一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因RsAN1及其应用的制作方法

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因rsan1及其应用。

背景技术：

胭脂萝卜也称红心萝卜，是重庆市涪陵区的特色一个地方品种，由于其肉质根从表皮到内部通红，含有丰富的花青苷而闻名。其肉质酥脆，适宜加工各种萝卜制品，用做泡菜久泡不烂，鲜红嫩脆。重庆的涪陵、武隆、南川等县是胭脂萝卜的主要产区，已有100余年的种植历史。胭脂萝卜相对其他红心萝卜品种花青苷含量高，在重庆地区，常从胭脂萝卜中提取花青苷作为天然着色剂。但是其他省、市引种，由于土壤、气候原因，效果均不佳。由于影响其积累花青素的机制还不清楚，极大地限制了胭脂萝卜的生产及推广。前期研究表明，植物花青素的生物合成调控主要在转录水平，myb和bhlh转录因子对花青素生物合成起着非常重要的调控作用，影响着花青素的积累水平。胭脂萝卜花青素的大量积累是否也受到这两类转录因子的调控，目前还不清楚。

国内外的研究表明，花青苷合成主要通过调控花青苷合成代谢过程中结构基因的表达，从而使合成代谢过程中的酶的合成受到影响。目前已经被公认的有三类调节花青苷合成的转录因子，分别是r2r3-myb、bhlh(basichlix-loop-hlix)和wd40，它们相互作用共同调节着花青苷的生物合成。

植物的myb转录因子是一个非常大的家族，它们调控着植物的次生代谢过程。myb类转录因子以其结构上都有一段保守的dna结合区结构域而得名。以dbd(dnabindingdomain)最为保守，一般包含1-3个不完全重复序列r(repeat)，每个重复片段r由51-52个保守的氨基酸残基和间隔序列组成。在r3区域包含有一个典型的结构域[d/e]lx2[r/k]x3lx6lx3r，被称为bhlhmotif，它是能与bhlh一类蛋白相互作用的区域；c端有一个motif6的结构域[r/k]px[p/a/r]xx[f/y]。拟南芥中至少有154个myb组成庞大的转录因子家族，这个家族由25个亚族组成。这些转录因子在调控次生代谢，控制细胞形态，介导病原抗性，应答激素信号等方面有十分重要的作用，参与拟南芥花青苷生物合成转录调控的pap1和pap2属于第6亚族。近来研究显示参与花青苷合成转录调控相关的myb主要属于r2r3-myb类。

虽然前人也有报道红萝卜中花青苷生物合成相关的调控基因myb，但是一般情况下均是在烟草拟南芥等模式植物中表达分析基因的功能，且单独表达myb基因时花青苷积累量不大。至今还未有胭脂萝卜中花青苷生物合成调控基因的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供了一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因rsan1(anthocyanin1)及其应用，提供了胭脂萝卜中花青苷含量调控的关键基因，为胭脂萝卜积累大量花青苷的遗传改造提供了新的基因资源。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因rsan1，其核苷酸序列如seqidno.1所示；其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。

一种重组表达载体，其特征在于，包括所述的rsan1的核苷酸序列。

一种包含所述重组表达载体的植物细胞系或植物转化体。

所述基因rsan1在调控草本植物花青苷合成中的应用。

一种高含量花青苷胭脂萝卜的培育方法，包括以下步骤：

1)取胭脂萝卜肉质根提取总rna，再以总rna为模板通过反转录合成第一链cdna；

2)以步骤1)得到的cdna为模板，以seqidno3和seqidno4所示核苷酸序列为引物进行扩增，得到的pcr扩增产物的核苷酸序列如seqidno.1所示，并将pcr扩增产物连入表达载体中构建重组表达载体；

3)将构建的重组表达载体转化至农杆菌gv3101后，再用所述农杆菌gv3101对胭脂萝卜进行侵染转化后，培养4～5天，即得到高含量花青苷胭脂萝卜。

进一步，所述表达载体为peaq-ht。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次鉴定了胭脂萝卜中花青苷生物合成的关键myb转录因子rsan1，rsan1的表达量与胭脂萝卜花青苷含量成正相关关系。证明胭脂萝卜基因rsan1是花青苷的正调控因子，为胭脂萝卜和其它植物的进一步改良提供优秀基因资源。

2、本发明通过对胭脂萝卜rsan1基因的克隆、序列分析和植株转染，得到瞬时超表达rsan1的胭脂萝卜,4～5天后其叶片和子叶中均能合成和积累大量花青苷，而野生型的胭脂萝卜叶片和子叶并不能合成花青苷。说明在胭脂萝卜中单独过表达rsan1基因后，能显著的提高花青苷的积累量。为研究胭脂萝卜的品种培育等提供理论依据和材料。并且本发明中rsan1基因普遍适用于草本植物，为调控草本植物的花青苷提供了一种有效的技术手段，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为pcr扩增得到rsan1片段的电泳图；

m为dnamarker；a为rsan1基因开放阅读框片段；

图2为胭脂萝卜rsan1推导的氨基酸序列的结构分析图；

图3为胭脂萝卜rsan1的氨基酸序列与其它植物的myb蛋白的进化分析图；

图4为rsan1在野生型胭脂萝卜植株在不同部位的表达水平；

图5为胭脂萝卜叶片和子叶上花青苷的含量；

a和c为瞬时转化rsan1的子叶和叶片，b和d为阴性对照组的子叶和叶片。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

下述实施例中所采用的胭脂萝卜‘红心1号’，由重庆市涪陵绿原农业科技发展公司提供；大肠杆菌dh5α和农杆菌gv3101从上海唯地生物技术有限公司购买，表达载体peaq-ht为实验室保存。

1×tbe缓冲液、6×loadingbuffer、goldview^tm核酸染料、rnase抑制剂、dntpmix、amv反转录酶、mgcl2、dna聚合酶和琼脂糖购自上海生物工程有限公司。所用其他原料如无特殊说明，即为普通市售。

实施例1胭脂萝卜基因rsan1的克隆及表达载体构建

(1)胭脂萝卜总rna的提取及检测

胭脂萝卜总rna的提取采用北京艾德莱生物科技有限公司植物rna提取试剂盒(具体方法参照说明书)。用dnasei(takara)处理总rna中残留的dna，具体方法参照说明书。用核酸蛋白仪上测定rna的浓度测定和纯度。

吸取2μlrna在1.5％琼脂糖凝胶电泳上进行检测，提取的rna的od260/od280的比值均介于1.80～2.00，完整性较好，可以用于反转录。

(2)第一链cdna的合成

以提取胭脂萝卜的总rna为模板，利用mlv-reversetranscriptase试剂盒(invitrogen公司)合成cdna第一链，具体操作均按试剂盒说明书进行。

在离心管中配制按照下列模板rna/引物的顺序配制混合物(6μl)：模板rna2μl，oligo(dt)primer3μl，rnase-freeddh2o1μl。在pcr仪上，70℃保温10min，后迅速将其置于冰上急速冷却2min以上。离心数秒，得到模板rna/引物的变性溶液。

配制反转录反应液(10μl)：模板rna/引物的变性溶液6μl，5×m-mlvbuffer2μl，dntpmixture(10mm)0.5μl，rnaseinhibitor0.25μl，rtasem-mlv0.5μl，nase-freedh2o0.75μl。pcr仪上，42℃保温1h。pcr仪中，70℃保温15min，然后置于冰上冷却，得到cdna溶液。

(3)基因rsan1的克隆

利用其它物种的myb基因序列进行blast同源比对。设计相应引物rsan1–f和rsan1-r，具体如下：

rsan1-f：5’-atggagggttcgtccaaagg-3’

rsan1-r：5’-ctaatcaagttcaacagtctctcc-3’

以得到的cdna为模板，采用primescript^tmrt-pcrkit(takara公司)进行pcr扩增反应。

pcr扩增体系(50μl)为：5μl10×pcrbuffer，2μldntpmixture0.5μlrsan1–f(正向引物)，0.5μlrsan1-r(反向引物)，3μlcdna模板，39μlnuclease-freewater。

pcr程序：98℃5min；98℃30s，57℃30s，72℃1min40s，35个循环；72℃7min。

pcr反应结束后，取少量pcr产物(2μl左右)进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。

从图1可以看出，pcr扩增得到的片段大小在800bp左右。用dna凝胶回收试剂盒(agarosegeldnapurificationkit，takara公司)回收目的片段进行回收，回收方法基本参照试剂盒说明书上的步骤进行。

根据回收产物片段大小及其有效浓度，取适量回收纯化的产物与克隆载体连接，载体选用pmd19-t载体(takara)，目的dna与克隆载体的摩尔比控制在3：1左右。

连接体系：1μlpmd19-tvector，4μl纯化后的dna，5μlligationsolutioni。混合均匀后在16℃下恒温过夜连接。

将感受态细胞dh5α从-80℃取出放置于冰中融化，取2μl连接产物加入到含有50μl感受态细胞的离心管中，冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴3min以上，加入37℃不含抗生素的lb液体培养基800μl，在37℃下200rpm振荡培养1h。然后在4000rpm下离心2min，弃900μl上清，用枪头将剩余液体悬浮沉淀并混匀，取适量转化液铺板于已涂好x-gal/iptg的lb固体平板培养基(含有100μgml^-1的amp)上，封板后在37℃恒温箱中倒置培养过夜，通过x-gal/iptg蓝白斑筛选白色菌落，并通过菌液pcr检测后选取正确的克隆到深圳华大基因科技有限公司进行测序验证。

(4)序列分析

利用expasy在线分析工具pi/mw(http://www.expasy.ch/tools/dna.html)对lcmyb1基因编码的蛋白质进行氨基酸分析。结果如图2所示，rsan1与来自其它植物的myb转录因子相比，都具有一个相对保守的r2r3结构域，在r3结构域上含有一个与bhlh转录因子相互作用的位点。整体而言，该蛋白的n端部分与其他蛋白的同源性较高，但是c端变异较大。

利用mega5.0软件进行不同物种间同源基因的氨基酸序列比对并构建系统进化树，结果而如图2和图3所示，rsan1与拟南芥atpap1和atpap2的关系较近。

(5)构建重组表达载体

用agei和xhoi双酶切处理表达载体peaq-ht，酶切结束后，根据takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收表达载体peaq-ht大片段。再将正确序列的rsan1用agei和xhoi双酶切处理，然后利用gibson组装技术连接，最后将连接产物转化大肠杆菌dh5a，从含有卡纳霉素(100mg/l)的筛选lb培养板上挑取阳性克隆并进行pcr检测及测序验证，即得到重组表达载体peaq-rsan1。

其中，单酶切体系为：peaq-ht或19t-rsan1质粒5μl；agei1μl；xhoi1μl；buffer2μl；无菌ddh2o补足至20μl。37℃反应3h。

基因rsan1扩增引物：

peaqrsan1-f:5'-tattctgcccaaattcgcgaatggagggttcgtccaaag-3'

peaqrsan1-r:5'-tgaaaccagagttaaaggcctcaagttccagtctctccatc-3

连接反应体系：rsan1片段3μl；linearizedvector(peaq-ht回收大片段)1-2μl；solutioni5μl；无菌ddh2o补足至10μl。16℃连接反应2h。

(6)rsan1表达量检测

rsan1在野生型‘红心1号’胭脂萝卜中的表达量检测采用real-timepcr反应(abi7500real-timepcrsystem)进行。反应体系按照real-timepcrmastermix(toyobo，japan)说明书，反应体积为20μl；反应条件如下：50℃，60s；95℃，60s，95℃，15s，56℃，20s，72℃，35s，40个循环；之后进行55-95℃熔解曲线分析。每个样品设3个重复。反应结束后通过熔解曲线鉴定产物的特异性。基因相对表达量分析运用2^-△△ct法进行数据处理(livakandschmittgen2001)，计算rsan1的表达水平。以上所有实验均设3次重复，实验用ddh2o为阴性对照；结果如图4所示。

荧光定量pcr的引物：

qrsan1-f：5'-cgttgttcctctatgccttc-3'

qrsan1-r：5'-tagcaaactctcccaccaca-3'

从图4可以看出，rsan1在花青苷有积累的部位表达(皮、肉、叶柄)表达，且花青苷的积累量越多，基因表达量越高，可见，rsan1的表达量与花青苷的积累成正相关关系；而在野生型胭脂萝卜的叶片中无rsan1的表达，也无花青苷的合成和积累。

(7)重组表达载体的遗传转化

通过常规冻融法将构建的重组表达载体peaq-rsan1转入农杆菌eha105中，再通过农杆菌介导方法将peaq-rsan1转入野生型胭脂萝卜中，具体步骤如下：

将含有peaq-rsan1表达载体的农杆菌，接种于含有卡纳霉素(100mg/l)的液体lb培养基中，28℃，300rpm培养至od600约为2之间，然后将培养好的菌液于4000rpm，离心5min，将收集的菌体用maa(10mmmes(2-[n-morpholino]ethanesulfonicacid)ph5.6，10mmmgcl2，100μmacetosyringone)悬浮菌体od600至1.0左右；用不含针头的注射器将含有peaq-rsan1表达载体的农杆菌注射胭脂萝卜子叶和叶片背面，同时在胭脂萝卜子叶和叶片上注射含有空载体peaq-ht的农杆菌作为阴性对照。注射4～5d后观察拍照，结果如图5所示。

从图5可以看出，在胭脂萝卜的子叶和叶片中瞬时超表达rsan1，可以使叶片和子叶中积累大量花青苷，而在阴性对照植株的叶片和子叶中均无花青苷的合成。说明在胭脂萝卜中瞬时超表达rsan1能促进花青苷的合成和积累。

采集上述样品分析花青苷含量，花青苷含量测定方法为：花色素苷含量的测定采用ph差示法，参照wrolstad等(1982)的试验方法，具体步骤为：取萝卜组织0.1g样品于3ml浸提液(甲醇；水：浓盐酸85：12：3)中，室温避光充分浸提(约5～6小时)。配制buffer1和buffer2，buffer1：0.2mol/lkcl-0.2mol/lhcl(25：67)，ph＝1；buffer2：1mol/lnaac-0.4mol/lhcl(100：150)，ph＝5。取0.5ml浸提液于试管中分别加入2ml的buffer1和buffer2，用紫外分光光度计测定它们在530nm下吸光值。

根据经验公式计算结果，公式如下：花色苷含量(mg/g)＝δod530×5×3×445.2/29600×0.1，其中5为稀释倍数，3为提取液体积，445.2为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量；29600为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔比吸收系数(mol^-1.ml^-1)，0.1表示样品重量。

经计算，瞬时转化rsan1的萝卜叶片和子叶中花青苷含量分别为0.45mg/g和0.28mg/g，而阴性对照的叶片和子叶子中检测不到花青苷。

综上，通过在胭脂萝卜中单独表达rsan1基因时，可以明显促进胭脂萝卜中花青苷的合成和积累，进而提高胭脂萝卜中花青苷的含量，提高胭脂萝卜的品质。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

sequencelisting

<110>长江师范学院；

<120>一种胭脂萝卜花青苷生物合成调控基因rsan1及其应用

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atggagggttcgtccaaagggttgagaaaaggtgcatggactgctgaagaagatagtctc60

ttgaggcaatgcattgataagtatggagaagggaaatggcaccaagttcctttaagagct120

gagctcaatcggtgcaggaagagttgtagactaagatggttgaactatttgaagccaagt180

atcaagagagggaaacttaactctgatgaagttgatcttcttcttcgccttcataaactt240

ttgggaaacaggtggtctttaattgctggtagattacccggtcggactgccaatgatgta300

aaaaattactggaacacccatttgagtaagaaacatgaaccaggttgtaagacccagatg360

aaaaaagagaagagaaacattccttgctcttctactacactagcccaaaaaatcgacgtt420

ttcaaacctcgacctcgatccttcaccgttaacaacggctgcagccatatcattggcatg480

ccaaaacctgacgttgttcctctatgccttcgattcaacaacaccaaaaatgtttgtgaa540

aatattgctacatgtaacaaagatgacgataaatctgagcttgtttgtaatttaatggat600

ggtcagaatatgtggtgggagagtttgctagatgagagccaagatccagctgctctctat660

ccagaagctacagcaacaaaaaaggccgtaacctccgagtttgacgttgatcacctttgg720

agcctgttggatggagagactgttgaacttgattag756

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<213>胭脂萝卜（raphanussativusl.）

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ikrgklnsdevdlllrlhkllgnrwsliagrlpgrtandvknywnthlskkhepgcktqm120

kkekrnipcssttlaqkidvfkprprsftvnngcshiigmpkpdvvplclrfnntknvce180

niatcnkdddkselvcnlmdgqnmwweslldesqdpaalypeatatkkavtsefdvdhlw240

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tagcaaactctcccaccaca20