高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法。

背景技术：

乳酸链球菌素(nisin)是在乳酸乳球菌发酵过程中产生的一种天然防腐剂和抑菌剂，被广泛的应用于医疗、食品保护等行业中。nisin的抑菌作用对nisin生产菌自身也会产生影响，在发酵过程中nisin的不断积累以及菌株有限的nisin耐受能力，限制了nisin生产菌乳酸乳球菌的正常生长，从而影响了nisin产量的提高。因此，建立新的菌株改造方法提高nisin耐受能力对进一步提高nisin产量具有重要意义。

nisin生产菌主要通过表达nisin免疫系统中的nisin免疫蛋白nisi来免疫自身合成的nisin。nisi是一种脂蛋白，成熟nisi锚定在细胞膜上，从两个方面阻止nisin分子接触细胞膜。一是nisi可以与nisin结合从而保护nisin生产菌；二是当乳酸乳球菌菌液中含有高浓度nisin时，nisi可以协助细胞聚集成簇，从而阻止nisin接触细胞膜。已有研究表明在乳酸乳球菌中过表达nisi蛋白可以提高菌株的nisin耐受性和nisin产量。

在乳酸乳球菌中，脂蛋白的生物合成途径可以分为两步：(1)磷脂酰甘油转移酶(lipoproteindiacylglyceryltransferase，lgt)催化转移乙二酰基到+1位的保守半胱氨酸残基上，同时形成硫醚键。(2)当脂蛋白前体穿过细胞膜的时候，脂蛋白信号肽酶(lipoproteinsignalpeptidaseii，lspa)识别由乙二酰基修饰的脂蛋白信号肽，并在保守序列的保守切割位点(-1位氨基酸和+1位脂质修饰的半胱氨酸之间)将信号肽切除，在成熟脂蛋白的n末端保留由脂质修饰了的半胱氨酸(如图1所示)。在革兰氏阳性菌中，lspa对不同脂蛋白功能和定位的影响不同，其对nisi成熟过程的影响尚未有相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌。

本发明的第二个目的是提供第二种高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌。

本发明的第三个目的是提供高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌的构建方法。

本发明的第四个目的是提供第二种高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌的构建方法。

本发明的技术方案概述如下：

高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌的构建方法，包括如下步骤：

在乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)yf11保藏编号cgmccno.12429中导入脂蛋白信号肽酶基因lspa，得到重组乳酸乳球菌yf11-lspa，所述脂蛋白信号肽酶基因lspa的核苷酸序列用seqidno.1所示。

上述方法构建的重组乳酸乳球菌。

第二种高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)在乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)yf11保藏编号cgmccno.12429中导入脂蛋白信号肽酶基因lspa，得到重组乳酸乳球菌yf11-lspa，所述脂蛋白信号肽酶基因lspa的核苷酸序列用seqidno.1所示；

(2)在重组乳酸乳球菌yf11-lspa中导入脂蛋白基因nisi，得到重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi，所述脂蛋白基因nisi的核苷酸序列用seqidno.2所示。

上述方法构建的第二种重组乳酸乳球菌。

本发明的优点：

本发明的重组乳酸乳球菌，通过强化nisin抗性蛋白nisi的合成提高了nisin生产菌的nisin耐受能力，从而减少了发酵过程中nisin对菌株生长的抑制，进而提高了nisin的产量，也为未来通过提高菌株nisin耐受性的方式提高nisin产量开阔了思路。乳酸乳球菌乳亚种yf11中单独过表达脂蛋白信号肽酶lspa可明显提高了乳酸乳球菌乳亚种yf11的nisin产量。共表达lspa和nisi进一步提高了乳酸乳球菌乳亚种yf11的nisin产量和nisin耐受能力，可用于nisin工业生产。

附图说明

图1为革兰氏阳性菌中脂蛋白生物合成过程示意图。

图2为本发明实施例2提供的重组乳酸乳球菌发酵结果：

其中：

a-1为lspa基因的导入对于乳酸乳球菌乳亚种yf11菌体量的影响；

a-2为lspa基因的导入对于乳酸乳球菌乳亚种yf11nisin产量的影响；

b-1为lspa和nisi基因的串联导入对于乳酸乳球菌乳亚种yf11菌体量的影响；

b-2为lspa和nisi基因的串联导入对于乳酸乳球菌乳亚种yf11nisin产量的影响。

图3为乳酸乳球菌乳亚种yf11和重组乳酸乳球菌的nisin耐受实验结果：

其中：

a-1为nisin浓度为8000iu/ml的液体种子培养基中各个菌株的生长情况；

a-2为nisin浓度为12000iu/ml的液体种子培养基中各个菌株的生长情况；

a-3为nisin浓度为16000iu/ml的液体种子培养基中各个菌株的生长情况；

b-1为nisin浓度为12000iu/ml的固体种子培养基上各个菌株的生长情况；

b-2为nisin浓度为20000iu/ml的固体种子培养基上各个菌株的生长情况。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明使用的大肠杆菌tg1为市售。

本发明使用的乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)yf11保藏编号cgmccno.12429，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101，保藏日期为2016年5月10日。

本发明中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中使用的质粒小提试剂盒(离心柱型)，dna纯化回收试剂盒(离心柱型)，细菌基因组dna提取试剂盒(离心柱型)等操作均按照试剂盒中的说明书进行。实施例1

高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌的构建方法

1构建含有脂蛋白信号肽酶基因lspa的质粒

1)根据在乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)yf11保藏编号cgmccno.12429(简称yf11)的基因组人工设计构建脂蛋白信号肽酶lspa和脂蛋白nisi基因特异性扩增引物：

lspaf：cccaagcttaaactgttctagcgagctatc(seqidno.3)

lspar：cgcggatccatgttaaataaaactttctgtcag(seqidno.4)

nisif：cgcggatcccttattggagacaagcactgtta(seqidno.5)

nisir：catgccatggctagtttcctaccttcgttgc(seqidno.6)

利用引物lspaf(seqidno.3)与lspar(seqidno.4)，以yf11的dna基因组为模板，进行聚合酶链式反应扩增出脂蛋白信号肽酶基因片段，并用dna纯化回收试剂盒进行纯化回收以备用。

利用引物nisif(seqidno.5)与nisir(seqidno.6)，以yf11的dna基因组为模板，进行聚合酶链式反应扩增出脂蛋白nisi基因片段，并用dna纯化回收试剂盒进行纯化回收以备用。

2)将质粒pleb124(湖南丰晖生物科技有限公司)与步骤1)中的脂蛋白信号肽酶基因片段lspa用限制性内切酶bami与hindiii酶切后，再用t4dna连接酶进行连接，构建含有脂蛋白信号肽酶基因片段的质粒p1。

3)取50μl大肠杆菌tg1接种于50ml液体lb培养基中37℃，180r/min过夜。回收菌体，加入预冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2的水溶液(cacl2和mgcl2浓度分别为80mmol/l20mmol/l)重悬细胞，离心回收，加入预冷的含15％甘油的0.1mol/lcacl2水溶液(配制方法：称取0.56gcacl2溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml)，重悬细胞，分装，得到tg1感受态细胞。

4)将构建的质粒p1化学转化至tg1感受态细胞后，用无菌玻璃涂布棒将菌液在倒有固体lb培养基(加入200μg/ml的红霉素)的平板上涂布均匀，用菌落pcr进行筛选，其中能扩增出1000bp左右条带的为正确菌株，并将该菌株的质粒重提。其中菌落pcr的验证引物序列为：

generalf：tgaaacgtattactgaagggaa(seqidno.7)

generalr：attcattctgctaaccagtaagg(seqidno.8)

2.构建含有脂蛋白信号肽酶基因lspa、nisin抗性基因nisi的重组质粒

1)将质粒p1与基因片段nisi用限制性核酸内切酶bamhi和ncoi进行双酶切，再用t4连接酶进行连接，构建出含有脂蛋白信号肽酶编码基因lspa和脂蛋白编码基因nisi的重组质粒p2；

2)将构建的重组质粒p2化学转化至tg1感受态细胞后，将菌体涂至含有红霉素浓度为200μg/mllb固体平板，用菌落pcr筛选，其中能扩增出2000bp左右条带的为正确的菌株，并将该菌株的重组质粒p2重提。用引物generalf(seqidno.7)和generalr(seqidno.8)进行菌落pcr验证。

3构建高产nisin的重组乳酸乳球菌

1)将yf11接种于液体种子培养基中活化3代培养，第3代接入二级培养基培养6小时后，加入氨苄霉素，使其浓度为20μg/ml，继续30℃培养1小时，富集菌体后，用电转化洗液对菌体进行重悬反复3次，得到yf11感受态，并分装。

2)将重组质粒p1、p2分别电转进yf11感受态，用液体种子培养基复苏3小时后再含有红霉素浓度为10μg/ml的固体种子培养基平板上涂板筛选，用引物generalf(seqidno.7)和generalr(seqidno.8)进行菌落pcr筛选，其中能扩增出1000bp左右条带的为重组乳酸乳球菌yf11-lspa(重组乳酸乳球菌yf11-lspa)，能扩增出2000bp左右条带的为重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi(重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi)。

液体lb培养基(％)：蛋白胨10，酵母粉5，nacl10，调节ph值至7.2，121℃灭菌20min；

固体lb培养基(％)：蛋白胨10，酵母粉5，nacl10，琼脂粉1.5，调节ph值至7.2，121℃灭菌20min；

液体种子培养基(％)：酵母粉1.5，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾2，蔗糖1.5，nacl0.15，mgso4·7h2o0.015，ph7.2，121℃灭菌20min；

固体种子培养基(％)：酵母粉1.5，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾2，蔗糖1.5，nacl0.15，mgso4·7h2o0.015，琼脂粉1.5，ph7.2，121℃灭菌20min；

二级培养基(％)：酵母粉1.5，蛋白胨1.5，kh2po42，nacl0.15，mgso40.015，定容至78.154ml，121℃灭菌20min。在无菌条件下加入0.5g/ml的蔗糖6.846ml，0.1g/ml甘氨酸15ml。

实施例2发酵实验

1、发酵过程

将构建成功的重组乳酸乳球菌yf11-lspa、重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi与对照yf11按接菌量为1％，5％，5％分别接入液体种子培养基中按24小时，12小时，8小时传三代，将第三代的菌液按5％的接种量转接至发酵培养基中，培养条件为30℃静置培养，每2小时取样，取3ml用紫外分光光度计检测od600，用ph计检测发酵液ph；取500ul于0.02mol/l的盐酸中煮沸，用于后续检测nisin产量。

发酵培养基(％)：酵母膏1.5，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾2，蔗糖2，玉米浆0.3，半胱氨酸0.26，nacl0.15，mgso4·7h2o0.015，115℃灭菌30min。

3、抑菌圈法检测nisin效价

1)制备nisin效价检测平板

用2ml生理盐水洗下藤黄八叠球菌菌液，加入6ml生理盐水中，将70℃的nisin效价检测培养基中加入390微升的吐温-20，摇匀冷却至50℃后加入藤黄八叠球菌菌液，倒板，4℃放置过夜。

2)检测发酵液中的nisin效价

将nisin效价检测平板均匀打孔，加标准样，加样品，放置于37℃培养，用游标卡尺量抑菌圈，通过标准曲线，检测相应发酵液的nisin效价。

nisin效价检测培养基(％)：胰蛋白胨0.8％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钠0.2％，酵母粉0.25％，nacl0.5％，琼脂粉1.5％，115℃灭菌30min。

4、结果

最终的发酵结果表明，采用本发明的重组乳酸乳球菌yf11-lspa的菌体生物量和生长趋势与原始菌株基本相同，而nisin产量较原始菌株提高了约28％(如图2(a-1)和图2(a-2)所示)。重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi的菌体生物量和生长趋势与原始菌株基本相同，而nisin产量较原始菌株提高了约37％(如图2(b-1)和图2(b-2)所示)。

实施例3nisin耐受实验

1、nisin耐受实验过程

1)含不同nisin浓度的液体种子培养基中的耐受实验

将构建成功的重组乳酸乳球菌yf11-lspa、重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi与对照yf11按接菌量为1％，5％，5％接入液体种子培养基中按24小时，12小时，8小时传三代，将第三代的菌液按5％的接种量转接至nisin浓度的液体种子培养基中，培养条件为30℃静置培养，每3小时取样，取3ml用紫外分光光度计检测od。

2)含不同nisin浓度的固体种子培养基中的耐受实验

将构建成功的重组乳酸乳球菌yf11-lspa、重组乳酸乳球菌yf11-lspa-nisi与对照yf11按接菌量为1％，5％，5％接入液体种子培养基中按24小时，12小时，8小时传三代，将第三代的菌液按5％的接种量转接至新鲜无菌的液体种子培养基中静置培养至8小时，用生理盐水将菌体稀释至10^-8，取各个稀释梯度菌液10ul点于不同nisin浓度的固体种子培养基平板上，培养30h。

3、结果

如图3(a-1)所示，当菌株在nisin浓度为8000iu/ml的液体种子培养基培养至12h时，原始菌株yf11的od600达到0.8，而过表达了lspa以及串联表达了lspa和nisi基因的菌株生物量均明显高于原始菌株，分别为3.5和3.27。可以看出在nisin浓度较低的情况下，lspa和nisi基因串联表达对yf11的nisin耐受性的提高不如单独表达lspa基因。但是随着液体种子培养基中nisin浓度的增高，lspa和nisi基因串联表达在菌株nisin耐受性方面发挥的作用越来越明显。特别是当菌株在nisin浓度为16000iu/ml的液体种子培养基培养至12h时，原始菌株yf11和单独表达lspa菌株的生物量都没有增长，而串联表达lspa和nisi菌株的生物量较6h时增长了一倍。

如图3(b-1)所示，当固体种子培养基中nisin浓度为12000iu/ml时，原始菌株的存活率是过表达lspa以及串联表达了lspa和nisi基因菌株的存活率并没有明显高于原始菌株。但是当固体种子培养基中nisin浓度达到20000iu/ml时，原始菌株和过表达lspa基因菌株的存活率基本相当，而串联表达lspa和nisi基因菌株的存活率达到最高，大约是原始菌株的100倍。实验结果表明各个菌株在不同nisin浓度的固体种子培养基平板的生长情况与它们在不同nisin浓度的液体种子培养基的生长情况一致。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

8条序列：

seqidno：1

lspa

geneid：1114628

sequence：nc_002662.1

乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)

atgaaaaaactactgtcacttgttattatcgttgtcggaattgttgctgaccaaatttttaaaaattggattgttgctaatattcagcttggagatacagaaaaaatttggcctaatgttcttagtttaacttatatcaaaaatgatggagcagcttggtcttcattttcaggtcaacaatggtttttccttgtcttaacaccgatcgtcttagttgttgccctttggtttttatggaaaaaaatggcacaaaactggtattttattggattaactttaattattgcgggtgctttgggaaattttattgaccgaattcgtcaaggatttgttgttgatatgttccaaactgaatttattaattttccaatttttaatattgcggatatcttattatctgttggttttgttcttcttttcattgcaattttgacagacaaagaaacaaaataa

seqidno：2

nisi

geneid：2828059

乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)

atgagaaaatatttaatacttattgtggccttaatagggataacaggtttatcagggtgttatcaaacaagtcaaaaaaaggtgaggtttgacgaaggaagttatactaattttatttatgataataaatcgtatttcgtaactgataaggagattcctcaggagaacgttaacaattgcaaagtaaaattttataacctgttgattgttgacatgaaaagtgagaaacttttatcaagtagcaacaaaaatagtgtgactttggtcttaaataatatttatgaggcttctgacaagtcgctatgtatgggtattaacgacagatactataagatacttccagaaagtgataagggggtggtcaaagctttgagattacaaaactttgatgtgacaagcgatatttctgatgataattttgttattgataaaaatgattcacgaaaaattgactatatgggaaatatttacagtatatcggacaccaccgtatctgatgaagaattgggagaatatcaggatgttttagctgaagtacgtgtgtttgattcagttagtggcaaaagtatcccgaggtctgaatgggggagaattgataaggatggttcaaattctaaacagagtaggacggaatgggattatggcgaaatccattctattagaggaaaatctcttactgaagcatttgccgttgagataaatgatgattttaagcttgcaacgaaggtaggaaactag

lspaf：cccaagcttaaactgttctagcgagctatc(seqidno.3)

lspar：cgcggatccatgttaaataaaactttctgtcag(seqidno.4)

nisif：cgcggatcccttattggagacaagcactgtta(seqidno.5)

nisir：catgccatggctagtttcctaccttcgttgc(seqidno.6)

generalf：tgaaacgtattactgaagggaa(seqidno.7)

generalr：attcattctgctaaccagtaagg(seqidno.8)

序列表

<110>天津大学

<120>高产乳酸链球菌素的重组乳酸乳球菌及构建方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>453

<212>dna

<213>乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)

<400>1

atgaaaaaactactgtcacttgttattatcgttgtcggaattgttgctgaccaaattttt60

aaaaattggattgttgctaatattcagcttggagatacagaaaaaatttggcctaatgtt120

cttagtttaacttatatcaaaaatgatggagcagcttggtcttcattttcaggtcaacaa180

tggtttttccttgtcttaacaccgatcgtcttagttgttgccctttggtttttatggaaa240

aaaatggcacaaaactggtattttattggattaactttaattattgcgggtgctttggga300

aattttattgaccgaattcgtcaaggatttgttgttgatatgttccaaactgaatttatt360

aattttccaatttttaatattgcggatatcttattatctgttggttttgttcttcttttc420

attgcaattttgacagacaaagaaacaaaataa453

<210>2

<211>738

<212>dna

<213>乳酸乳球菌乳亚种(lactococcuslactissubsp.lactis)

<400>2

atgagaaaatatttaatacttattgtggccttaatagggataacaggtttatcagggtgt60

tatcaaacaagtcaaaaaaaggtgaggtttgacgaaggaagttatactaattttatttat120

gataataaatcgtatttcgtaactgataaggagattcctcaggagaacgttaacaattgc180

aaagtaaaattttataacctgttgattgttgacatgaaaagtgagaaacttttatcaagt240

agcaacaaaaatagtgtgactttggtcttaaataatatttatgaggcttctgacaagtcg300

ctatgtatgggtattaacgacagatactataagatacttccagaaagtgataagggggtg360

gtcaaagctttgagattacaaaactttgatgtgacaagcgatatttctgatgataatttt420

gttattgataaaaatgattcacgaaaaattgactatatgggaaatatttacagtatatcg480

gacaccaccgtatctgatgaagaattgggagaatatcaggatgttttagctgaagtacgt540

gtgtttgattcagttagtggcaaaagtatcccgaggtctgaatgggggagaattgataag600

gatggttcaaattctaaacagagtaggacggaatgggattatggcgaaatccattctatt660

agaggaaaatctcttactgaagcatttgccgttgagataaatgatgattttaagcttgca720

acgaaggtaggaaactag738

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cccaagcttaaactgttctagcgagctatc30

<210>4

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgcggatccatgttaaataaaactttctgtcag33

<210>5

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cgcggatcccttattggagacaagcactgtta32

<210>6

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

catgccatggctagtttcctaccttcgttgc31

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tgaaacgtattactgaagggaa22

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

attcattctgctaaccagtaagg23