一种用于结直肠癌预后的血液或组织miRNA群体及其应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种与结直肠癌相关的血液或组织mirna群体及其应用；用于检测患者外周血或组织相关microrna表达，对患者生存期进行预测，具体涉及mirna在结直肠癌预后中的应用。
背景技术：
：结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其致死率在发达国家中位于第三位。在中国等发展中国家中,结直肠癌的发病率也呈逐年上升的趋势。目前全球结直肠癌患者的5年生存率可达到65％左右,但晚期患者的5年生存率仅在10％左右。近年来，随着对结直肠癌的研究逐渐深入，我们不断意识到肿瘤异质性的存在对于结直肠癌患者的治疗起到了重要指导作用，并且对肿瘤患者的预后有临床指导意义。而肿瘤干细胞的发现进一步证实了肿瘤内细胞异质性的存在。肿瘤干细胞是一类具有自我更新、多向分化潜能及高度恶性的细胞亚群,这部分细胞虽然只占肿瘤内的极少部分,但却是肿瘤发生、发展以及关系患者预后的关键细胞亚群。迄今发现的可标记结直肠癌干细胞的表面分子标记物有cd133+、aldh+、lgr5+和dclk1等。这些分子标记物的发现更便于我们对这类干细胞群体进行研究，从而对结直肠癌的发生、发展及预后进行更具有临床指导意义的探索。与此同时，近些年来，在消化道肿瘤的研究中，一些具有诊断和预后评价作用的分子标志物越来越受到关注。特别是微小rna(microrna，mirna)调控基因表达的研究兴起为探索消化道肿瘤的发生、发展提供了新的认识。微小rna(microrna，简称mirna)是一类短序列、非编码、具有调控功能的单链小分子rna，长约18-24nt。微小rna来源于长度约为1000bp的长链rna初始转录产物(pri-mirna)，pri-mirna分子在细胞核中经drosha酶剪切形成长度约60-80nt的具有茎环结构的mirna前体(pre-mirna)。mirna前体转运至胞质后，被进一步加工成mirna。微小rna在动植物细胞中通过对目标mrna的切割和转录抑制发挥重要作用。在众多疾病中，恶性肿瘤的mirna表达异常最受瞩目，研究显示超过50％的mirna编码序列定位于肿瘤相关的基因组区域，提示了mirna可能与肿瘤的发生、发展、演进密切相关，在细胞凋亡、增殖、分化、血管生成及肿瘤形成等方面均具有重要的调节作用，因此在肿瘤发生、发展中已经进行了许多mirna的鉴定。基于以上对结直肠癌近年来的研究及发现，我们从结直肠癌干细胞为视角出发，通过结直肠癌重要的干细胞标记物dclk1筛选出与结直肠癌发生、发展最为相关的一群mirna群体，从而对肿瘤患者的这群特定mirna群体进行血浆及组织的进一步检测研究。目前来看，既往多数研究还仅限于对单一mirna的探究，并且由于外周血mirna表达量相对组织明显降低，对于患者外周血mirna的表达研究还相对较少，很多研究只局限于组织样本的mirna检测。针对外周血的研究中，现有的研究手段主要是通过提取外周血的cdna，但由于血浆标本合成的cdna含量过低，一般研究采取预扩增的方法以提高效率，但该方法相对繁琐，因此很少有研究着点于患者外周血mirna的表达情况，针对mirna的群体研究相对较少，而针对单一mirna的研究又不足以充分体现其临床价值。综上所述，现有研究方法的主要缺点是：1、单一mirna的研究不足以具备充分的临床意义。2、组织样本的mirna检测对患者创伤性较大，需要进行病理切片检测，过程相对繁琐，患者接受性较差。结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，同时由于缺乏敏感而特异的无创性指标来进行早期诊断，主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、ct、核磁共振(mri)等，同时结合血清中的肿瘤标志物等因此通常在晚期才得以确诊，继而导致非常高的致死率，确诊后患者生存率低，病程周期长短不一，给患者家属带来非常大的心理经济压力，因此开发一种高敏感性和特异性的结直肠癌预后方法是亟待解决的问题。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于结直肠癌预后的血液或组织mirna群体，对mirna群体进行定量检测，并实现患者外周血或肿瘤组织的mirna检测。一种用于结直肠癌预后的血液或组织mirna群体，所述mirna是hsa-mir-99a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-mir-125b-5p、hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-532-3p、hsa-mir-200a-3p、hsa-mir-200b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-429、hsa-mir-425-3p、hsa-mir-218-5p、hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-192-5p、hsa-mir-194-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-141-3p的组合，其序列信息分布如seqidno.1-16所示。使用本发明的血液或组织mirna群体可以进行结直肠癌的预后判断，可预测患者临床预后，灵敏性和特异性均优于现有技术。本发明还提供了用于结直肠癌预后的血液或组织mirna群体在制备预测人类结直肠癌患者预后的芯片或试剂盒中的应用，所述mirna群体是hsa-mir-99a-5p、hsa-let-7c-5p、hsa-mir-125b-5p、hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-532-3p、hsa-mir-200a-3p、hsa-mir-200b-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-429、hsa-mir-425-3p、hsa-mir-218-5p、hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-192-5p、hsa-mir-194-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-141-3p的组合，其序列信息分布如seqidno.1-16所示。本发明还提供了一种芯片或试剂盒，所述芯片或试剂盒包括如上所述用于结直肠癌诊断的mirna群体，具体的，其中hsa-mir-99a-5p序列信息分布如seqidno.1所示、hsa-let-7c-5p序列信息分布如seqidno.2所示、hsa-mir-125b-5p序列信息分布如seqidno.3所示、hsa-mir-125b-1-3p序列信息分布如seqidno.4所示、hsa-mir-532-3p序列信息分布如seqidno.5所示、hsa-mir-200a-3p序列信息分布如seqidno.6所示、hsa-mir-200b-3p序列信息分布如seqidno.7所示、hsa-mir-200c-3p序列信息分布如seqidno.8所示、hsa-mir-429序列信息分布如seqidno.9所示、hsa-mir-425-3p序列信息分布如seqidno.10所示、hsa-mir-218-5p序列信息分布如seqidno.11所示、hsa-mir-218-1-3p序列信息分布如seqidno.12所示、hsa-mir-192-5p序列信息分布如seqidno.13所示、hsa-mir-194-5p序列信息分布如seqidno.14所示、hsa-mir-100-5p序列信息分布如seqidno.15所示、hsa-mir-141-3p序列信息分布如seqidno.16所示。优选的，所述芯片或试剂盒还包含qpcr反应常见的酶和试剂。具体来说，本发明解决技术问题的技术方案包括：采用qpcr进行差异表达mirna的验证，具体的操作步骤为：(1)通过tcga数据库，分析大量临床数据，得到与消化道肿瘤干细胞最为相关的mirna群体；结果见附图1。(2)针对筛选出的mirna群体，设计了mirna芯片，具体如附图2所示，其中各点位设计如下表1：表1，mirna芯片各点位设计(3)以pcr阵列技术为基础的mirna芯片方法检测了结直肠肿瘤患者血浆及组织中相关mirna的表达情况，并评估了其与结直肠癌患者(患者血浆/组织采集前均通过北京朝阳医院伦理委员会批准及患者知情同意)临床预后的关系，具体操作方法如下：a、血浆rna的提取取患者500ul血浆样本，通过mirneasyminikit(qiagen，217004)提取血浆中rna，方法如下：1、向血浆样本中加入700ulqiazol裂解溶剂，用枪吹打混匀；2、将上述混匀后溶液放置于室温(15℃-25℃)下5min；3、加入140ul氯仿，震荡混匀15s；4、室温下放置2-3min；5、4℃条件下，12000g离心15min；6、取离心后上清到新的1.5ml离心管中(过程中注意避免吸取到中下层溶液)，向其中加入500ul无水乙醇，并吹打混匀；7、将rneasymini过滤柱置于2ml收集管中，并向其中加入上述混合溶液700ul，室温下，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；8、将剩余液体同上述步骤，在过滤柱中过滤。9、向rneasymini过滤柱中加入700ulrwt缓冲液，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；10、向rneasymini过滤柱中加入500ulrpe缓冲液，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；11、再次向rneasymini过滤柱中加入500ulrpe缓冲液，8000g离心2min，倒掉收集管中废液；12、将rneasymini过滤柱置于新的1.5ml收集管中，向过滤柱滤膜上加入30-50ul的无rna酶水，8000g，1min条件下进行离心洗脱。nanodrop微量分光光度仪检测rna提取浓度。b、血浆rna反转录利用反转录试剂盒(qiagen，218161)，按照如下表2剂量配置反应体系：表2，反转录剂量配置其中，反转录程序为：37℃60min，95℃5min，4℃forever。将得到的20ulcdna样本稀释至100ul，即加80ulddh2o，置于1.5mlep管中；cdna-20℃冻存。c、qpcr1、配置总反应体系；每个样本配50个孔的体系，qpcr体系见表3。表3、qpcr反应体系配置表注：qpcrmix为premixextaqtm(tlirnasehplus)，takararr420a2、反应体系配置好后充分轻弹混匀，并适度离心。3、在我们设计的mirna芯片上用排枪加样，每孔10ul，全部加好后贴膜。离心机中离心1000g，3min。4、qpcr反应程序：95℃15min；(95℃30s，60℃3min)4循环；(95℃15s，60℃1min)40循环；meltcurve：65℃-95℃，increment0.5℃5s。(4)分析mirna的表达情况与患者预后的关系本发明的优点和有益效果如下：(1)通过临床大数据分析，筛选出与消化道肿瘤干细胞最为相关的特异mirna群体，有助于结直肠癌患者的预后的敏感性和特异性。(2)通过mirna芯片或试剂盒，对mirna群体进行定量检测，并实现患者外周血/组织的mirna检测，同时可预测患者临床预后，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1表示通过tcga数据库筛选mirna群体的结果图；图2表示含有mirna群体的芯片设计图；图3显示利用qpcr验证血液中mirna群体的表达情况，为正常人群血浆mirnaqpcr检测；图4显示利用qpcr验证血液中mirna群体的表达情况，为患者血浆mirnaqpcr检测；图5显示血浆mirna群体在结直肠癌患者和正常人的分布情况；图6显示利用qpcr验证组织中mirna群体的表达情况，为癌旁组织mirnaqpcr检测；图7显示利用qpcr验证组织中mirna群体的表达情况，为肿瘤组织mirnaqpcr检测；图8显示组织mirna群体在结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁组织的分布情况；图9a-图9h显示组织mirna的表达情况与患者预后的关系，其中图9a分别显示hsa-mir-100-5p、hsa-mir-99a-5p的表达与患者预后的关系、图9b分别显示hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-125b-5p的表达与患者预后的关系、图9c分别显示hsa-mir-141-3p、hsa-mir-192-5p的表达与患者预后的关系、图9d分别显示hsa-mir-194-5p、hsa-mir-200a-3p的表达与患者预后的关系、图9e分别显示hsa-mir-200b-3p、hsa-mir-200c-3p的表达与患者预后的关系、图9f分别显示hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-218-5p的表达与患者预后的关系、图9g分别显示hsa-mir-425-3p、hsa-mir-429的表达与患者预后的关系、图9h分别显示hsa-mir-532-3p、hsa-let-7c-5p的表达与患者预后的关系。具体实施方式下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1与人类结直肠癌相关的mirna的筛选一、样本的收集和样本资料的整理收集了北京朝阳医院肿瘤科110例结直肠癌患者血浆、14例结直肠癌患者的肿瘤组织样本，以及12例癌旁组织和38例健康体检中心正常人群血浆。患者均为结直肠癌中晚期病人，tnm分期为iii-iv期，于本科室接受化疗者。二、血浆rna的提取取患者500ul血浆样本，通过mirneasyminikit(qiagen，217004)提取血浆中rna，方法如下：1、向血浆样本中加入700ulqiazol裂解溶剂，用枪吹打混匀；2、将上述混匀后溶液放置于室温(15℃-25℃)下5min；3、加入140ul氯仿，震荡混匀15s；4、室温下放置2-3min；5、4℃条件下，12000g离心15min；6、取离心后上清到新的1.5ml离心管中(过程中注意避免吸取到中下层溶液)，向其中加入500ul无水乙醇，并吹打混匀；7、将rneasymini过滤柱置于2ml收集管中，并向其中加入上述混合溶液700ul，室温下，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；8、将剩余液体同上述步骤，在过滤柱中过滤。9、向rneasymini过滤柱中加入700ulrwt缓冲液，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；10、向rneasymini过滤柱中加入500ulrpe缓冲液，8000g离心15s，倒掉收集管中废液；11、再次向rneasymini过滤柱中加入500ulrpe缓冲液，8000g离心2min，倒掉收集管中废液；12、将rneasymini过滤柱置于新的1.5ml收集管中，向过滤柱滤膜上加入30-50ul的无rna酶水，8000g，1min条件下进行离心洗脱。nanodrop微量分光光度仪检测rna提取浓度。三、血浆rna反转录利用反转录试剂盒(qiagen，218161)，反转录程序为：37℃60min，95℃5min，4℃forever。将得到的20ulcdna样本稀释至100ul，即加80ulddh2o，置于1.5mlep管中；cdna-20℃冻存。四、qpcr1、配置总反应体系；2、反应体系配置好后充分轻弹混匀，并在适度离心。3、在我们设计的mirna芯片上用排枪加样，每孔10ul，全部加好后贴膜。离心机中离心1000g，3min。4、qpcr反应程序：95℃15min；(95℃30s，60℃3min)4循环；(95℃15s，60℃1min)40循环；meltcurve：65℃-95℃，increment0.5℃5s。五、结果上述实验结果见图1、图3、图4、图5所示。其中，由附图1可知，通过tcga等数据库分析，表明在结肠癌、直肠癌、胰腺癌、食管癌及胃癌中，dclk1的表达量高低与肿瘤相关mirna的表达具有一定相关性。图3结果可知，通过利用qpcr验证血液中mirna群体的表达情况，对正常人群血浆mirna进行qpcr检测。图4结果可知，通过利用qpcr验证血液中mirna群体的表达情况，对结直肠癌患者血浆mirna进行qpcr检测；图5结果可知，mirna群体在结直肠癌患者和正常人的分布表达明显不同。取14例结直肠癌患者术中肿瘤组织，取0.5cmx0.5cm大小的组织，利用trizol法提取rna，随后反转录为cdna，在mirna芯片上进行mirna的表达量测定。以患者mirna表达量的中位数为临界值，将每个mirna分为高表达和低表达两组，再分析其与患者预后的关系。trizol法提rna方法：1、均质化样品：将肿瘤组织至于1.5mlep管内，利用组织研磨器，将肿瘤组织在冰上研磨，直至肿瘤组织裂解，加1mltrizol/管，室温静置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。2、相分离(1)加入氯仿200ul/1mltrizol，小心盖紧，用手震荡15s。(2)室温静置5min，14000rpm4℃离心15min。3、rna沉淀(1)取上清(300-450ul)至新1.5mlep管，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min或于-20℃沉淀至少2h(过夜更佳)(2)14000rpm于4℃离心10min，总rna在管底白色沉淀中。(弃上清，枪吸净，小心移除异丙醇)4、rna洗涤(1)加入1ml75％乙醇(madebynon-rnasewater)洗涤rna沉淀，离心7500g4℃离心5min；此步骤重复2次(2)吸干上清，干燥5-10min。5、rna再溶解：用无rnase的ddh2o20ul(20-50ul可适当增减用量)溶解rna沉淀；6、测浓度：离心混匀，以无rnase水作空白对照。260/280测rna浓度7、保存：-70℃以下保存rna反转录：(利用takararr047a反转录试剂盒)1、去除基因组dna反应：按如下成分于冰上配制反应混合液42℃2min；4℃forever。2、反转录反应反应液在冰上配制试剂使用量上一步反应液10ulprimescriptrtenzymemixi1ulrtprimermix1ul5xprimescriptbuffer24ulrnasefreedh2o4.ultotal20ul37℃15min；85℃5sec；4℃forever。实验结果见图6、图7、图8、图9所示。其中图6结果可知，通过利用qpcr验证组织中mirna群体的表达情况，对癌旁组织mirna进行qpcr检测；图7结果可知，通过利用qpcr验证组织中mirna群体的表达情况，对结直肠癌患者肿瘤组织mirna进行qpcr检测；图8结果可知，mirna群体在结直肠癌患者肿瘤组织和正常癌旁组织的分布表达明显不同。图9a-图9g显示患者肿瘤组织mirna的表达情况与患者预后的关系，其中图9a分别显示hsa-mir-100-5p、hsa-mir-99a-5p的表达与患者预后的关系、图9b分别显示hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-125b-5p的表达与患者预后的关系、图9c分别显示hsa-mir-141-3p、hsa-mir-192-5p的表达与患者预后的关系、图9d分别显示hsa-mir-194-5p、hsa-mir-200a-3p的表达与患者预后的关系、图9e分别显示hsa-mir-200b-3p、hsa-mir-200c-3p的表达与患者预后的关系、图9f分别显示hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-218-5p的表达与患者预后的关系、图9g分别显示hsa-mir-425-3p、hsa-mir-429的表达与患者预后的关系、图9h分别显示hsa-mir-532-3p、hsa-let-7c-5p的表达与患者预后的关系。由上述结果可知，患者肿瘤组织中的hsa-mir-99a-5p、hsa-mir-125b-5p、hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-532-3p、hsa-mir-200a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-429、hsa-mir-218-5p、hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-192-5p、hsa-mir-194-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-141-3p的表达情况与癌旁组织相应mirna表达具有统计学差异，通过mirna表达比较肿瘤患者的生存期与正常人群的生存期，统计学也具有明显差异，可进行患者预后判断。表明高表达hsa-mir-99a-5p、hsa-mir-125b-5p、hsa-mir-125b-1-3p、hsa-mir-532-3p、hsa-mir-200a-3p、hsa-mir-200c-3p、hsa-mir-429、hsa-mir-218-5p、hsa-mir-218-1-3p、hsa-mir-192-5p、hsa-mir-194-5p、hsa-mir-100-5p、hsa-mir-141-3p的患者预后较低表达患者的预后差。可以看出除mirna7c-5p、mirna425-3p、mirna200b-3p外，其余mirna的表达量均与患者预后具有明显相关性。上述实施例只是发明的例示，不应当以说明书及附图的例示性实施例描述限制专利权的保护范围。上面结合附图对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。当前第1页12