一株增加酱油中β-苯乙醇含量的融合魏斯氏菌及其应用的制作方法

本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株适用于酱油、酱等调味品生产用的乳酸菌。

背景技术：

酱油是我国的传统发酵调味品，是一种以大豆、小麦、麸皮等为原料，由多种微生物共同作用经长期发酵而形成的具有独特风味的调味品。

魏斯氏菌(weissella)是一类重要的乳酸菌，广泛存在于酱油、泡菜、豆豉、香肠等传统发酵食品中，它们具有提高发酵食品产品质量或者缩短发酵周期等作用，在发酵食品中具有广泛的应用价值。近年来，有研究表明魏斯氏菌在酱油、泡菜和豆豉等高盐食品发酵过程中，能够代谢产生大量有机酸、醇类及酯类等风味物质，形成特殊的香味，使发酵食品的口感更醇厚，同时色泽也更加鲜亮和红润。

β-苯乙醇(β-phenylethanol)又称2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-phenyethylalcohol；2-pea或2-pe)，常温下是一种具有的香气、特别是带有玫瑰花香气的无色透明液体。β-苯乙醇的沸点为219.8℃，比重为1.0180-1.0200。其在25℃时能全溶于50倍体积的去离子水，易溶于醇、醛等有机溶剂。其分子式为c8h10o，分子量为122.16，其化学结构式如下：

人们喜食的多种成熟水果(如荔枝、葡萄、樱桃、苹果、水蜜桃、树莓果、草莓、香蕉等)散发出的玫瑰香味主要源于β-苯乙醇；少数植物叶片(如黑杨萎蔫叶片、茶叶、烟叶)中也含有β-苯乙醇。已有研究表明，酿酒酵母、黑曲霉、白地霉等微生物在发酵过程中可以将底物转化为β-苯乙醇。在调味品生产过程中由于有多种微生物的参与，因而柿醋、枣醋、腌菜、豆酱以及酸肉、南京酱牛肉、火腿股二头肌等肉制品中香气分析时，都检测到β-苯乙醇的存在。

目前对于乳酸菌对酱油中β-苯乙醇的含量提升未见报道。国内一些发明专利/专利申请有报告关于通过微生物发酵来合成β-苯乙醇。例如中国发明专利申请cn107177520a：一株高产β-苯乙醇的酿酒酵母菌株及其应用中公开的酿酒酵母菌株具有高产β-苯乙醇能力，在黄酒发酵、料酒发酵、酿造食醋、酱油发酵、白酒发酵中应用均能提高相应产品中β-苯乙醇的含量；中国发明专利申请cn107937295a：一株酿酒酵母及其在发酵食品中的应用中公开的酿酒酵母菌株合成β-苯乙醇途径中的关键基因pha2发生突变，用来发酵黄酒，酒精度达到13度，β-苯乙醇产量可达120mg/l。以上两项发明专利申请均以酵母来提高发酵食品中β-苯乙醇的含量，但并未针对酱油的风味进行研究；酵母菌产酒精含量较大，对生长环境要求较高，在酱油的发酵生产中具有局限性。中国发明专利申请cn108330074a：异常维克汉姆酵母菌t1在酱油增香中的用途及增香工艺中公开的异常维克汉姆酵母菌株能够提高酱油中的醇类和酯类含量，其中在低盐固态酱油中苯乙醇的含量原来的4.49％提高到14.34％。该发明专利申请同样也使用酵母菌，并且同时研究多种醇类和酯类含量，对β-苯乙醇的风味没有针对性。中国发明专利申请cn104886530a：一种直投式乳酸菌发酵酱油的辅料及其制品的制备方法公开了通过辅料发酵菌种、菌种添加量以及添加点的选择，使得所制备的酱油风味、口感和色泽好。该发明使用乳酸菌来提高酱油的风味，但并未提及风味物质β-苯乙醇的含量变化。

在现有的技术中没有一株能够在酱油中直接应用来提高β-苯乙醇含量，且不改变酱油原有风味体系的安全菌，从而能够安全可靠地提高酱油的风味品质。

技术实现要素：

本发明提供一株融合魏斯氏菌(weissellaconfusa)zf606菌株，在酱油发酵阶段接种后，能够显著提高酱油中β-苯乙醇的含量，从而使发酵的酱油在不改变原油风味体系的基础上带有淡淡的花香气，提高酱油的风味品质。

本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供一株融合魏斯氏菌zf606，该菌株于2018年9月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno：60456，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

2、本发明的融合魏斯氏菌zf606菌落特征如下：菌落呈圆形微隆起，表面光滑不透明，菌落直径1～2mm，菌落边缘整齐。

3、本发明中的融合魏斯氏菌zf606是从酱油生产中的天然发酵酱醪中筛选获得的。具体地，本发明所述的融合魏斯氏菌zf606菌株的筛选方法如下：

3.1首先从天然酱醪中分离得到乳酸菌。将酱醪加入无菌水稀释10⁴～10⁶倍，涂布于mrs培养基平板上，厌氧箱中36～38℃培养24～48h后，挑取形态小而圆的单一菌落进行初筛及复筛。

3.2初筛方法为接种各菌株的酱油中风味物质的检测。将酱醪中获得的乳酸菌单菌株活化培养至对数生长期，酱醪发酵初期0～1天内在各发酵罐中分别接种初筛获得的各乳酸菌，接种量为0.1～0.15％，28～32℃静置发酵50～55天后过滤得头油。

3.3复筛方法为接种各菌株的酱油的感官鉴评。将初筛获得的几株乳酸菌分别于发酵初期接种于各发酵罐中，按传统高盐稀态方法进行发酵，发酵结束后对各组原油的风味进行测评。

3.4生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，在发酵初期接入10⁵～10⁶cfu/ml的zf606菌株，发酵结束后，检测酱油中的β-苯乙醇含量及酱油的感官质量。

其中，对于3.1所述的mrs培养基配方为：10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，4g酵母膏粉，20g葡萄糖，1ml吐温-80，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15g，溶于1000ml蒸馏水中，调节ph至6.2，分装，0.1mpa、115℃灭菌15min。

因此，在一方面，本发明提供融合魏斯氏菌zf606。

在另一方面，本发明提供所述融合魏斯氏菌zf606在制备食品中的用途。在一个实施方案中，食品为酱油和/或酱。

在又一方面，本发明提供所述融合魏斯氏菌zf606在酱油和/或酱发酵中的用途。在一个实施方案中，所述融合魏斯氏菌zf606用于在酱油和/或酱发酵初期接入。

在另一个方面，本发明提供制备酱油和/或酱的方法，其中在酱油和/或酱发酵初期接入所述融合魏斯氏菌zf606。在一个实施方案中，其中所述融合魏斯氏菌zf606的接种量为0.1～0.15％。在另一个实施方案中，其中所述融合魏斯氏菌zf606的接种量为10⁵～10⁶cfu/ml。在又一个另一个实施方案中，其中初期接入是在酱醪发酵初期0～1天内接入所述融合魏斯氏菌zf606。

本发明的创新点在于(包括但不限于)：

1、本发明提供一株保藏号为gdmccno：60456的融合魏斯氏菌zf606及其筛选方法和在酱油等调味品中的应用。

2、本发明所述融合魏斯氏菌zf606具有发酵酱油含有较高浓度β-苯乙醇，且总酸、氨基酸态氮的含量适宜，不影响酱油本身的营养价值及风味体系的特征。

3、本发明所述融合魏斯氏菌zf606具有发酵酱油香气浓郁，带有淡淡的花香气，口感鲜甜突出的特征。

本发明具有以下技术优势和积极效果(包括但不限于)：

本发明中融合魏斯氏菌zf606的筛选方法具有普遍适用性，可以广泛应用于提高酱油风味物质含量的菌种的选育。

本发明提供的融合魏斯氏菌zf606，具有能提高β-苯乙醇的含量，并且不影响酱油体系中的其他营养成分的特点，源自天然酱醪，无安全风险，能够酿造出香气和谐、风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的原油，无需后期对风味进行调配，天然健康。

附图说明

图1为本发明的融合魏斯氏菌zf606的菌落形态，其中图a为该菌株在mrs培养基上的菌落形态，图b为该菌株在显微镜中观察的形态。

图2为采用本发明的融合魏斯氏菌zf606发酵的原油鉴评分析结果。

图3为本发明的菌株获取的技术路线。

生物保藏信息

一株融合魏斯氏菌zf606，其分类学名称为weissellaconfusa，该菌株于2018年9月27日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno：60456，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例对本发明的具体实施做进一步说明，但并不仅限于此实施例。

实施例1融合魏斯氏菌zf606的筛选获得

1、原材料的处理

取传统工艺条件下发酵30天的酱醪，粗滤掉残渣后加入0.9％的无菌生理盐水稀释至10³、10⁴、10⁵倍，制成酱醪稀释液，分别从各浓度稀释液中取0.1ml均匀涂布于mrs固体琼脂培养基平板上，36℃培养24h，挑选表面光滑、不透明、乳白色的小单菌落，接入mrs液体培养基中，培养于36℃。

2、菌株的初筛

将上一步所培养的菌落在mrs固体培养基上划线进行再次纯化，挑取单一菌落进行培养，成熟后进行保藏，分别命名为zf606、ca101、ca102、ca103、ca104、ca105、ca106、ca107、za108、ca109。将该10株菌在mrs培养基中活化，36℃厌氧培养至对数生长期，并在酱醪发酵初期0～1天内接入，最终浓度为10⁶cfu/ml，按照传统高盐稀态发酵工艺进行发酵，其中成曲与盐水质量比为1:2，盐水配置浓度为18～18.5％，常温条件下发酵。

发酵至55天时，从各罐中取样进行常规理化指标检测，并通过固相微萃取－气质联用(spme-gc-ms)进行检测各组样品中β-苯乙醇的含量进行分析，结果如表1所示。

表1发酵原油质量分析

选取β-苯乙醇含量高，且原油质量正常，氨基氮、还原糖含量较高的菌株zf606、ca104、ca108、ca109进行复筛。

3、菌株的复筛

将初筛过程中表现优异的菌株zf606、ca104、ca108、ca109按照菌株初筛时的方法重新活化培养至对数生长期，在酱醪发酵初期0～1天内分别接种到不同发酵罐中，最终接种量为10⁶cfu/ml，按照和初筛相同的传统高盐稀态发酵工艺进行发酵。发酵结束后，取各组原油进行感官分析，结果如表2所示。

表2发酵原油感官分析

备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好。

根据得分，选择感官评价结果最好的菌株为zf606。该菌株在mrs琼脂培养基上的形态观察如图1所示，菌落呈圆形微隆起，表面光滑不透明，直径1～2mm，菌落边缘整齐。

本发明的zf606菌株经基因鉴定，其基因序列如下：

tctataatgcagtcgaacgctttgtggttcaactgatttgaagagcttgctcagatatgacgatgaacattgcaaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggaaacctacctcttagcaggggataacatttggaaacagatgctaataccgtataacaatgacaaccgcatggttgttatttaaaagatggttctgctatcactaagagatggtcccgcggtgcattagctagttggtaaggtaatggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaagggtttcggctcgtaaaacactgttgtaagagaagaatgacattgagagtaactgttcaatgtgtgacggtatcttaccagaaaggaacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgttccaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttatttaagtctgaagtgaaagccctcagctcaactgaggaattgctttggaaactggatgacttgagtgcagtagaggaaagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctttctggactgtaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacaccgtaaacgatgagtgctaggtgtttgagggtttccgcccttaagtgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccttgacaactccagagatggagcgttcccttcggggacaaggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcattcagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtgagctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccgg

根据16srdna检测结果对比分析，菌种所测得的16s区序列与融合魏斯氏菌(weissellaconfusa)相似度达到99％，可确定菌种为一株融合魏斯氏菌。

实施例2融合魏斯氏菌zf606的遗传稳定性检测

将实施例1中的融合魏斯氏菌zf606在mrs培养基上连续传代10代，将第1代、第5代、第10代的菌种按照实施例1中菌株初筛的方法进行原油发酵实验，测量获得原油的总酸、氨基酸态氮以及β-苯乙醇的含量并进行比较，以判断其遗传稳定性，具体数据见表3。

表3各代zf606遗传稳定性分析

由表3可知，融合魏斯氏菌zf606的各代菌所发酵制得的原油的各项指标均依然保持着优异的效果，并且保持稳定，与第1代的差异小于10％。这表明该菌株的遗传稳定性好，非常适合用于工业化生产使用。

实施例3融合魏斯氏菌zf606的效果验证

将通过筛选获得的融合魏斯氏菌zf606按照实施例1中的方法活化后进行酱油生产放大实验，在酱醪发酵初期0～1天内接种zf606菌株，最终接种浓度为10⁶cfu/ml，同时将不接种该菌株的发酵罐作为对照组。发酵结束后检测原油指标，并请专业鉴评人员对两组原油同时进行感官评分，结果如表4、图2所示。

表4发酵原油质量分析

由10名鉴评人员对两种原油进行感官评定，并对各样品的体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味以及综合口感进行评分，0～4分依次为不接受、接受、正常、满意、很满意，0.5分为一个级别。鉴评结果见表5。

表5发酵原油感官鉴评

根据表4可知，融合魏斯氏菌zf606应用于酱油发酵中所获得的原油总酸、氨基酸态氮含量均与对照组无显著差异，而β-苯乙醇的含量较对照组提高了3.83倍，效果显著。同时，由表5和图2中的鉴评结果可知，本发明的菌株发酵的原油具有香气浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。

上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制；因此在和本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在权利要求书的范围内。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

序列表

<110>佛山市海天（高明）调味食品有限公司;

广东海天创新技术有限公司;

佛山市海天调味食品股份有限公司

<120>一株增加酱油中β-苯乙醇含量的融合魏斯氏菌及其应用

<130>idc180288

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1425

<212>dna

<213>融合魏斯氏菌（weissellaconfusa）

<400>1

tctataatgcagtcgaacgctttgtggttcaactgatttgaagagcttgctcagatatga60

cgatgaacattgcaaagagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggaaacctacctcttag120

caggggataacatttggaaacagatgctaataccgtataacaatgacaaccgcatggttg180

ttatttaaaagatggttctgctatcactaagagatggtcccgcggtgcattagctagttg240

gtaaggtaatggcttaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccac300

aatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaa360

tgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgtgtgatgaagggtttcggctcgtaaaac420

actgttgtaagagaagaatgacattgagagtaactgttcaatgtgtgacggtatcttacc480

agaaaggaacggctaaatacgtgccagcagccgcggtaatacgtatgttccaagcgttat540

ccggatttattgggcgtaaagcgagcgcagacggttatttaagtctgaagtgaaagccct600

cagctcaactgaggaattgctttggaaactggatgacttgagtgcagtagaggaaagtgg660

aactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcgg720

ctttctggactgtaactgacgttgaggctcgaaagtgtgggtagcaaacaggattagata780

ccctggtagtccacaccgtaaacgatgagtgctaggtgtttgagggtttccgcccttaag840

tgccgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactca900

aaggaattgacggggacccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcg960

aagaaccttaccaggtcttgacatcccttgacaactccagagatggagcgttcccttcgg1020

ggacaaggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaa1080

gtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcattcagttgggcactctagtg1140

agactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttat1200

gacctgggctacacacgtgctacaatggcgtatacaacgagttgccaacccgcgagggtg1260

agctaatctcttaaagtacgtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaag1320

tcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgta1380

cacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccgg1425