溴邻苯二酚1,2双加氧酶编码基因在合成2-溴粘康酸的应用的制作方法

本发明属于生物技术及酶基因工程领域，涉及一种溴邻苯二酚1，2双加氧酶编码基因在合成2-溴粘康酸的应用，具体涉及一种通过生物酶学手段合成2-溴粘康酸的方法。

背景技术：

粘康酸可用于抗紫外线防护剂及军工特种用品上，另外，粘康酸也是合成肥酸的前体物质，肥酸又是合成尼龙66和塑料的前体物质(见biosynthesisofcis，cis-muconicacidanditsaromaticprecursors，catecholandprotocatechuicacid，fromrenewablefeedstocksbysaccharomycescerevisiae[j].applied&environmentalmicrobiology，2012，78，8421-8430)。

粘康酸分为顺，顺-粘康酸、顺，反粘康酸和反反粘康酸。顺，顺-粘康酸主要是微生物代谢的中间产物，通过微生物代谢过程中酶促反应制得。例如底物邻氨基苯甲酸盐通过工程菌株大肠杆菌利用顺序酶促反应邻氨基苯甲酸盐1，2双加氧酶和邻苯二酚双加氧酶制得粘康酸(见anovelmuconicacidbiosynthesisapproachbyshuntingtryptophanbiosynthesisviaanthranilate[j].applied&environmentalmicrobiology，2013，79，4024-4030)；底物葡萄糖也可以用工程菌过量表达3-脱氢草莽酸甲酯脱水酶，原儿茶酸脱羧酶，邻苯二酚1，2双加氧酶等顺序酶促反应制得粘康酸(见biosynthesisofcis，cis-muconicacidanditsaromaticprecursors，catecholandprotocatechuicacid，fromrenewablefeedstocksbysaccharomycescerevisiae[j].applied&environmentalmicrobiology，2012，78，8421-8430)；还有一些细菌可以将苯类化合物转化成为粘康酸(见microbialproductionofcis，cis-muconicacidfrombenzoicacid[j].appliedmicrobiology&biotechnology，1988，28，20-25.microbialproductionofcis，cis-muconicacid[j].journalofbiotechnology，1990，14，203-210.)。

有研究报道某些邻苯二酚双加氧酶可以将3-氯邻苯二酚转化为2-氯粘康酸(见patchworkassemblyofnag-likenitroarenedioxygenasegenesandthe3-chlorocatecholdegradationclusterforevolutionofthe2-chloronitrobenzenecatabolismpathwayinpseudomonasstutzerizwlr2-1.applied&environmentalmicrobiology2011.77，4547-4552.)，但该酶从未报道过用于2-溴粘康酸的生产。

在通常情况下，卤族元素的加入，可以改变化合物的特性，在某些方面有着超出不含卤族取代化合物的性能，如聚氯乙烯与聚乙烯，它们有着明显的物理及化学差异，而各自有不同的应用。粘康酸及其聚合物目前应用广泛，而目前尚无溴代粘康酸生产方法的报道，其理化知识与作用我们也无从知道。但从粘康酸在工业上的应用可以判断，溴粘康酸也将具有潜在的工业应用价值。

技术实现要素：

为了提供一种现实可行通过酶学法制备2-溴粘康酸的途径，本发明受到菌株pseudomonasstutzerizwlr2-1在代谢污染物2-氯硝基苯(2cnb)过程中，有一个酶(genbank编号：adq90213.1)可以将3-氯邻苯二酚转化为2-氯粘康酸的启发，从而探亢该酶用于2-溴粘康酸生产的可能性，该酶原名为3-氯邻苯二酚1，2双加氧酶，经本研究证实，该酶也可将3-溴邻苯二酚催化生成2-溴粘康酸，因此，本发明将该酶称为3-溴邻苯二酚1，2双加氧酶(bnbc)。

因此，本发明提供了一种溴邻苯二酚1，2双加氧酶编码基因在合成2-溴粘康酸的应用，具体而言是提供一种合成2-溴粘康酸的方法。

本发明的技术方案如下：

溴邻苯二酚1，2双加氧酶编码基因在合成2-溴粘康酸的应用，该编码基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一种合成2-溴粘康酸的方法，包括以下步骤：

(1)用引物gtgccgcgcggcagccatatgcccggtgaggggcta和acggagctcgaattcggatcctgccgcgcgcgatgc从菌株pseudomonasstutzerizwlr2-1的基因组dna中扩增bnbc基因，扩增后利用胶回收试剂盒纯化的pcr产物；再利用限制性内切酶ndei和bamhi线性化商业质粒载体pet28a，并通过dna重组酶将pcr产物与线性化载体连接，用经典的大肠杆菌转化方法将质粒dna转移到大肠杆菌e.colitrans1-t1中，成功构建质粒pet28a-bnbc，该重组质粒的核苷酸序列如seqidno.2所示；

(2)将成功构建的质粒pet28a-bnbc转入表达菌株e.colibl21(de3)中，获得重组菌e.colibl21(de3)[pet28a-bnbc]，在lb培养基中37℃培养，当菌液od600约为0.6时，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)于30℃诱导4h后，6,000×g离心5min收集菌体，重悬于提前预冷的50mmol/lph7.4磷酸缓冲液中，清洗两次后，再次重悬于同样的缓冲液中，随后冰水浴中超声破碎，细胞裂解液10,000×g离心1h后收集上清液，利用histraphp亲和层析柱和akta蛋白纯化系统对e.colibl21(de3)[pet28a-bnbc]细胞抽提液进行蛋白纯化；

(3)将纯化后的细胞抽提液加至3-溴邻苯二酚溶液中催化，即得到2-溴粘康酸。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

现有技术未见报道关于2-溴粘糠酸的制备方法，市场上也无法购得，本发明首次阐明了2-溴粘康酸的制备及分离方法，通过酶学方法以3-溴邻苯二酚为原料进行制得，通过液相色谱进行分离纯化。并通过质谱、核磁等方法进行了鉴定。该物质可作为重要化工物质粘康酸的卤族元素取代物，可能与粘康酸有类似的工业用途，但是可能也有不同的特性，具有潜在的工业价值，关于其工业应用的研究正在进行中；此外，该物质还可以作为实验标品，应用于科学研究中。本发明关于2-溴粘康酸的制备方法是利用微生物代谢过程中的酶促反应获得，相比较传统的物理化学方法的高污染性，该方法不会对环境造成污染。本发明制备过程简单，pseudomonasstutzerizwlr2-1菌株中的邻苯二酚双加氧酶性质稳定，4℃条件下保存7天酶的活性不会明显丧失，反应条件简单，不需要任何辅因子，不需要含有盐离子的缓冲溶液调节ph变化，仅在纯水中加底物和酶反应即可获得含2-溴粘康酸的反应液，为后续分离纯化和大批量工业生产提供了简单便捷的方法。

附图说明

图1为重组质粒pet28a-bnbc的结构图；

图2为用分光光度计测定溴邻苯二酚1，2双加氧酶催化3-溴邻苯二酚的开环活性示意图；

图3和图4为2-溴粘康酸的lc-ms图；

图5为2-溴粘康酸的¹h-nmr谱图；

图6为2-溴粘康酸的¹³c-nmr谱图；

图7为2-溴粘康酸的cosy谱图；

图8为2-溴粘康酸的noesy谱图；

图9为酶促反应底物与产物及转化率之间的关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

一、重组质粒的构建

溴邻苯二酚1，2双加氧酶的编码基因bnbc来源于pseudomonasstutzerizwlr2-1。

构建重组质粒pet28a-bnbc，先用引物gtgccgcgcggcagccatatgcccggtgaggggcta和acggagctcgaattcggatcctgccgcgcgcgatgc从菌株pseudomonasstutzerizwlr2-1的基因组dna中扩增bnbc基因，扩增后利用胶回收试剂盒纯化的pcr产物；再利用限制性内切酶ndei和bamhi线性化商业质粒载体pet28a，并通过dna重组酶将pcr产物与线性化载体连接，用经典的大肠杆菌转化方法(氯化钙法)(molecularcloning：alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress.1989.)将质粒dna转移到大肠杆菌e.colitrans1-t1中，成功构建质粒pet28a-bnbc，见图1所示。提取质粒并进行dna测序验证。

二、溴邻苯二酚1，2双加氧酶的纯化及活力测定

将成功构建的质粒pet28a-bnbc转入表达菌株e.colibl21(de3)中，获得重组菌e.colibl21(de3)[pet28a-bnbc]，在lb培养基中37℃培养，当菌液od600约为0.6时，加入终浓度为0.2mmol/l的iptg(异丙基硫代半乳糖苷)于30℃诱导4h后，6,000×g离心5min收集菌体，重悬于提前预冷的50mmol/lph7.4磷酸缓冲液中，清洗两次后，再次重悬于同样的缓冲液中，随后冰水浴中超声破碎，细胞裂解液10,000×g离心1h后收集上清液。利用histraphp亲和层析柱和akta蛋白纯化系统对e.colibl21(de3)[pet28a-bnbc]细胞抽提液进行蛋白纯化，bnbc蛋白洗脱条件为300mmol/l咪唑，通过观察到的紫外检测峰，收集相应时间下的洗脱溶液。纯化的蛋白样品于4℃保存。反应液中加入1ml水，5mm3-溴邻苯二酚，适量的酶，反应6小时，获得含2-溴粘康酸的反应液，用于质谱分析以及通过液相色谱进行分离纯化，核磁共振等操作。

另一反应液中加入1mlpb缓冲液(50mm，ph7.4)，0.5mm3-溴邻苯二酚，适量的酶，用分光光度计监测吸收峰的变化，酶反应在石英比色杯中进行，并通过扫描模式实时监测比色杯中各波长吸光值的变化，见图2所示。

其中，3-溴邻苯二酚在280nm有最大吸收峰，它的摩尔消光系数ε280＝1952m^-1·cm^-1；2-溴粘康酸在270nm处有最大吸收峰，它的摩尔消光系数ε260＝13867m^-1·em^-1。采用分光光度计的波长扫描模式，扫描波长为200nm-320nm。每分钟扫一次，而每条曲线代表每次扫描的结果。由图2可知，随着时间的推移，每次扫描在260nm处的吸光值都会有所上升，这显示有产物的积累，同时波峰向左偏移。因此，证实邻苯二酚双加氧酶可以催化3-溴邻苯二酚的开环生成2-溴粘康酸。

三、lc-ms分析及hplc纯化2溴粘康酸

将酶促反应液反应6小时后加入30％甲酸终止反应，于室温12000×g高速离心5min后取上清液进行lc-ms分析，色谱柱为bio-radaminexhpx-87h(300mm×7.8mm)，流动相为体积比为0.1％的甲酸的水溶液，采用等度洗脱程序，进样量为10μl，流速为0.4ml/min，检测波长为260nm。此条件下2-溴粘康酸的出峰时间为23min，质谱图初步验证此物质为2-溴粘康酸，见图3和图4所示。用hplc收集2-溴粘康酸出峰时的液体：条件同上，只改变流速为0.8ml/min，进样量为100μl，上述条件下2-溴粘康酸的保留时间为11.5min。

从图3和图4可知，酶促反应液在液相中得到一个明显的峰，此峰在负离子模式下的质谱与2-溴粘康酸吻合。

四、核磁共振分析验证2-溴粘康酸的结构

将hplc收集到的样品冻干后溶于氘代dmso中，¹h-nmr实验如图5所示；¹³c-nmr谱实验如图6所示；cosy谱实验(¹h-¹hcosy谱，¹³c-¹hcosy谱)如图7所示；noesy谱实验如图8所示。核磁共振图谱归属表如表1所示。

表1：核磁共振图谱归属表

注：s单峰，d两重峰，t三重峰，m五重峰

五、酶促反应底物与产物及转化率之间的关系

为了指导实际生产过程中原料3-溴邻苯二酚的投放量，本发明还研究了在溴邻苯二酚1，2双加氧酶过量的情况下，原料浓度与产物浓度的定量关系。

酶促反应液中加入1ml水，分别加入0.1mm；0.2mm；0.5mm；1mm；2mm；5mm浓度的原料3-溴邻苯二酚，过量的溴邻苯二酚1，2双加氧酶，反应6小时后用分光光度计计算产物浓度，实验结果见图9所示。

在理想条件下，3-溴邻苯二酚会以1∶1的比例转化为2-溴粘康酸，但从图9可知，事实并非如此，即使在酶过量条件下，酶促反应6小时后，增加原料3-溴邻苯二酚的浓度，确实可以提升2-溴粘康酸的产量。但并非线性提升，随着原料浓度增加，产物浓度也增加，但增加不如原料的增加快，因此所用原料浓度越高，转化率越低。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

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<110>上海交通大学

<120>溴邻苯二酚1，2双加氧酶的编码基因及其应用

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