多肽、其制备方法及抑制艾滋病病毒的用途与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于灭活艾滋病病毒的治疗剂。
背景技术：
：据联合国艾滋病规划署(unaids)提供的资料显示，从上世纪80年代被发现以来，人类免疫缺陷病毒(hiv)已经造成了累计超过七千万人被感染以及超过三千万人死亡，现在，每年仍有约两百万的新增感染病例出现。由于到目前为止仍没有治愈药物以及疫苗面世，所以艾滋病仍然是人类公共卫生领域的重大威胁。有效治疗一直是该领域研究的关注热点。高效联合抗逆转录病毒治疗(haart)的出现已使hiv感染者发生aids的发病率和死亡大为降低，但现在临床使用的药物都还存在毒副作用强、易诱导抗药性病毒株等缺点。并且，它们均无法清除hiv潜伏库及治愈艾滋病，需终身使用，一旦停药艾滋病患者体内的病毒载量将会快速反弹。因此，研发靶向hiv新靶点、并可清除hiv潜伏细胞库从而治愈艾滋病的新型药物成为全球研究领域的热点及前沿。本发明提出的来源于hiv包膜蛋白gp41亚单位胞内段的多肽，靶向gp41更为保守的胞内段，是一个全新的抑制hiv靶点。同时，以前的艾滋病药物均作用于hiv感染靶细胞的过程中，不能靶向游离的hiv病毒。本发明提出的多肽能直接灭活hiv游离病毒，用于hiv的预防。更为重要的是现在提出的蛋白类灭活剂以及广谱中和抗体均只能中和hiv，仍无法杀灭hiv感染的细胞，特别是hiv潜伏感染的细胞，因此无法清除hiv潜伏库和治愈艾滋病。本发明提出一种具有灭活hiv病毒颗粒和杀灭hiv感染细胞(特别是被激活的hiv潜伏细胞)双功能的新型多肽类灭活剂，与hiv潜伏激活剂联用时，有希望通过当前国际上的热点策略-“shockandkill”，达到清除hiv潜伏库治愈艾滋病的目的。技术实现要素：本发明提供以下内容：本发明提供了多肽及其衍生物、立体异构体、或其盐，其特异性结合hiv包膜蛋白胞内段，优选是包含以seqidno:28所示的氨基酸序列的慢病毒裂解肽-1llp1(lentivirallyticpeptides-1)结构域。多肽破坏脂质双分子层，优选地hiv病毒颗粒包膜以及受hiv感染的宿主细胞膜，并且造成hiv病毒颗粒、hiv感染细胞以及激活的hiv潜伏细胞的裂解。提及多肽包括其衍生物、立体异构体、或其盐。在一个实施方案中，多肽包含根据以下通式所示的氨基酸序列：x-w/a-e/a-a/e-l/a-x-y/a-l/a-w/a-n/a-l/a-l/a-q/a-y/a-w/a。在一个实施方案中，多肽包含以seqidno:1所示的氨基酸序列：x-w-e-a-l-x-y-l-w-n-l-l-q-y-w(式1)；其中x表示任何氨基酸，优选为g或a或与它们具有相似特性的氨基酸残基；符号“-”表示氨基酸残基之间的肽键，符号“/”表示所示的氨基酸能互换使用；优选地，多肽包含以seqidno:2所示的氨基酸序列：gwealkylwnllqyw；以seqidno:3所示的氨基酸序列：awealkylwnllqyw；以seqidno:4所示的氨基酸序列：gaealkylwnllqyw；以seqidno:5所示的氨基酸序列：gwaalkylwnllqyw；以seqidno:6所示的氨基酸序列：gweelkylwnllqyw；以seqidno:7所示的氨基酸序列：gweaakylwnllqyw；以seqidno:8所示的氨基酸序列：gwealaylwnllqyw；以seqidno:9所示的氨基酸序列：gwealkalwnllqyw；以seqidno:10所示的氨基酸序列：gwealkyawnllqyw；以seqidno:11所示的氨基酸序列：gwealkylanllqyw；以seqidno:12所示的氨基酸序列：gwealkylwallqyw；以seqidno:13所示的氨基酸序列：gwealkylwnalqyw；以seqidno:14所示的氨基酸序列：gwealkylwnlaqyw；以seqidno:15所示的氨基酸序列：gwealkylwnllayw；以seqidno:16所示的氨基酸序列：gwealkylwnllqaw；以seqidno:17所示的氨基酸序列：gwealkylwnllqya。优选地，所述多肽包含(1)与以seqidno:1-17中任一种所示的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、94％、95％相同的氨基酸序列或(2)以seqidno:1-17中任一种所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入1个或多个，优选2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列，所述取代优选是保守氨基酸取代。序列骨架来源于hiv-1groupm包膜蛋白，位于其包膜蛋白的789-803位，属于其包膜内llp3(lentivirallyticpeptides-3,aa789-815)结构域。在本发明中，多肽f9170包含式1骨架，具有灭活病毒以及感染细胞的作用。在一个实施方案中，衍生物选自：经马来酰亚胺修饰得到的衍生物；在氨基末端连接氨基端保护基和/或羧基末端连接羧基端保护基得到的衍生物；经蛋白质或聚乙二醇修饰得到的衍生物；在氨基末端和/或羧基末端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的衍生物；或者用构象为d-型的氨基酸，人工修饰的氨基酸以及自然界存在的稀有氨基酸取代后获得的衍生物以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。在一个实施方案中，氨基端保护基为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基、或苄基或其他疏水基团，所述羧基端保护基为nh2、羧基、酰胺基、叔丁氧羰基或其他疏水性基团。在一个实施方案中，寡肽包含2-10个氨基酸，所述亲脂性基团是含有3-20个碳原子的脂肪酸链。另一方面，本发明提供了融合蛋白、药物组合物或缀合物。所述融合蛋白可以包含根据本发明的多肽或所述多肽的衍生物、立体异构体或盐和用于治疗或预防hiv感染的另一种蛋白质，或针对hiv包膜蛋白胞内段，优选地包含以seqidno:28所示的氨基酸序列的慢病毒裂解肽-1llp1结构域的抗体。药物组合物可以包含根据本发明的多肽或所述多肽的衍生物、立体异构体或盐和表2中列出的一种或多种hiv治疗剂或hiv潜伏细胞激活剂。缀合物可以包含根据本发明的多肽和载体蛋白。载体蛋白可以选自血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、转铁蛋白、α-2-巨球蛋白、甲状腺素结合蛋白和类固醇结合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白或缀合物特异性结合hiv包膜蛋白胞内段，优选是包含以seqidno:28所示的氨基酸序列的慢病毒裂解肽-1llp1结构域，且优选破坏脂质双分子层，优选是hiv病毒颗粒包膜以及受hiv感染的宿主细胞膜，并且造成hiv病毒颗粒、hiv感染细胞以及激活的hiv潜伏细胞的裂解。另一方面，本发明提供了核苷酸序列，其编码根据本发明的多肽或所述多肽的衍生物、立体异构体或盐或融合蛋白。另一方面，本发明提供了载体，其包含根据本发明的核苷酸序列。另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含根据本发明的载体。另一方面，本发明提供了生成根据本发明的多肽或融合蛋白的方法，其包括：(1)将根据本发明的载体导入宿主细胞中；(2)在合适的培养基中培养所述宿主细胞；并且(3)收获并分离根据本发明的多肽或融合蛋白；或者以化学方法合成根据本发明的多肽或融合蛋白。另一方面，本发明提供了多肽、融合蛋白、药物组合物或缀合物、核苷酸、载体、宿主细胞和任选的另一种多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防和/或辅助治疗hiv感染所致疾病，如艾滋病，其中所述另一种多肽是表2中列出的一种或多种hiv治疗剂。另一方面，本发明提供了多肽、融合蛋白、药物组合物或缀合物、核苷酸、载体、宿主细胞和任选的另一种试剂在体外用于下列任一项的用途：(1)抑制hiv感染；(2)裂解hiv；(3)裂解hiv感染的细胞；(4)裂解激活的hiv潜伏细胞，(5)制备具有体外抑制hiv感染活性的生物制剂，其中所述另一种试剂是表2中列出的一种或多种hiv治疗剂。在本发明中，药物的剂型是片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂。在一个实施方案中，药物通过以下方式给药：注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药；表面给药。在一个实施方案中，药物用作hiv预防用药。本发明的多肽f9170相比以前的hiv药物具有以下优点：1)本发明靶向来源于hiv包膜蛋白胞内段llp1(lentivirallyticpeptides-1,aa828-856)结构域的835-849位氨基酸残基，是一个从来没有报道过的抑制hiv新靶点。hiv包膜蛋白胞内域高度保守，靶向该靶点的药物将具有广谱且不易产生耐药株等优点。2)本发明能特异性灭活hiv游离病毒，而不抑制含有其他包膜蛋白的病毒。现在的hiv药物均作用在hiv与靶细胞结合之后的过程，而本发明能直接造成hiv游离病毒的裂解，病毒基因组rna的释放，是理想的被改造成杀微生物剂的原料。杀微生物剂能局部应用，用于hiv的预防，能弥补现在没有有效hiv疫苗的缺陷。3)本发明能造成表达hiv包膜蛋白的细胞裂解。hiv感染靶细胞后，利用宿主细胞合成自身结构和非结构蛋白，最后通过出芽的形式释放出细胞，感染其他细胞，扩大体内传播。所以，hiv感染细胞包膜上也表达hiv的包膜蛋白。本发明同样通过结合llp1结构域造成被感染细胞的裂解。本发明对于hiv病毒以及hiv感染细胞的双重作用，有利于体内hiv的清除。4)本发明能造成被潜伏激活剂激活的hiv潜伏细胞的裂解。hiv无法治愈的一个重要因素就是hiv的潜伏感染。为了清除hiv潜伏细胞从而治愈艾滋病，目前国际上正聚焦于研究“shockandkill”策略。该策略的核心是将hiv潜伏细胞激活剂与hiv药物联合使用，先利用hiv潜伏细胞激活剂使其开启生活周期产生新的病毒然后再用现有艾滋药物(如haart)抑制新生hiv的感染。但深入的研究发现，“shock”激活的潜伏细胞不会自行快速的死亡，仍可在体内长期存在，而haart等艾滋病药物也无法清除掉这些潜伏细胞。为了解决这一问题，目前国际上主要的策略是希望通过治疗型疫苗来诱导针对被激活的潜伏细胞的特异性细胞毒t淋巴细胞(ctl)来将其清除，但由于艾滋病患者本身的免疫系统已遭到较大的破坏，在其体内诱导大量高效的特异性细胞毒t淋巴细胞是极其困难的。并且，已形成ctl免疫逃逸的hiv病毒基因组是艾滋病患者体内hiv潜伏细胞所含有的hiv基因组的主体。而本发明靶向hiv的保守序列，且能有效裂解激活的hiv潜伏细胞，将是“shockandkill”策略所需组合药物的有利候选。5)本发明多肽进入体内后，能通过血脑屏障，进入小鼠的脑部。hiv不能被彻底清除的另一重要原因就是hiv能进入大脑等免疫细胞很难到达的区域。本发明多肽能进入大脑，直接裂解hiv游离病毒以及hiv感染细胞，有利于患者体内hiv的彻底清除。6)本发明所提出的多肽对于小鼠没有显示出毒性，且能均匀分布于小鼠体内，没有表现出在某器官或系统的聚集，有利于其清除各系统的hiv病毒。7)hiv融合抑制剂同样靶向hiv包膜蛋白gp41亚单位，本发明对于融合抑制剂抗性株仍然有抑制以及灭活效果。8)目前唯一被美国食品药品监督管理局(fda)批准上市的hiv多肽类融合抑制剂-t20(seqidno:18)序列包含36个氨基酸残基，而本发明仅包含15个氨基酸残基，将有利于降低药物合成成本。本发明为进一步研发艾滋病治疗治愈和预防药物提供了思路。为了更清楚地阐释本发明，以下结合具体图例和实施例进行说明。附图说明图1a-c：通过酶联免疫吸附实验(elisa)检测f9170与hiv包膜蛋白上各个结构域的结合。gp120(seqidno:19)：hiv包膜蛋白gp120亚单位；gp140(seqidno:20):hiv包膜蛋白除去穿膜结构域和胞内序列的部分；n63(seqidno:21)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上nhr结构域；c34(seqidno:22)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上chr结构域；mper(seqidno:23)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上近膜结构域；llp1(seqidno:24)/llp2(seqidno:25)/llp3(seqidno:26)：hiv包膜蛋白亚单位gp41胞内段llp1/llp2/llp3结构域；llp1-rh(seqidno:27)：llp1上828-842位氨基酸序列；llp1-gq(seqidno:28)：llp1上835-849位氨基酸序列；llp1-hl(seqidno:29)：llp1上842-856位氨基酸序列。结果显示f9170特异性结合llp1结构域的llp1-gq段。图2a-d为通过elisa检测hiv结构蛋白p24的量，来检测f9170针对hiv病毒株的灭活能力。a,b,c,d四图分别表示不同浓度f9170对hiv-1iiib株，bal株，tza68/125a株以及92th009株的灭活效果。结果显示f9170与hiv病毒孵育后，能有效抑制病毒对靶细胞的感染能力。f9170的乱序多肽(seqidno:30)和hiv融合抑制剂t20(seqidno:18)则没有这种效果。图3a-b为f9170对假病毒的抑制作用。hiv包膜蛋白质粒或者mers-cov包膜蛋白质粒分别被与hiv骨架质粒一起用于包装hiv(a)或者mers-cov(b)假病毒。f9170对于hiv假病毒有浓度依赖的抑制作用，但是对于mers-cov假病毒则没有。mers-cov的抑制剂hr2pm2(seqidno:31)则有相反的效果。图4a-c为f9170对hiv的裂解作用。a,不同浓度的f9170与hiv病毒孵育后，用rna酶消化被释放出的hiv基因组后，再检测样品中剩余hivrna的量。结果显示5μm的f9170就造成了80％以上的hiv裂解。b,c,将hiv病毒与tritonx-100、f9170以及dmso分别孵育后，在具有梯度浓度的蔗糖溶液中离心。分别检测各组分hivrna的量以及p24的量。结果显示，tritonx-100组rna集中在组分7-9，而其衣壳蛋白p24集中在组分1-3，f9170组rna集中在组分6-8，而其衣壳蛋白p24集中在组分1-3，dmso组rna集中在组分4-7，其衣壳蛋白p24集中在组分4-6。dmso组两者分布较为一致，而tritonx-100与f9170组rna与衣壳蛋白分布不一致，说明tritonx-100和f9170能造成hiv病毒颗粒的裂解，造成rna的释放。图5a-b为f9170对感染hiv细胞的裂解。a,h9/iiib细胞系为长期稳定感染hiv-1iiib株的h9细胞系。结果显示f9170能裂解h9/iiib细胞且呈浓度依赖途径，对h9细胞则没有毒性。b,jurkathxbc2细胞为稳定表达hivhxb2株包膜蛋白的jurkat细胞系，jurkat713stop细胞为稳定表达hivhxb2株包膜蛋白胞外段的jurkat细胞系。结果显示f9170仅能裂解表达包膜蛋白全长的jurkathxbc2细胞且呈浓度依赖途径，对不含包膜蛋白胞内段的jurkat713stop细胞则没有毒性。图6a-b为f9170对激活的hiv潜伏细胞的裂解。结果显示f9170能裂解重新激活的hiv潜伏细胞且呈浓度依赖途径，对潜伏细胞则没有毒性。f9170乱序多肽则没有同样的效果。图7为f9170突变多肽抑制hiv病毒感染的活性。f9170多肽被单位点突变后(seqno:3-17)，对hiv-1iiib病毒仍然有抑制活性。图8a-d为f9170在小鼠体内的分布。a,b,小动物活体成像显示小鼠被注射f9170后，f9170均匀分布于小鼠肝脏，膀胱和脑部。c,a的统计数据。d,b的统计数据。图9为f9170的安全性。注射f9170不会改变小鼠的体重增长。具体实施方式本发明提供了多肽，其特异性结合hiv包膜蛋白胞内段，优选是包含以seqidno:28所示的氨基酸序列的慢病毒裂解肽-1llp1(lentivirallyticpeptides-1)结构域。多肽包括其衍生物、立体异构体、或其盐。脂质双分子层又称为磷脂双分子层，是构成细胞膜的基本支架。在本文中，脂质双分子层包括hiv病毒颗粒包膜以及受hiv感染的宿主细胞膜。脂质双分子层的破坏造成hiv病毒颗粒、受hiv感染细胞以及激活的hiv潜伏细胞的裂解。在本文中，多肽可以包括以seqidno:1-17中任一种所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入1个或多个，优选2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列。氨基酸添加指在氨基酸序列，例如seqidno:1-17中任一种的c端或n端添加氨基酸，只要本发明的多肽保留特异性破坏包含hiv包膜蛋白的脂质双分子层，造成hiv病毒颗粒、受hiv感染细胞以及激活的hiv潜伏细胞的裂解的效果。氨基酸取代指在氨基酸序列，例如seqidno:1-17中任一种的序列的某个位置的某个氨基酸残基被其他氨基酸残基替代，只要本发明的多肽保留上述效果。氨基酸插入指在氨基酸序列例如seqidno:1-17中任一种的序列的适当位置插入氨基酸残基，插入的氨基酸残基也可以全部或部分彼此相邻，或插入的氨基酸之间都不彼此相邻，只要本发明的多肽保留上述效果。氨基酸缺失指可以从氨基酸序列，例如seqidno:1-17中任一种的序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要本发明的多肽保留上述效果。在本发明中，取代可以是保守氨基酸取代，指与seqidno:1-17中任一种的氨基酸序列相比，有3个，更佳地2个氨基酸或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成肽。这些保守性变异肽可以根据表1进行氨基酸替换而产生。表1：氨基酸保守取代最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met：phe：alaleu本文的多肽序列中的所有氨基酸可为l型氨基酸，其中的一个或多个(如2-5个、2-4个或2-3个)氨基酸也可以用构象为d型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或抗病毒活性。其中d型氨基酸是指与组成蛋白质的l型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见l型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。本发明的药用盐，包括醋酸盐、乳糖醛酸盐、苯磺酸盐、月桂酸酯、安息香酸盐、苹果酸盐、重碳酸盐、马来酸盐、硫酸氢盐、扁桃酸盐、酒石酸氢盐、甲磺酸盐、硼酸盐、溴甲烷、溴化物、硝酸甲酯、依地酸钙、甲基硫酸盐、右旋樟脑磺酸、粘酸盐、碳酸盐、萘磺酸盐、氯化物、硝酸盐、棒酸盐、n-甲葡糖胺、柠檬酸盐、铵盐、二氢氯化物、油酸盐、乙二胺四乙酸盐、草酸盐、乙二磺酸盐、扑酸盐、棕榈酸盐、乙磺酸酯、泛酸盐、延胡索酸盐、磷酸盐/二磷酸、葡庚糖酸盐、聚半乳糖醛酸盐、葡(萄)糖酸盐、水杨酸盐、谷氨酸盐、硬脂酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸、硫酸盐、羟基苯甲酸盐、琥珀酸盐、氢溴酸盐、丹宁酸盐、氢氯化物、酒石酸盐、羟萘酸盐、8-氯茶碱盐、碘化物、甲苯磺酸盐、三乙基碘、乳酸盐、戊酸盐等。取决于用途，药用盐可以由阳离子如钠、钾、铝、钙、锂、锰和锌、铋等所形成，也可由碱如氨、乙二胺、n-甲基-谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇氨、普鲁卡因、二乙胺、哌嗪、三羟甲基氨基甲烷和羟化四甲铵等所形成。这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物、氢溴化物、醋酸盐、扑酸盐等可用作剂型；在一个酸性基团(如-cooh)或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯、马来酸酯、三甲基乙酸氯甲酯等以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。上文中，亲脂性化合物可以连接在末端氨基酸的侧链上，也可直接连接在肽链上。上述衍生物中，所述氨基端保护基可为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团；所述羧基端保护基可为氨基、酰胺基、羧基、或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。在缀合物中，载体蛋白为下述一种或其任意组合：血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、转铁蛋白、α-2-巨球蛋白、甲状腺素结合蛋白和类固醇结合蛋白。本发明所提供的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述缀合物、上述多聚体和上述组合物，可以用于hiv感染的治疗，也可以用hiv感染的预防，包括暴露前或可疑暴露后，例如输血、器官移植、体液交换、咬伤、意外针刺或手术中暴露于患者血液等。本发明包含的多肽及其衍生物以及药用盐可单独或者作为组合物应用于hiv感染者的治疗。实际应用中可与各种适宜的载体材料或赋形剂混合，可制成多种剂型。可以是普通制剂，控释制剂，缓释制剂以及各种微粒给药系统。可以与逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等抗hiv药物一起应用于艾滋病的治疗。可以以凝胶形式作为hiv杀微生物剂。可以与逆转hiv潜伏的药物联用作为hiv的治愈策略。可以与hiv广谱中和抗体连接或者联合使用，用于hiv的治疗。在实际应用中，可以将本发明的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述偶合物、上述多聚体和上述组合物作为药物直接给予患者、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予患者，以达到治疗和/或预防hiv感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中，栓剂可为阴道栓剂，也可以是阴道环，也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药，优选的注射途径是皮下注射。本发明的多肽或其药用盐、其衍生物或其药用盐、上述缀合物、上述多聚体和上述组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。表2：fda批准的hiv治疗剂提供以下实施例以进行说明本发明。实施例实施例1：本发明的多肽的结合实验1.1实验材料与方法基于酶联免疫吸附实验(elisa)检测f9170多肽(seqidno:2)(synpeptideco.,ltd.合成)能否与下列hiv包膜蛋白来源的蛋白或者多肽(均为synpeptideco.,ltd.合成)结合：gp120(seqidno:19)：hiv包膜蛋白gp120亚单位；gp140(seqidno:20):hiv包膜蛋白除去穿膜结构域和胞内序列的部分；n63(seqidno:21)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上nhr结构域；c34(seqidno:22)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上chr结构域；mper(seqidno:23)：hiv包膜蛋白亚单位gp41上近膜结构域；llp1(seqidno:24)/llp2(seqidno:25)/llp3(seqidno:26)：hiv包膜蛋白亚单位gp41胞内段llp1/llp2/llp3结构域；llp1-rh(seqidno:27)：llp1上828-842位氨基酸序列；llp1-gq(seqidno:28)：llp1上835-849位氨基酸序列；llp1-hl(seqidno:29)：llp1上842-856位氨基酸序列。具体地，将50μl各20μg/ml上述蛋白或者多肽(溶剂为含0.5％二甲基亚砜的pbs溶液)单独包被于高吸附性96孔板(corning，货号3690)，4℃孵育过夜。第二天，用pbst溶液(含有0.5％tween的pbs缓冲液，其他实施例中清洗所用清洗溶液同为pbst溶液)清洗96孔板三次后用5％的脱脂牛奶溶液封闭，37℃孵育两个小时。用pbst溶液清洗三遍后加入50μl不同浓度(在与gp120以及gp140蛋白结合实验中为10000，2500，625，156.25纳克/毫升；其他结合实验中为10000，1000，100，10，1纳克/毫升)的生物素修饰的f9170多肽f9170-bio(synpeptideco.,ltd.合成，生物素修饰于多肽氨基端)，37℃孵育一个小时后用pbst溶液清洗三遍。加入50μlsa-hrp(1:3000稀释)(invitrogen，货号434323)后37℃孵育一个小时。用pbst溶液清洗三遍后加入50μl显色底物3,3,5,5-tmb溶液(sigma-aldrich，货号860336)，最后加入50μl的10％硫酸终止显色。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔对450nm光的吸收。将该吸收数值记录做成变化曲线(图1a-c)。1.2实验结果及分析如图1a-c中所示，f9170不与hiv包膜蛋白的胞外段(gp120，gp140，n63，c34，mper)反应。f9170只能结合来自hiv包膜蛋白胞内段的llp1多肽。将llp1截短成llp1rh/gq/hl三条多肽后，f9170只结合llp1-gq，其他两条多肽与其结合能力大为降低，说明f9170结合llp1主要依赖的是llp1-gq所包含的835-849位氨基酸残基。实施例2：本发明的多肽灭活hiv病毒2.1实验材料与方法检测f9170多肽(seqidno:2)、f9170乱序多肽(f9-scr)(seqidno:30)和t20(seqidno:18)(均由synpeptideco.,ltd.合成)灭活hiv病毒株hiv-1iiib、bal、tza68/125a以及92th009病毒株(来自nihaidsreagentprogram，货号分别为398，510，11255，1656)能力的方法如下：将各50μl上述每种hiv病毒(用无血清1640培养基(meilunbio，货号ma0215，所有实施例所用1640培养基均为该产品)稀释，最终浓度为200倍tcid50)以及50μl按倍比稀释(4倍)的f9170多肽、f9170乱序多肽和t20(用无血清1640培养基稀释，起始浓度为5μm)在4℃孵育1小时。加入peg6000(sigma-aldrich，货号1546580)，使其终浓度为3％，4℃再孵育1小时。13,000rpm离心30分钟后，加入含有10mg/mlbsa的3％peg6000进行清洗，再次13,000rpm离心30分钟。用100μl的无血清1640培养基重悬最后的沉淀，加入96孔板中。再加入100μlmt-2(x4)或者m7(r5)细胞(mt-2来自nihaidsreagentprogram，货号237；m7细胞来自sigma-aldrich，货号94022543)(105个/ml，用加入10％血清的1640培养液稀释)，以只加了同等终浓度的mt-2或者m7细胞的孔作为阴性对照，以加入了同等终浓度的hiv病毒和细胞但未加入药物的孔为阳性对照。第五天早上收取上清50μl，并在上清中加入50μl含5％triton的pbs缓冲液，混合后4℃放置过夜。用elisa检测上清中p24的含量来定量hiv-1感染靶细胞的情况。具体地，检测p24需要在前一天晚上在半区96孔板(corning)加入碳酸盐缓冲液(0.05m碳酸钠，0.05m碳酸氢钠，ph9.6)稀释的50μl的hivigg(5μg/ml)(来自nihaidsreagentprogram，货号3957)。4℃放置12个小时，用pbst溶液洗板后加入5％的pbs溶牛奶进行封闭，37℃放置2小时。用pbst溶液洗板后加入收取的上清与加入了5％triton的pbs(上清与pbs的比率为1：1)的混合物10μl，再加入40μlpbs，37℃放置1小时。用pbst溶液洗板后加入50μlpbs稀释的一抗183抗体(1.5μg/ml，培养来自nihaidsreagentprogram的anti-hiv-1p24hybridoma杂交瘤细胞系，货号：1513；收取上清后利用proteingmagneticbeads(newenglandbiolabs，货号：s1430s，参考文献：sisson,t.h.andcastor,c.w.(1990).j.immunol.methods.127,215.)特异性纯化上清中的183抗体)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入pbs稀释的二抗(稀释3000倍，dakodenmarkhrp修饰的兔抗鼠单抗，货号p0260)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入50μl显色底物3,3,5,5-tmb溶液(sigma-aldrich，货号860336)，待3-5分钟，加入10％硫酸终止反应。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔的od450，得出数据。计算每一浓度样品抑制率2.2实验结果及分析hiv病毒株hiv-1iiib、bal、tza68/125a以及92th009病毒与f9170孵育后，不再能感染靶细胞并进行复制，所以高浓度f9170组的病毒抑制率为100％，且灭活曲线呈现浓度依赖的趋势。f9170乱序多肽(f9-scr)和t20则没有这个效果。说明f9170序列能特异性灭活hiv病毒(图2a-d)。实施例3.f9170特异性抑制hiv假病毒。3.1实验材料与方法假病毒包装：将hiv包膜蛋白质粒或者mers-cov包膜蛋白质粒(hiv包膜蛋白质粒来自aidsreagentprogram，货号为324；mers-cov包膜蛋白质粒来自合作研究组纽约血液中心病毒免疫学课题组)分别与hiv骨架质粒(pnl4-3.luc.r-e，来自nihaidsreagentprogram，货号：3418)一起用于包装hiv以及mers-cov假病毒。将两种质粒hiv包膜蛋白质粒或者mers-cov包膜蛋白质粒和hiv骨架质粒(5μgdna融于100μl生理盐水)同时用vigofect试剂(威格拉斯生物技术(北京)有限公司，货号t001)(2μl试剂稀释到100μl生理盐水)根据制造商的使用说明转染进入293t细胞(购自atcc)(前一天加入200,000-400,000个细胞至35mm培养皿)。在37℃培养12个小时之后，dmem培养基(meilunbio，货号mb4732)替换成新鲜的含10％血清的dmem培养基。在37℃继续培养48个小时之后，收集培养的上清，用0.45-μm孔径的过滤膜过滤，上清中即包含hiv以及mers-cov假病毒，分装后-80℃保存备用。抑制假病毒感染实验：50μlhiv或mers-cov假病毒(用无血清dmem培养基稀释，最终浓度为100倍tcid50)与50μl按倍比稀释(2倍，起始浓度为5μm)的f9170多肽或抗mers-cov多肽hr2pm2(seqidno:31，synpeptideco.,ltd.合成)(用无血清dmem培养基稀释，与f9170同等浓度)在37℃孵育30分钟。加入100μlu87cd4+cxcr4+细胞(来自nihaidsreagentprogram，货号：4036)(105个/ml，用加入10％血清的dmem培养基稀释)。在37℃培养12-16个小时后，换成新鲜的加入10％血清的dmem培养基。再培养48个小时之后，弃去上清，加入50μl裂解液(progema，货号：e153a)根据制造商的使用说明裂解细胞，利用进行荧光检测试剂盒(promega,madison,wi)根据制造商的使用说明进行检测。由于假病毒骨架质粒能表达荧光，荧光越高说明感染的假病毒越多。根据每孔的荧光值能计算出该孔的抑制率，计算公式同实施例2。3.2实验结果及分析f9170能浓度依赖性地抑制hiv假病毒感染，但不能抑制含有mers-cov包膜蛋白的假病毒感染(图3a)。抗mers-cov多肽hr2pm2能抑制mers-cov假病毒感染，但不能抑制hiv假病毒的感染(图3b)。综合以上结果，说明f9170特异性地作用于含有hiv包膜蛋白的病毒颗粒上。实施例4.f9170多肽裂解病毒颗粒4.1实验材料与方法rna酶消化实验：将50μlhiv-1bal(来自nihaidsreagentprogram，pbs稀释，最终浓度为100倍tcid50)病毒与50μl不同浓度，分别为0、5、10、25、50μm的f9170或者1％triton在室温孵育两个小时后，加入4μl微球菌核酸酶原液(newenglandbiolabs，货号10011s)在37℃孵育一小时以裂解游离的hivrna基因组。灭活(65℃孵育20分钟)剩余的rna酶后，利用qiagenqiaampviralrnaminikit试剂盒(valencia,货号1020953)根据制造商的使用说明提取剩余完整病毒里面的rna，并利用rtreagentkit试剂盒(takarabio,货号rr037b)根据制造商的使用说明逆转录成cdna。再利用mastercyclereprealplexpcrsystem(eppendorf)荧光定量pcr来检测cdna的量，以此来定量剩余完整病毒的数量(实验条件根据实验仪器和试剂盒所附带的指导手册制定)。在荧光定量pcr实验中，我们使用了两对不同的引物，以确保检测的准确性：hiv-env-f1:ggagcagcaggaagcactatgg；hiv-env-r1:gcctcaatagccctcagcagat；hiv-env-f2:catcaagcagctccaggcaaga；hiv-env-r2:tgtcccactccatccaggtcat本实施例所采用的q-pcr设置为：95℃10s，(95℃5s+60℃30s)*40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s。4.2蔗糖梯度离心实验：将50μlhiv-1bal(来自nihaidsreagentprogram，pbs稀释，最终浓度为100倍tcid50)分别与50μl1％dmso,100μμf9170,1％tritonx-100在37℃孵育2小时。准备梯度浓度的蔗糖溶液(20％，30％，40％，50％，60％，70％)1.5ml，按从高浓度到低浓度的顺序加入离心管中。然后在蔗糖溶液最顶端加上病毒与药物的孵育混合物(100μl)。在4℃，25,000rpm离心3小时后，从顶端开始以1ml/组分的量取出溶液并标记好取出顺序，分别为组分1-9。每个组分都利用rtreagentkit试剂盒(takarabio,货号rr037b)根据制造商的使用说明逆转录成cdna。再利用mastercyclereprealplexpcrsystem(eppendorf)荧光定量pcr(本实施例所采用的q-pcr设置为：95℃10s，(95℃5s+60℃30s)*40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)来检测cdna的量，以此来定量每个组分所含病毒rna的数量(实验条件根据实验仪器所附带的指导手册制定)。利用westernblot检测每个组分所含的hiv衣壳蛋白p24。具体地，把每个组分样品(20μl)直接上样到10％sds-page胶加样孔内。浓缩胶采用80v电压，分离胶采用120v电压。将蛋白胶上条带转移到pvdf膜。使用bio-rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300-400ma，转膜时间为30分钟。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的pbs缓冲液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。加入5％脱脂牛奶溶液对膜进行封闭，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。采用实施例2中的183抗体，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。采用实施例2中的二抗，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。利用tanon4600全自动化学发光图像分析系统观察并记录条带结果。4.3实验结果及分析如图4a所示，与不用浓度的f9170多肽孵育后，样品中所剩的完整hiv病毒颗粒随多肽浓度的升高而递减。在f9170多肽浓度为5μm时，只有不到20％的病毒颗粒保持完整构型而使内部的rna基因组得以保存。如图4b和c所示，病毒颗粒与药物孵育后，dmso组rna集中在组分4-7，而其衣壳蛋白p24集中在组分4-6，较为统一，说明dmso组的病毒结构保持完整，衣壳蛋白和rna在一个组分之中。相比之下，tritonx-100组rna集中在组分7-9，而其衣壳蛋白p24集中在组分1-3。类似地，f9170组rna集中在组分6-8，而其衣壳蛋白p24集中在组分1-3，说明tritonx-100和f9170能造成hiv病毒颗粒的裂解，进而导致rna的释放。实施例5.f9170多肽特异性裂解hiv感染细胞以及激活的hiv潜伏细胞5.1实验材料与方法100μl不同浓度，即0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10μm的f9170多肽与100μl的h9/iiib或者h9细胞以及jurkathxbc2细胞或者jurkat713stop细胞(来自nihaidsreagentprogram，货号分别为87，400，3953，3956)在37℃下孵育。三天后加入cck8(sigma-aldrich，货号c2581)试剂，并继续孵育1-4个小时。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔的od450。以不与f9170孵育的同种细胞的od值作为100％活性。对于激活的潜伏细胞实验，100μl上述各种细胞先与50μlchidamide(1μm)(cayman，货号13686)在37℃孵育30分钟，然后再加入50μlf9170(5μm)(激活细胞实验组)，未与chidamide但与f9170孵育的细胞为未激活细胞实验组，依据以上步骤进行检验。类似地，用f9170乱序多肽替换f9170进行实验。以不与f9170孵育的同种细胞的od值作为0％毒性。5.2实验结果及分析cck8试剂能检测孔细胞的活性。图5a的实验结果显示f9170多肽能特异性影响被hiv-1iiib病毒感染的h9细胞的活性，且该作用呈浓度依赖的趋势。而对h9细胞本身却毫无影响。如图5b所示，f9170对包含hiv包膜蛋白全长的jurkathxbc2细胞有毒性，且呈浓度依赖趋势，但是对于表达胞外段的jurkat713stop细胞则在检测浓度内都没有毒性。说明f9170对hiv感染细胞的灭活作用依赖于其与hiv包膜蛋白胞内段的相互作用。如图6a所示，对于没有被激活的潜伏细胞，f9170多肽并不影响这些细胞的活性，但是对于重新被激活的细胞，f9170浓度越高，被激活的细胞的活性越差。如图6b所示，f9170乱序多肽，则无论对有没有被激活的潜伏细胞都没有抑制活性。说明f9170多肽能特异性裂解表达hiv包膜蛋白的细胞。实施例6.f9170突变多肽对hiv-1iiib毒株有抑制作用6.1实验材料与方法50μlhiv-1iiib病毒(最终浓度为100倍tcid50，用无血清1640培养基稀释)以及50μl按倍比稀释(2倍)的f9170多肽及其突变多肽1-15(序列分别为seqno:3-17)(均为synpeptideco.,ltd.合成，起始浓度为6μm，用无血清1640培养基稀释)在37℃孵育30分钟。加入100μlmt-2细胞(105个/ml，用加入10％血清的1640培养基稀释)。在37℃培养12-16个小时后，换成新鲜的加入10％血清的1640培养基。再培养72个小时之后，收取上清50μl，并在上清中加入50μl含5％triton的pbs，混合后4℃放置过夜。如上文实施例2所述，用elisa检测上清中p24的含量来定量hiv-1感染靶细胞的情况。具体地，检测p24需要在前一天晚上在半区96孔板(corning)加入碳酸盐缓冲液(0.05m碳酸钠，0.05m碳酸氢钠，ph9.6)稀释的hivigg(5μg/ml)(来自nihaidsreagentprogram)。4℃放置12个小时，用pbst溶液洗板后加入5％的pbs溶牛奶进行封闭，37℃放置2小时。用pbst溶液洗板后加入10μl收取的上清与加入了triton的pbs的混合物，再加入40μlpbs，37℃放置1小时。用pbst溶液洗板后加入一抗183抗体(1.5μg/ml，培养来自nihaidsreagentprogram的anti-hiv-1p24hybridoma杂交瘤细胞系，收取上清后利用proteina特异性纯化上清中的183抗体)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入二抗(稀释3000倍，dakodenmarkhrp修饰的兔抗鼠单抗，货号p0260)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入加入显色底物3,3,5,5-tmb(sigma-aldrich，货号860336)，待3-5分钟，加入10％硫酸终止反应。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔的od450，得出数据。计算每一浓度样品抑制率。计算方法同实施例2。6.2实验结果及分析单位点突变后的突变多肽1-15(序列分别为seqno:3-17)仍然有对hiv病毒的抑制活性，半数抑制浓度(ic50)在0.04-1.05μm之间(图7)。对f9170第2，3，4，5，7，8，9，10，11，12，13，14或15位的氨基酸突变后，对其抑制活性影响较大，说明这些均是f9170行使抑制活性的关键氨基酸突变，多肽1和6(序列分别为seqno:3和8)基本上保留f9170的抑制活性，表明第1和6位的氨基酸突变对原始多肽f9170的抑制活性影响较小，可以用其它氨基酸进行取代而基本上保留相同的活性。实施例7.f9170多肽在小鼠体内的分布7.1实验材料与方法小动物活体成像技术(参见j.cell.biochem.118:2571-2580,2017，通过引用并入本文)用于检测f9170多肽在小鼠体内分布情况的检测。6只icr雌鼠(购自vitalriverlaboratories)(6-8周龄)被随机分配成两组。一组腹腔注射100mg连有荧光标记物的f9170多肽(溶于pbs缓冲液，100μl)(f9170-cy5，synpeptideco.,ltd.合成，cy5连接于f9170多肽羧基端)，另一组腹腔注射100μl无毒的pbs缓冲液。ivisluminakseriesiii成像系统(perkinelmer)用于小鼠体内荧光的检测。为了检测小鼠器官中的f9170多肽的分布，以上操作后，使用戊巴比妥钠处死小鼠。解剖出的肝脏以及大脑用于荧光的检测。7.2实验结果及分析将f9170多肽注射进小鼠后，能在肝脏，膀胱和大脑中检测到荧光信号(图8a、b、c和d)。解剖后证实了f9170确实能进入小鼠脑部。而脑部一直是hiv的天然逃逸避难所，使得能进入脑部的f9170多肽在治疗hiv感染上，有很大的优势。实施例8.f9170对小鼠没有明显的毒性8.1实验材料与方法15只icr雌鼠(购自vitalriverlaboratories)(6-8周龄)随机分配成三组。实验组1腹腔注射20mg/ml的f9170多肽(溶于pbs缓冲液，100μl)，实验组2腹腔注射100mg/ml的f9170多肽(溶于pbs缓冲液，100μl)，对照组只腹腔注射100μl无毒的pbs缓冲液。连续注射三天，小鼠的体重变化在注射后不同时间点(4天，6天，8天，10天，12天，14天，16天)被检测。8.2实验结果及分析根据图9所示，连续三天的注射f9170多肽对小鼠的体重并没有造成任何影响。小鼠体重的变化与阴性对照(pbs)组一致，说明在检测浓度内f9170多肽对小鼠没有毒性。实施例9.f9170具有广谱抗hiv作用由于hiv这类的逆转录病毒十分容易发生基因组突变，发明人又检测了f9170多肽对表2中所示的一系列临床株(来自nihaidsreagentprogram，货号以括号方式标注于表格中)的抗病毒活性。临床株可分为多种亚型。该实验以f9170乱序多肽以及t20为对照。同时，我们还检测了f9170对t20抗性株的抑制效果。t20是目前唯一批准用于临床的融合抑制剂，但其很容易诱导耐药突变，导致疗效的降低。所以开发出能抑制t-20抗性株的新型融合抑制剂将是临床上迫切需要解决的问题。方法如下：96孔板中每孔加入50μl每种hiv病毒株(用无血清1640稀释，最终浓度为100倍tcid50)以及50μl按倍比稀释(2倍)的f9170多肽(用无血清1640稀释，起始浓度为6μm)，37℃孵育30分钟，再加入100μlmt-2或者m7细胞(同实施例2)(105个/ml，用加入10％血清的1640培养液稀释)，以只加了同等终浓度的靶细胞的孔作为阴性对照，以加入了同等终浓度的hiv病毒和靶细胞但未加入药物的孔为阳性对照。第二天早上每孔吸走上清150μl，加入150μl新鲜的含10％血清的1640培养液。第五天早上收取上清50μl，并在上清中加入50μl含5％triton的pbs，混合后4℃放置过夜。如实施例2所述用elisa检测上清中p24的含量来定量hiv-1感染靶细胞的情况。具体地，检测p24需要在前一天晚上在半区96孔板(corning)加入碳酸盐缓冲液(0.05m碳酸钠，0.05m碳酸氢钠，ph9.6)稀释的hivigg(5μg/ml)(来自nihaidsreagentprogram，货号3957)。4℃放置12个小时，用pbst溶液洗板后加入5％的pbs溶牛奶进行封闭，37℃放置2小时。用pbst溶液洗板后加入收取的上清与加入了5％triton的pbs的混合物10μl，再加入40μlpbs，37℃放置1小时。用pbst溶液洗板后加入50μlpbs稀释的一抗183抗体(1.5μg/ml，培养来自nihaidsreagentprogram的anti-hiv-1p24hybridoma杂交瘤细胞系，货号：1513；收取上清后利用proteingmagneticbeads(newenglandbiolabs，货号：s1430s，参考文献：sisson,t.h.andcastor,c.w.(1990).j.immunol.methods.127,215.)特异性纯化上清中的183抗体)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入pbs稀释的二抗(稀释3000倍，dakodenmarkhrp修饰的兔抗鼠单抗，货号p0260)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入50μl显色底物3,3,5,5-tmb溶液(sigma-aldrich，货号860336)，待3-5分钟，加入10％硫酸终止反应。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔的od450，得出数据。抑制率依据实施例2所列公式计算得出。依据每个浓度的抑制率利用calcusynsoftware(biosoft,ferguson,mo)计算出每个样品的ic50值。实验结果如表3，对于a、b、c、d、o等各种亚型的临床株和在中国流行占主导地位的重组a/e病毒株，f9170均具有较好的抑制活性。对于t20抗性株，t20多肽不能再抑制这些毒株的感染，但f9170仍然能抑制，显示出了作为hiv药物的优势。验证了f9170对hiv病毒具有广谱的抑制效果，说明了其有希望被开发成为新一代的hiv药物。表3.f9170对不同临床株的抑制活性实施例10：多肽广谱性灭活hiv病毒检测f9170多肽灭活如表3中所示的各型hiv-1病毒(来自nihaidsreagentprogram，货号以括号方式标注于表格中)能力的方法如下：将各50μl上述每种hiv病毒(用无血清1640培养基(meilunbio，货号ma0215，所有实施例所用1640培养基均为该产品)稀释，最终浓度为200倍tcid50)以及50μl按倍比稀释(2倍)的f9170多肽、f9170乱序多肽和t20(用无血清1640培养基稀释，起始浓度为6μm)在4℃孵育1小时。加入peg6000(sigma-aldrich，货号1546580)，使其终浓度为3％，4℃再孵育1小时。13,000rpm离心30分钟后，加入含有10mg/mlbsa的3％peg6000进行清洗，再次13,000rpm离心30分钟。用100μl的无血清1640培养基重悬最后的沉淀，加入96孔板中。再加入100μlmt-2(x4)或者m7(r5)细胞(来自nihaidsreagentprogram)(105个/ml，用加入10％血清的1640培养液稀释)，以只加了同等终浓度的mt-2或者m7细胞的孔作为阴性对照，以加入了同等终浓度的hiv病毒和细胞但未加入药物的孔为阳性对照。第五天早上收取上清50μl，并在上清中加入50μl含5％triton的pbs缓冲液，混合后4℃放置过夜。如实施例2所述用elisa检测上清中p24的含量来定量hiv-1感染靶细胞的情况。具体地，检测p24需要在前一天晚上在半区96孔板(corning)加入碳酸盐缓冲液(0.05m碳酸钠，0.05m碳酸氢钠，ph9.6)稀释的hivigg(5μg/ml)(来自nihaidsreagentprogram，货号3957)。4℃放置12个小时，用pbst溶液洗板后加入5％的pbs溶牛奶进行封闭，37℃放置2小时。用pbst溶液洗板后加入收取的上清与加入了5％triton的pbs的混合物10μl，再加入40μlpbs，37℃放置1小时。用pbst溶液洗板后加入50μlpbs稀释的一抗183抗体(1.5μg/ml，培养来自nihaidsreagentprogram的anti-hiv-1p24hybridoma杂交瘤细胞系，货号：1513；收取上清后利用proteingmagneticbeads(newenglandbiolabs，货号：s1430s，参考文献：sisson,t.h.andcastor,c.w.(1990).j.immunol.methods.127,215.)特异性纯化上清中的183抗体)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入pbs稀释的二抗(稀释3000倍，dakodenmarkhrp修饰的兔抗鼠单抗，货号p0260)50μl，37℃放置一小时。用pbst溶液洗板后加入50μl显色底物3,3,5,5-tmb溶液(sigma-aldrich，货号860336)，待3-5分钟，加入10％硫酸终止反应。用酶标仪(tecaninfinitem200pro)检测每孔的od450，得出数据。抑制率依据实施例2所列公式计算得出。依据每个浓度的抑制率利用calcusynsoftware(biosoft,ferguson,mo)计算出每个样品的ic50值。实验结果如表4，对于a、b、d、f、o等各种亚型的临床株和在中国流行占主导地位的重组a/e病毒株，f9170均具有较好的灭活活性。同时，对于t20抗性株，f9170也能灭活这些病毒，使其不能再感染宿主细胞。本实施例确定f9170对于病毒的抑制效果来源于其对病毒的灭活作用。表4：f9170对不同hiv-1临床株的灭活活性(ec50)以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>山西锦波生物医药股份有限公司复旦大学<120>多肽、其制备方法及抑制艾滋病病毒的用途<130>1<160>30<170>patentinversion3.3<210>1<211>15<212>prt<213>人免疫缺陷病毒<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<220><221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>1xaatrpglualaleuxaatyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>2<211>15<212>prt<213>人免疫缺陷病毒<400>2glytrpglualaleulystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>3<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>3alatrpglualaleulystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>4<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>4glyalaglualaleulystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>5<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>5glytrpalaalaleulystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>6<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>6glytrpglugluleulystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>7<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>7glytrpglualaalalystyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>8<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>8glytrpglualaleualatyrleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>9<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>9glytrpglualaleulysalaleutrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>10<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>10glytrpglualaleulystyralatrpasnleuleuglntyrtrp151015<210>11<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>11glytrpglualaleulystyrleualaasnleuleuglntyrtrp151015<210>12<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>12glytrpglualaleulystyrleutrpalaleuleuglntyrtrp151015<210>13<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>13glytrpglualaleulystyrleutrpasnalaleuglntyrtrp151015<210>14<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>14glytrpglualaleulystyrleutrpasnleualaglntyrtrp151015<210>15<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>15glytrpglualaleulystyrleutrpasnleuleualatyrtrp151015<210>16<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>16glytrpglualaleulystyrleutrpasnleuleuglnalatrp151015<210>17<211>15<212>prt<213>人工<220><223>f9170突变体<400>17glytrpglualaleulystyrleutrpasnleuleuglntyrala151015<210>18<211>36<212>prt<213>人免疫缺陷病毒<400>18tyrthrserleuilehisserleuileglugluserglnasnglngln151015glulysasngluglngluleuleugluleuasplystrpalaserleu202530trpasntrpphe35<210>19<211>480<212>prt<213>人免疫缺陷病毒<400>19gluglulysleutrpvalthrvaltyrtyrglyvalprovaltrplys151015glualathrthrthrleuphecysalaserasparglysalatyrasp202530thrgluvalhisasnvaltrpalathrhisalacysvalprothrasp354045proasnproglngluvalgluleulysasnvalthrgluasnpheasn505560mettrplysasnasnmetvalgluglnmethisgluaspileileser65707580leutrpaspglnserleulysprocysvallysleuthrproleucys859095valthrleuasncysthraspleuargasnalathrasnglyasnasp100105110thrasnthrthrserserserargglymetvalglyglyglyglumet115120125lysasncysserpheasnilethrthrasnileargglylysvalgln130135140lysglutyralaleuphetyrlysleuaspilealaproileaspasn145150155160asnserasnasnargtyrargleuilesercysasnthrservalile165170175thrglnalacysprolysvalserphegluproileproilehistyr180185190cysalaproalaglyphealaileleulyscyslysasplyslysphe195200205asnglylysglyprocysthrasnvalserthrvalglncysthrhis210215220glyileargprovalvalserthrglnleuleuleuasnglyserleu225230235240alagluglugluvalvalileargseralaasnphealaaspasnala245250255lysvalileilevalglnleuasngluservalgluileasncysthr260265270argproasnasnasnthrarglysserilehisileglyproglyarg275280285alaphetyrthrthrglygluileileglyaspileargglnalahis290295300cysasnleuserargalalystrpasnaspthrleuasnlysileval305310315320ilelysleuarggluglnpheglyasnlysthrilevalphelyshis325330335serserglyglyaspprogluilevalthrhisserpheasncysgly340345350glygluphephetyrcysasnserthrglnleupheasnserthrtrp355360365asnvalthrglugluserasnasnthrvalgluasnasnthrilethr370375380leuprocysargilelysglnileileasnmettrpglngluvalgly385390395400argalamettyralaproproileargglyglnileargcysserser405410415asnilethrglyleuleuleuthrargaspglyglyprogluaspasn420425430lysthrgluvalpheargproglyglyglyaspmetargaspasntrp435440445argsergluleutyrlystyrlysvalvallysilegluproleugly450455460valalaprothrlysalalysargargvalvalglnargglulysarg465470475480<210>20<211>636<212>prt<213>人免疫缺陷病毒<400>20asnleutrpvalthrvaltyrtyrglyvalprovaltrplysgluala151015lysthrthrleuphecysalaseraspalalysalatyraspalaglu202530valhisasnvaltrpalathrhisalacysvalprothraspproasn354045proglnglumetvalleugluasnvalthrgluasnpheasnmettrp505560gluasnaspmetvalgluglnmethisglnaspileileserleutrp65707580aspglnserleulysprocysvallysleuthrproleucysvalthr859095leuhiscysserasnargthrileasptyrasnasnargthraspasn100105110metglyglygluilelysasncysserpheasnmetthrthrgluval115120125argasplysargglulysvalhisalaleuphetyrargleuaspile130135140valproleulysasngluserserasnthrserglyasptyrargleu145150155160ileasncysasnthrseralailethrglnalacysprolysvalser165170175pheaspproileproilehistyrcysalaproalaglytyralaile180185190leulyscysasnasnlysthrpheasnglythrglyprocysasnasn195200205valserthrileglncysthrhisglythrlysprovalvalserthr210215220glnleuleuleuasnglyserleualagluglugluileileilearg225230235240serlysasnleuthraspasnvallysthrileilevalhisleuasn245250255gluservalgluileasncysthrargproasnasnasnthrarglys260265270serileargileglyproglyglnalaphetyralathrglygluile275280285ileglyaspileargglnalahiscysasnil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