，从而用spss的概率回归分析得到的4种微藻的96-h半数效应浓度ec50，四种微藻对np的耐受性能顺序为亚心形扁藻>球形棕囊藻>杜氏盐藻>拟微绿球藻。四种微藻的96-hec50都要大于1.0mg/l，其中亚心形扁藻的ec50最大，为1.497mg/l，拟微绿球藻的ec50最低为1.004mg/l。杜氏盐藻和拟微绿球藻在每种处理中没有什么很明显的差别。
四种微藻对水中壬基酚具有去除效应
球形棕囊藻培养基中np的浓度随时间变化，在有微藻存在的培养基中，np的浓度迅速下降。在24小时内，球形棕囊藻将1mg/lnp快速去除到约441.8μg/l，相当于去除了培养基中43.14％的np浓度，在培养到第五天，培养基中的np浓度水平进一步降低，最终浓度分别降低至235.1μg/l，相当于去除了培养基中74.18％的np浓度。壬基酚的处理浓度为0.5mg/l时，球形棕囊藻对np的去除效率最高为78.19％，壬基酚的处理浓度为2.5mg/l时，球形棕囊藻对np的去除效率最低为47.18％。
拟微绿球藻培养基中np的浓度随培养时间的增加，培养基中壬基酚的残留量逐渐降低。在24小时内，培养基中np的浓度迅速下降，拟微绿球藻将1mg/lnp快速去除到约524.2μg/l，相当于去除了培养基中34.01％的np浓度，在培养到第五天，培养基中的np浓度水平进一步降低，最终浓度分别降低至257.4μg/l，相当于去除了培养基中72.63％的np浓度。壬基酚的处理浓度为2mg/l时，拟微绿球藻对np的去除效率最高为81.36％，壬基酚的处理浓度为0.5mg/l时，拟微绿球藻对np的去除效率最低为63.82％。
在培养期间，杜氏盐藻培养基中各处理组np的浓度都随培养时间的增加，培养基中壬基酚的残留量逐渐降低。在24小时内，各处理组np的浓度迅速下降，杜氏盐藻将1mg/lnp快速去除到约355.9μg/l，相当于去除了培养基中52.43％的np浓度，培养时间超过24h后，培养基中np浓度趋于平稳，在培养到第五天，培养基中的np浓度水平降低至192μg/l，相当于去除了培养基中79.02％的np浓度。壬基酚的处理浓度为1.5mg/l时，杜氏盐藻对np的去除效率最高为82.51％，壬基酚的处理浓度为2.5mg/l时，杜氏盐藻对np的去除效率最低为53.88％。
在120-h培养时间内，亚心形扁藻培养基中各处理组np的浓度总体趋势在逐渐减少。在24-h内，各处理组np的浓度迅速下降，亚心形扁藻将1mg/lnp快速去除到约188.4μg/l，相当于去除了培养基中70.75％的np浓度，培养时间超过72-h后，培养基中np浓度趋于平稳，在培养到第五天，培养基中的np浓度水平降低至62.3μg/l，相当于去除了培养基中92.12％的np浓度。壬基酚的处理浓度为0.5mg/l时，亚心形扁藻对np的去除效率最高为96.36％，壬基酚的处理浓度为2.5mg/l时，亚心形扁藻对np的去除效率最低为63.81％。
培养基中np浓度的减少遵循一级动力学。表3.3显示了四种微藻去除np的降解动力学方程和参数。np去除数据可以拟合到一阶模型中，其半衰期分别为2.188,2.045,1.488和1.285天。
四种微藻对壬基酚具有胞外吸附效应
四种微藻对np均具有胞外吸附作用，在培养24h后检测出球形棕囊藻对np胞外吸附量为1.2±0.2-5.1±0.3×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸附量都在逐渐降低，在培养120h后降低至0.2±0.0-1.5±1.5μg/cell。拟微绿球藻在培养24h后检测出对np胞外吸附量为3.2±0.2-22.5±1.8×10-8μg/cell，且在高浓度2.5mg/lnp时，胞外吸附量最高。随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸附量都在逐渐降低，在培养120h后降低至0.2±0.1-7.5±2.4μg/cell。杜氏盐藻在培养24h后检测出对np胞外吸附量为1.0±0.2-12.9±2.0×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸附量都在逐渐降低，在培养120h后降低至0.2±0.1-7.5±2.4μg/cell。亚心形扁藻在培养24h后检测出亚心形扁藻对np胞外吸附量为1.0±0.5-4.5±0.4×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸附量都在逐渐降低，在培养120h后降低至0.1±0.0-5.7±1.3μg/cell。其中，拟微绿球藻对np的吸附作用要较其他三种微藻更强。
四种微藻对壬基酚具有胞内吸收效应
四种微藻对np都具有胞内吸收作用，在培养24-h后检测出球形棕囊藻对np胞内吸收量为3.3±0.2-15.7±1.2×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸收量都在逐渐降低，在培养120-h后降低至0.6±0.0-3.7±0.7μg/cell。拟微绿球藻对np具有胞内吸收作用，在培养24h后检测出拟微绿球藻对np胞内吸收量为4.5±0.8-35.3±3.0×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸收量都在逐渐降低，在培养120-h后降低至1.7±0.2-22.2±0.5μg/cell。杜氏盐藻对np具有胞内吸收作用，在培养24h后检测出杜氏盐藻对np胞内吸收量为3.9±0.1-30.9±1.2×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸收量都在逐渐降低，在培养120-h后降低至0.9±0.0-25.3±3.7μg/cell。亚心形扁藻对np具有胞内吸收作用，在培养24-h后检测出亚心形扁藻对np胞内吸收量为1.3±0.3-20.2±1.2×10-8μg/cell，随着培养时间的延长，不同浓度处理组的藻细胞吸收量都在逐渐降低，在培养120h后降低至0.2±0.1-5.7±3.3μg/cell。
四种微藻对壬基酚具有生物降解效应
在培养120-h后，球形棕囊藻在低np浓度下比在高np浓度时表现出更强的生物降解作用和生物去除作用，在各处理浓度中，壬基酚浓度为0.5mg/l时生物降解率和生物去除率最高，分别为75.9％，78.19％。在各np浓度作用120-h后，球形棕囊藻对np的生物吸附率和生物吸收率都低于10％，并且生物吸附率和生物吸收率随np浓度的增加而降低。
在低浓度的np处理浓度中，拟微绿球藻在低浓度np作用下的生物降解速率和生物去除速率显著低于在高浓度的np(p<0.05)。拟微绿球藻对np的细胞吸收作用要高于吸附作用。当np浓度为0.5～1.5mg/l时，杜氏盐藻生物降解率和生物去除率随浓度增加而增加；当np浓度大于2.0mg/l时，np的杜氏盐藻对np的生物降解率显著降低(p<0.05)。在np作用120-h后，杜氏盐藻对np的生物吸附率低于3.4％，对np的生物吸收率低于3.5％。亚心形扁藻与球形棕囊藻表现出相同的生物降解趋势，都是在低np浓度下比在高np浓度时表现出更强的生物降解作用和生物去除作用。亚心形扁藻对壬基酚的生物降解作用和生物去除作用要比球形棕囊藻更强。
本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。