猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗与流程

本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，具体而言，涉及猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗。

背景技术：

猪瘟是由猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前可分为急性、亚急性、慢性和非典型猪瘟。急性猪瘟由强毒株引发，一般导致猪的高发病率和高死亡率。除引起败血症外，猪瘟病毒还可引起一系列临床表现，如妊娠母猪流产、胎儿畸形、慢性营养消耗、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统病变，并容易继发和并发细菌或其他病毒感染。猪瘟给世界养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织将其列入oie疫病名录，为须申报的动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。

猪瘟病毒为黄病毒科瘟病毒属成员，病毒粒子呈球形，是有囊膜的单股正链rna病毒。基因组全长12.3kb，含有一个大的开放阅读框，该阅读框编码一个含3898个氨基酸的多聚蛋白，此多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用下，加工形成4个结构蛋白(c、e0、e1和e2)和8个非结构蛋白(npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b)。其中囊膜糖蛋白e0和e2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。目前国际公认的猪瘟病毒被分为三个基因型共十个基因亚型。

我国是生猪养殖大国，无论是饲养量还是猪肉产量均位居世界第一。我国居民肉食消费约65％来源于猪，仅生猪养殖、屠宰和猪肉制品产值已超过2万亿元。养猪业已经成为我国农业和农村经济的支柱产业，是保障食品安全的基础产业。近年来，猪瘟在亚洲、欧洲、南美洲等地区呈现复发的趋势，一些宣布已消灭猪瘟的国家(如法国、荷兰、德国、比利时等)又见猪瘟复发的报道。猪瘟病毒仅有1个血清型且变异率相对较小，因此，疫苗接种仍是大多数国家防控猪瘟的主要措施。目前我国生产及使用的猪瘟疫苗为传统的猪瘟弱毒疫苗，然而，现代猪瘟的流行趋势发生了很大变化，呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存，隐性感染和持续感染并现，且免疫失败的现象时有发生。这种新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战，加上传统疫苗无法区分病毒感染和免疫的动物(diva)，已经不能满足现代防控和根除猪瘟的要求了。

据报道，近年来研制的新型疫苗包括核酸疫苗、病毒活载体疫苗、基于蛋白/肽的疫苗、基因缺失疫苗等。虽然近年来研制的新型猪瘟疫苗具有各自的优势，但也存在一定的缺陷。如核酸疫苗诱导产生抗体的速度慢，接种剂量大，有整合和转化染色体的潜在危险；病毒活载体疫苗对人类而言，因还不完全了解病毒的自然发生及变异机制，无法控制该类病毒的未来走向；亚单位疫苗免疫原性通常要比病毒颗粒抗原差，不能提供有效保护；基因缺失疫苗通常为弱毒活苗，其长期使用可能会改变猪瘟病毒原有的生态环境和病毒群落，使猪瘟流行毒株向远离疫苗毒的方向演化，且很难达到现代防控和根除猪瘟疫病的要求。因此，开发一种安全、高效的新型猪瘟疫苗对于预防和控制猪瘟具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗。其中猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒选用逆转录病毒的gag前体蛋白做为基质蛋白，猪瘟病毒囊膜蛋白e0和e2做为表面膜蛋白，制备出理想的且具功能性的病毒样颗粒，克服了亚单位蛋白疫苗的弱点，有效提高了疫苗的免疫原性、安全性和稳定性；该嵌合型病毒样颗粒通过构建表达载体转染细胞的方式能大量制备；本发明的猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒可应用于制备预防猪瘟疫病的疫苗、制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一目的是提出一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，所述嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的gag前体蛋白、猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2。

优选地，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2均来源于猪瘟病毒基因亚型株；进一步优选地，所述猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2均来源于猪瘟病毒2.1基因亚型株。

优选地，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2的核苷酸序列如seqidno.4所示。

优选地，所述逆转录病毒的gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白alv-gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白hiv-gag。

进一步优选地，编码鸡白血病病毒前体蛋白alv-gag的核苷酸序列如seqidno.6所示，编码人免疫缺陷病毒前体蛋白hiv-gag的核苷酸序列如seqidno.8所示。

本发明的第二目的是提出上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的制备方法，用表达所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的重组载体转染细胞，得到细胞培养液，回收并纯化所述细胞培养液，获得所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒。

优选地，所述细胞为昆虫细胞，所述重组载体为杆状病毒重组载体。

本发明的第三目的是提出一种疫苗，所述疫苗包含上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒。

优选地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自水包白油型佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂或弗氏佐剂中至少一种。

本发明的第四目的是提出上述任一项所述的猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒在制备猪瘟病毒抗体检测制剂或猪瘟病毒疫病监测制剂中的应用，所述制剂包含elisa检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。

本发明的技术方案的原理为：

1.猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的生成原理：

将作为基质蛋白的逆转录病毒的gag前体蛋白和将作为表面膜蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白e0和e2，构建于昆虫杆状病毒的表达载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质dna内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，然后自动组装成不含任何猪瘟病毒遗传物质的病毒样颗粒，并释放入细胞培养液中。

2.猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的免疫原理：

猪瘟病毒的囊膜糖蛋白e0和e2是两个保护性抗原蛋白，可以诱导机体产生抗猪瘟的保护性免疫抗体。猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒作为疫苗抗原体，其颗粒表面上带有的e0和e2囊膜蛋白能诱发免疫应答；同时，由于病毒样颗粒保留了天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫效果更显著；猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒疫苗具有野生病毒的整体外部特征，却不具有病毒的遗传物质，因此，病毒样颗粒疫苗无需进行任何化学灭活，其表面糖蛋白的构象空间没被破坏，与野生病毒一致。因此这种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒疫苗，真正达到了既安全又有效的目的。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明选用逆转录病毒的gag前体蛋白做为基质蛋白、猪瘟病毒囊膜蛋白e0和e2做为表面膜蛋白，制备出理想的且具功能性的病毒样颗粒，该病毒样颗粒能诱发免疫应答；由于病毒样颗粒具有天然病毒颗粒的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，却不具有病毒的遗传物质，病毒样颗粒疫苗无需化学灭活，其表面糖蛋白的构象空间没被破坏，与野生病毒一致，因而其具备更好的抗原性、安全性和稳定性。且制备得到的疫苗抗体效价高，效果明显；适用范围广，可作为标记疫苗使用，具有较好的实际应用价值。

(2)本发明用表达猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒的重组杆状病毒质粒载体转染昆虫细胞，得到细胞培养液，回收并纯化所述细胞培养液，获得所述猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，该方法表达水平高，安全性好，表达产物可保持天然结构、生物活性和免疫活性，且易于大规模生产和纯化猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒。

附图说明

图1为实施例1提供的嵌合型病毒样颗粒csf-alvgag重组质粒结构示意图；

图2为实施例1提供的嵌合型病毒样颗粒csf-hivgag重组质粒的结构示意图；

图3为实施例1中csf-alvgag重组质粒的dna凝胶电泳结果示意图；

图4为实施例1中csf-hivgag重组质粒的dna凝胶电泳结果示意图；

图5为实施例2中收获的细胞上清液中csf-alvgag病毒样颗粒所含的e0蛋白的westernblot检测结果示意图；

图6为实施例2中收获的细胞上清液中csf-alvgag病毒样颗粒所含的e2蛋白的westernblot检测结果示意图；

图7为实施例2中收获的细胞上清液中csf-alvgag病毒样颗粒所含的alv-gag蛋白的westernblot检测结果示意图；

图8为实施例2中收获的细胞上清液中csf-hivgag病毒样颗粒所含的hiv-gag蛋白的westernblot检测结果示意图。

图9为实施例3中不连续蔗糖密度梯度超速离心含有csf-alvgag病毒样颗粒的细胞上清液所形成的两条条带的结果示意图；

图10为实施例3提供的csf-alvgag病毒样颗粒电镜图；

图11为实施例4中e2-6xhis蛋白纯化前后sds蛋白变性电泳胶的结果示意图；

图12为实施例4中e2-6xhis蛋白纯化后westernblots检测结果示意图；

图13为实施例5中elisa检测csf-alvgag疫苗免疫小鼠的抗体水平结果示意图；

图14为实施例6中elisa检测csf-alvgag疫苗免疫大白兔的抗体水平结果示意图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。

实施例1：表达载体csf-alvgag、csf-hivgag重组质粒的构建及检测

本发明的一种猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒，该嵌合型病毒样颗粒包含逆转录病毒的gag前体蛋白、猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0和猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2。其中逆转录病毒的gag前体蛋白为鸡白血病病毒前体蛋白alv-gag或人免疫缺陷病毒前体蛋白hiv-gag。猪瘟病毒囊膜蛋白e2和e0来源于所有猪瘟病毒基因亚型株的囊膜蛋白e2和e0，优选地，猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒所含的囊膜蛋白e2和e0来自于猪瘟病毒2.1基因亚型株。猪瘟病毒表面囊膜蛋白e0的氨基酸序列如seqidno.1所示，猪瘟病毒表面囊膜蛋白e2的氨基酸序列如seqidno.3所示，鸡白血病病毒前体蛋白alv-gag的氨基酸序列如seqidno.5所示，人免疫缺陷病毒前体蛋白hiv-gag的氨基酸序列如seqidno.7所示。

根据猪瘟病毒2.1基因亚型毒株的流行趋势同时结合抗原分析和密码子优化，人工合成了猪瘟病毒e0囊膜蛋白基因(编码蛋白的碱基如seqidno.2所示)、e2囊膜蛋白基因(编码蛋白的碱基如seqidno.4所示)，以及两个反转录病毒(鸡白血病病毒alv，人免疫缺陷病毒hiv-1)的gag前体蛋白基因(编码蛋白的两个碱基序列分别如seqidno.6和seqidno.8所示)。当然，由于氨基酸密码子的简并性，一个确定的蛋白氨基酸序列，可以有成千上万种表达序列，表达猪瘟e0囊膜蛋白、e2囊膜蛋白、alv-gag蛋白和hiv-gag蛋白的碱基序列并不唯一，本实施例中优选为如seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6和seqidno.8所示的序列。

本实施例以表达载体csf-alvgag重组质粒的构建为例来进行说明，具体方法如下：

用pcr扩增人工合成的e2囊膜蛋白基因dna片段，过柱抽提纯化后，用限制性内切酶37℃两小时水解。跑凝胶电泳及再次过柱抽提纯化，备用。昆虫杆状病毒表达质粒pfastbac经同样限制性内切酶37℃两小时水解后，用上述同样方法纯化处理。在t4dna连接酶作用下，将上述处理好的e2基因dna片段连接到经处理后的pfastbac质粒载体上；将所得的重组质粒转化dh5α感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落进行pcr反应；37℃摇床培养所选pcr验证阳性的白色菌落细菌，进行dna质粒抽提，获得重组质粒pfastbac-e2；重复上述实验步骤，将e0基因片段和alvgag基因片段克隆到pfastbac-e2载体上，得到csf-alvgag重组质粒。

用上述同样的构建方法和步骤得到csf-hivgag重组质粒。

将所得的两个重组质粒分别转化dh10bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，挑选白色菌落。37℃摇床培养所选菌落细菌，进行大分子dna质粒抽提，获得两个不同的重组杆状病毒质粒bacmid，两个重组bacmid质粒的示意图分别见图1和图2。

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，分别用获得的两个重组杆状病毒质粒bacmidcsf-alvgag、bacmidcsf-hivgag做细胞转染，六天后分别收获含有对应的重组杆状病毒的细胞培养上清液。加入含有sds的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得各重组杆状病毒dna；分别以各dna做模板，加入对应的pcr引物，分别进行pcr扩增反应。其中：

e2基因的上游引物序列为seqidno.9所示序列；

e2基因的下游引物序列为seqidno.10所示序列；

e0基因的上游引物序列为seqidno.11所示序列；

e0基因的下游引物序列为seqidno.12所示序列；

alv-gag基因的上游引物序列为seqidno.13所示序列；

alv-gag基因的下游引物序列为seqidno.14所示序列；

hiv-gag基因的上游引物序列为seqidno.15所示序列；

hiv-gag基因的下游引物序列为seqidno.16所示序列。

电泳凝胶检测扩增结果如图3和图4所示，从图中可以看出，扩增的目的条带与目的基因片段大小一致，说明载体构建正确。

实施例2：猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的制备方法

本实施例提供表达制备猪瘟病毒的嵌合型病毒样颗粒的方法及检测所表达的目的蛋白。

1.本实施例首先以表达制备csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒及检测所表达的目的蛋白为例进行说明，具体方法如下：

在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，采用脂质法将重组杆状病毒质粒csf-alvgag进行转染，六天后收取细胞上清液，获得第一代重组杆状病毒毒种，称为p1代。用p1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为p2代。再用p2代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得p3代。以p3代作为生产毒种，制备猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒csf-alvgag。即将生长状态良好的sf-9细胞接种到摇瓶中悬浮培养，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×10⁶个细胞。将p3代毒种按moi为0.1比率接种到细胞摇瓶中，3至4天后收获细胞上清液，检测猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒csf-alvgag的生成。

采用westernblot的方法分别检测收获的细胞上清液中的猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒中的e2蛋白和e0蛋白，操作方法如下：分别向10μl的细胞上清液中加入10μl电泳上样液混合，进行sds-page电泳，然后做westernblot的印膜转印。采用商品化的抗e2蛋白兔源多抗及抗e0蛋白兔源多抗做为一抗分别进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ecl化学发光试剂曝光转印膜，显影后可见胶片上清晰的e0和e2蛋白条带。检测结果如图5和图6所示。

同样采用westernblot的方法检测收获的细胞上清液中的鸡白血病病毒前体蛋白alvgag；用抗alvgagp26兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ecl化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的gag前体蛋白条带，检测结果如图7所示。图中csf-alvgag表示病毒样颗粒。

2.csf-hivgag嵌合型病毒样颗粒的制备及检测所表达的目的蛋白

csf-hivgag嵌合型病毒样颗粒的制备方法与csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒相同，用westernblot的方法分别检测收获的细胞上清液中的猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒csf-hivgag中的e2蛋白和e0的方法亦如上所述。

用westernblot方法检测收获的细胞上清液中的人免疫缺陷病毒hiv-1的前体蛋白hiv-gag：用抗hivgagp24兔源多抗作为一抗进行孵育，再用羊抗兔的二抗孵育。用ecl化学发光试剂曝光胶片，显影后可见胶片上清晰的hiv-gag前体蛋白条带，检测结果如图8所示。图中hiv-alvgag表示病毒样颗粒。

从以上两种细胞上清液中均能成功检测到目的蛋白，说明重组于杆状病毒大分子dna链中的各目的蛋白均表达成功并自组装成猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒。

实施例3：猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒的纯化

本实施例提供猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒的纯化方法和电镜观察结果。

本实施例以制备的csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒的纯化和电镜结果为例进行说明，具体方法如下：

采用不连续蔗糖密梯超速离心来纯化猪瘟病毒嵌合病毒样颗粒csf-alvgag。将收集的20ml细胞上清液用角转超速离心机4℃，100000xg，离心1个小时，弃掉离心的上清，加入5mlpbs悬浮溶解过夜。配制蔗糖溶液，质量百分比浓度分别配成20％、45％及60％，小心装入超速离心管中制成不连续蔗糖密度梯度。在顶层加入上述过夜的5mlpbs悬浮液，用水平转头进行超速离心，4℃，100000xg，时间1小时。在20％与45％交界处以及45％及60％交界处各有一条带，而位于20％与45％交界处的条带最为显著(见图9)。收集此处的条带，其内含有纯化的csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒。

电镜拍片实验操作如下：将少量的纯化浓缩后的csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒样品固定处理后，置于铜网上，加2％磷钨酸钠溶液进行负染。电子显微镜下观察并拍片。如图10所示，箭头所指，csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒呈圆形，有囊膜。从放大的图10框中还可清晰看到囊膜上有一圈明显的放射状纤突，即为表达的猪瘟病毒囊膜蛋白e2和e0。

实施例4：免疫小鼠血清抗体效价的测定

本实施例以csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒验证制备的嵌合型病毒样颗粒疫苗能刺激小鼠体内产生抗体以及检测所产生的抗体效价。

csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗的制备方法如下：将csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒上清液与赛彼科佐剂(montanidetmisa201vg)按1：1(体积比)比率混匀乳化成乳白色液体。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕。将此疫苗将用于免疫实验小鼠。

小鼠的免疫试验步骤如下：将12只6-8周龄的昆明小鼠分成2组，第一组10只，在每只小鼠背部皮下多点注射总剂量为300ul的csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗。第二组2只，用于实验平行的阴性对照。一免后第28天加强注射一针，并于此二免后第24天采集血清，检测抗体滴度。

为了便于用酶联免疫吸附实验(elisa)间接法检测免疫小鼠的血清抗体效价，我们构建了在e.coli工程细菌中表达e2囊膜蛋白的表达质粒pet-e2-6xhis。为了便于纯化，在e2基因的末端加上了6xhis序列。表达的e2-6xhis蛋白，经尿素变性、透析复性及组氨酸亲和琼脂糖凝胶纯化后，进行sds凝胶电泳及考马斯亮蓝染色。图11显示了表达及纯化后的e2囊膜蛋白条带。用westernblot及抗组氨酸短肽的兔源多抗做一抗，羊抗兔的二抗孵育，获得与预期一致的清晰条带(见图12)。因此，表达并纯化的e2-6xhis蛋白可用于做elisa检测抗原。

elisa间接法检测免疫小鼠的血清中e2囊膜蛋白抗体效价具体操作方法如下：10ml的包被液中加入10ul纯化好的e2-6xhis囊膜蛋白，混匀，elisa板中每孔加入100ul，保鲜膜包好4℃过夜；第二天早上倒掉板中液体，加入pbs-t溶液200ul/孔洗2-3次，拍干。加封闭液200ul/孔，保鲜膜包好，37℃反应2h。用pbs-t溶液200ul/孔洗3次，拍干；在酶标板上做好对应标记，用pbs按1：1000稀释采集的各实验小鼠抗体血清以及空白对照血清，混匀后在酶标板的第一排加入200ul，后边所有各排孔内先各加入100ul的pbs，之后从第一排吸取100ul稀释血清加入第二排，以此类推进行倍比稀释。最后一排不加倍比稀释血清，做为板孔的底色空白对照。加完后封好，37℃孵育1小时。倒掉反应液，加pbs-t200ul/孔，洗涤3次，拍干；用pbs1：5000稀释含偶联辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,hrp)的羊抗鼠二抗100ul/孔，37℃孵育45分钟；倒掉反应液，用pbs-t200ul/孔洗涤3次，拍干；加入配好的tmb100ul/孔，显色10-15分钟，加入终止液50ul/孔，用酶标仪取波长450测定每孔od值，结果见表1。根据空白对照孔的平均od值，用常规cutoff公式(空白孔平均值+3x标准差sd)，计算出csf-alvgag抗原板cutoff为0.3469，以此判定血清检测结果的抗体滴度，结果如图13所示。

表1elisa检测csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗免疫小鼠的血清od值

实施例5：免疫大白兔血清抗体效价的测定

本实施例以csf-alvgag嵌合型病毒样颗粒验证制备的嵌合型病毒样颗粒疫苗能刺激大白兔体内产生抗体以及检测所产生的抗体效价。

csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗的制备方法如实施例4所述，即抗原与佐剂按1：1体积混匀，乳化成乳液状。取1ml乳液经5000rpm离心15分钟，不出现分层为乳化达标，疫苗制备完毕。本实施例制备的疫苗所用佐剂有两种，弗氏佐剂和赛彼科201佐剂。

兔子的免疫试验步骤如下：取背景干净的实验用日本大耳白兔(1.5公斤左右)4只，分成2组，每组2只，具体分组内容见表2。每只兔子在免疫前各取血10ml，作为阴性对照使用。第一次免疫，每只兔子背部皮下多点注射1000ul的csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗。一免后第28天加强注射一针并于二免后第10天采集血清，检测抗体滴度。

表2实验兔分组安排

酶联免疫吸附间接法(elisa)检测免疫兔子的血清抗体效价，具体操作按实施例4所述方法执行。图14为用csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒疫苗免疫兔子的抗体滴度示意图。

实施例6：

本实施例验证制备的csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒能作为理想抗原，有效地鉴别商品猪瘟疫苗免疫后猪血清抗体的阴阳性。

从一个规模化养猪场随机采集到20头份猪血清，每份猪血清按1：40稀释；将市面上购买的商品猪瘟e2抗原蛋白(杭州亿米诺公司产品)配制成浓度2ul/ml，做为包板的抗原；将csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒上清按1：500稀释，也作为包板的抗原。用hrp-小鼠抗猪igg单抗(北京百奥莱博公司产品)做为二抗，按1：2000稀释。

用酶联免疫吸附间接法(elisa)检测稀释后的每头猪血清的抗体od值，具体elisa检测操作方法同实施例4。实验结果分析以cutoff值均设定为0.2，将检测到的各孔od值与之对比，判定各血清检测结果的阴阳性。实验结果见表3。根据表3中数据的比较可以看出，csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒能有效地检测商品猪瘟疫苗所产生的猪只免疫抗体，且与商品e2抗原一样，能有效地鉴别检验猪只血清抗体的阴阳性。

表3猪血清抗体阴阳性的鉴别比较

综上所述，本发明提供的csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒能用于制备疫苗，且能使免疫动物小鼠和兔子产生免疫应答并产生相应的抗体，因此可以将csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒作为抗原应用于疫苗的制备；同时csf-alvgag嵌和型病毒样颗粒也可以应用于制备猪瘟病毒抗体检测试剂或猪瘟病毒疫病监测制剂。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>诺华生物科技（武汉）有限责任公司

许雁

<120>猪瘟病毒嵌合型病毒样颗粒、制备方法及其应用和疫苗

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>246

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metalaleuleualatrpalavalilethrilemetleutyrglnpro

151015

valglualagluasnilethrglntrpasnleuseraspasnglythr

202530

asnglyileglnhisalamettyrleuargglyvalserargserleu

354045

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505560

alathraspthrgluleulysgluileglnglymetmetaspalaser

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gluglythrasntyrthrcyscyslysleuglnarghisglutrpasn

859095

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130135140

thrglnalaargasnargprothrthrleuthrglycyslyslysgly

145150155160

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195200205

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210215220

argglnleuserthralaglylysargleugluglyargserlysthr

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245

<210>2

<211>741

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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aacatcacacagtggaacctgtccgacaacggtaccaacggtatccagcacgctatgtac120

ctcagaggagtctccagatccttgcacggaatctggcctgagaagatctgcaagggagtc180

cctacatacctggctaccgataccgagttgaaggagatccagggtatgatggacgcttcc240

gagggaacaaactacacctgttgcaagctgcagagacacgagtggaacaagcacggatgg300

tgtaactggtacaacatcgacccatggatccagctcatgaaccgtacccaggctaacttg360

gctgagggaccacctgctaaagagtgtgctgttacctgtcgttacgacaaggacgctgac420

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