一种基于VEGFR-2抑制剂B14的光亲合探针分子及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于vegfr-2抑制剂b14的光亲合探针分子及其制备方法。

背景技术：

光亲和标记技术(pal)是结合现代分子生物学、细胞生物学、药物化学、分析化学等多学科的优势，运用合成的光亲和探针分子，在特定波长光的照射下产生高活性的中间体，其可以直接与药物分子特异性结合的蛋白质进行不可逆共价交联从而实现对药物靶标蛋白分子的捕获。它是分子水平上研究配体与受体相互作用的核心工具之一，对阐明配体与受体相互作用机理以及药物新靶点的发现都有着巨大的推动作用。

近些年来这项技术主要应用于药物分子靶标蛋白的确证，其主要基于光交联技术、生物正交技术以及相关的生物分析技术等，实现药物分子靶标的捕获及其确证。其中光亲和探针分子的设计合成是在不影响靶头药物活性的基础上直接进行结构修饰，分别引入光反应活性基团以及生物正交手柄设计合成光亲和探针分子，其在特定波长光的照射下特异性不可逆的共价捕获靶头化合物的靶标蛋白。再接下来通过生物正交反应来实现所捕获的靶标蛋白的识别确证。

血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor)是由vegf基因表达的膜蛋白，属于酪氨酸家族蛋白，是与恶性肿瘤密切相关的大分子蛋白。血管内皮生长因子及其受体在一系列肿瘤细胞中都有过表达，该受体家族包括三个亚型：vegfr-1、vegfr-2、vegfr-3。其中vegfr-2主要参与血管内皮细胞的增殖，在癌细胞中分布也最广泛。一系列的研究证实它可以作为有效的药物靶标。

近五年以来，文献中所报道的光活性基团有芳基叠氮、二苯甲酮、含取代基的双吖丙啶、双吖丙啶这四大类。其中，光交联活性较好的是双吖丙啶。因此有必要选择双吖丙啶作为光活性基团设计合成光亲和探针分子。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于vegfr-2抑制剂b14的光亲合探针分子及其制备方法，b14光亲和探针分子用于确证b14的靶标蛋白以及其与靶标蛋白的作用模式，并且可以用于验证光亲和标记技术在靶标蛋白确证方面的可行性。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子，其结构式如下：

其中x为o或nh。

一种基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)4-溴吡啶-2-羧酸与1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲进行suzuki偶联反应，得到带有单羧酸的中间产物；

2)含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体与带有单羧酸的中间产物在edc·hcl的缩合作用下，得到基于vegfr-2抑制剂b14的光亲和探针分子，结构式如下：

其中x＝o或nh。

本发明进一步的改进在于，所述步骤1)的具体过程为：将4-溴吡啶-2-羧酸、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲、碳酸铯和四(三苯基膦)钯溶于乙腈与水的混合溶液中，n2保护，100℃反应16h后进行处理，得到带有单羧酸的中间产物。

本发明进一步的改进在于，将4-溴吡啶-2-羧酸4.95mmol、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲5.94mmol、碳酸铯9.90mmol和四(三苯基膦)钯0.25mmol溶于乙腈与水的混合溶液50ml中，n2保护，100℃反应16h后进行处理，得到带有单羧酸的中间产物。

本发明进一步的改进在于，乙腈与水的混合溶液中乙腈与水的体积比为4:1。

本发明进一步的改进在于，所述步骤2)的具体过程为：将步骤1)得到的带有单羧酸的中间产物溶于无水四氢呋喃溶液中，加入edc·hcl、hobt，然后逐滴加入dipea，在0℃搅拌1h后加入含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体，室温下搅拌24h后，进行处理，得到基于vegfr-2抑制剂b14的光亲和探针分子。

本发明进一步的改进在于，将带有单羧酸的中间产物0.145mmol溶于3ml无水四氢呋喃溶液中，加edc·hcl0.218mmol、hobt0.174mmol0℃下搅拌均匀，然后逐滴加入dipea0.725mmol，搅拌1h，加入含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体0.145mmol，室温搅拌24h，得到基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子。

一种基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子在光亲和标记技术方面的应用。

本发明进一步的改进在于，基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子在确证蛋白靶标方面的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过使用同时含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体，将其与vegfr-2蛋白抑制剂b14连接，获得b14光亲和探针分子。该光亲和探针分子能够特异性的不可逆共价结合b14的靶标蛋白分子，接下来探针分子中的生物正交手柄与含有荧光素或者生物素的另一生物正交手柄进行点击反应以确证靶标蛋白。本发明的b14光亲和探针分子制备方法简单，易于实现，并且收率较高。

本发明中的b14光亲和探针分子可以对vegfr-2蛋白进行特异性共价结合，进而通过点击反应以实现对捕获的靶标蛋白接下来的确证分析。利用光亲和标记技术实现对药物作用靶标蛋白的确证并且可以改善原有确证靶标技术的一些不足。原有的靶标确证技术中探针分子不能稳定的结合药物靶标分子，容易造成假阳性结果。而且原有的技术通常需要在药物分子上连接较大体积的荧光基团来进行分析，这会导致探针分子活性降低、溶解度差、细胞渗透性差等缺点。而光亲和标记技术是通过合成小分子光亲和探针结合生物正交技术来进行靶标确证，弥补了原有技术的不足。本发明的b14小分子光亲和探针能够用于确证b14的作用靶标以及验证光亲和标记技术在确证小分子靶标方面的可行性。

附图说明

图1为本发明提供的基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子的合成路线图；

其中，化合物1为1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲，化合物2为4-溴吡啶-2-羧酸，化合物3为4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)吡啶甲酸(b14)，化合物4为含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体，化合物(x)为b14光亲和探针分子。

图中标注的具体为：

a.csco3,pd[p(c6h5)3]4,acetonitrile,n2,80℃；b.edc·hcl,hobt,dipea,thf,rt。

具体实施方式

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明通过使用含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体将vegfr-2蛋白抑制剂连接获得光亲和探针分子。本发明涉及的光亲和探针分子能够用于确证b14的靶标蛋白。

本发明中含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体的结构式为：其中，x为o或nh。

本发明提供的具有确证药物分子靶标的光亲和探针分子的化学结构式具体如下：

其中，x为o或nh。

本发明所述的具有靶标确证作用的光亲和探针分子，包括：

2-(3-(丁-3-炔-1-基)-3h-双吖丙啶-3-基)乙基4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)吡啶甲酸。

n-(2-(3-(丁-3-炔-1-基)-3h-双吖丙啶-3-基)乙基)-4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)吡啶酰胺。

下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的具有靶标确证作用的光亲和探针分子的制备和活性筛选方法。

参见图1，一种基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子的制备方法，包括以下步骤：

1)4-溴吡啶-2-羧酸与1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲进行suzuki偶联反应，得到带有单羧酸的中间产物；

所述步骤1)的具体操作为：将4-溴吡啶-2-羧酸、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲、碳酸铯和四(三苯基膦)钯溶于乙腈与水的混合溶液(乙腈与水的体积比为4:1)中，n2保护，100℃反应16h。反应结束后，抽滤，旋除滤液，加入适量乙酸乙酯和水萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，经柱色谱分离后得到带有单羧酸的中间产物。

2)将带有单羧酸的中间产物与含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体在edc·hcl为缩合剂的缩合作用下，得到通式(x)表示的化合物；

所述步骤2)的具体操作为：将步骤1)得到的带有单羧酸的中间产物，edc·hcl，hobt溶于无水thf中，冰浴下逐滴加入dipea，搅拌1h，加入含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体，室温下搅拌24h，反应结束后，减压旋除溶剂，加入适量乙酸乙酯后分别进行水洗涤、饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱色谱分离，得到基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针通式(x)表示的化合物。

上述基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针分子在制备以vegfr-2激酶为靶点的抗肿瘤药物中的应用。

实施例1

该具有靶标确证作用的b14光亲和探针分子的结构式中，x为o或nh，通过以下步骤制备(参见图1)：

4-溴吡啶-2-羧酸与1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲进行suzuki偶联反应，得到带有单羧酸的中间产物；具体过程如下：

将4-溴吡啶-2-羧酸、1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯基)脲、碳酸铯和四(三苯基膦)钯溶于乙腈与水的混合溶液(乙腈与水的体积比为4:1)中，n2保护，100℃反应16h。反应结束后，抽滤，旋除滤液，加入适量乙酸乙酯和水萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱色谱分离，使用二氯甲烷/甲醇(v/v＝10/1)洗脱得到目标化合物，重0.36g，收率17％得到带有单羧酸的中间产物。

lc-ms(esi,m/z):436.79[m+h]⁺，434.79[m-h]^-

(探针分子i,x＝o)；具体过程如下：

将带有单羧酸的中间产物4-(4-(3-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)吡啶甲酸(0.063g,0.145mmol)溶于3ml无水四氢呋喃溶液中，加edc·hcl(0.04g,0.218mmol)、hobt(0.024g,0.174mmol)在0℃下搅拌均匀，然后逐滴加入dipea(0.094g,.725mmol)，搅拌1h，加入含有光亲和基团双吖丙啶与炔基的链接体(0.02g,0.145mmol)，室温搅拌24h，反应结束后，减压旋除溶剂，加入适量乙酸乙酯后分别进行水洗涤、饱和碳酸氢钠洗涤，饱和食盐水洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱色谱分离，使用石油醚/乙酸乙酯(v/v＝1/1)洗脱得到目标化合物，重0.03g，收率41.66％。得到基于vegfr-2抑制剂b14光亲和探针通式(x)表示的化合物。

所得目标化合物的结构如下：

氢谱核磁共振数据为：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.28(s,1h),δ9.17(s,1h),δ8.75-8.76(d,1h),δ8.34-8.35(d,1h),δ8.14(d,1h),δ7.97-7,99(d,1h),δ7.85-7.87(d,2h),δ7.65-7.68(m,4h),δ4.23-4.27(t,2h),δ2.83-2.84(t,1h),δ2.05-2.09(m,2h),δ1.91-1.94(t,2h),δ1.69-1.73(t,2h).

lc-ms(esi,m/z):556.94[m+h]⁺。

实施例2

该光亲和探针分子ii的结构式中，x为nh。

合成步骤同实施例1

所得目标探针分子ii的结构如下：

氢谱核磁共振数据为：¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.28(s,1h),δ9.17(s,1h),δ8.88-8.91(t,1h),δ8.66-8.68(d,1h),δ8.27-8.28(d,1h),δ8.14(d,1h),δ7.91-7,92(q,1h),δ7.86-7.84(d,2h),δ7.65-7.67(m,4h),δ3.22-3.27(q,2h),δ2.85-2.86(t,1h),δ2.01-2.06(m,2h),δ1.68-1.71(t,2h),δ1.62-1.66(t,2h).

lc-ms(esi,m/z):555.96[m+h]⁺。

实施例3

b14光亲和探针分子对vegfr-2激酶的抑制活性筛选。

采用的是adp-glo发光方法测定b14光亲和探针分子对vegfr-2激酶的抑制活性。

用buffer(tris80mm,mgcl220mm,bsa0.2mg/ml,dtt2mm)稀释atp(10mm)为250μm；将atp和底物poly(4:1glu,tyr)peptide按体积1:1配成atp(125μm)-poly(4:1glu,tyr)peptide(0.5μg/μl)混合溶液；用buffer稀释激酶为1.5ng/μl。将待测化合物配成6个浓度梯度的溶液，于384孔板上依次加入2μlatp-poly(4:1glu,tyr)peptide溶液、1μl样品溶液、2μl酶溶液启动反应。30℃孵育60min后，加入adp-glo试剂5μl终止反应。再加入kinasedetection试剂10μl将adp转化为atp，在25℃孵育30min，使用perkinelmer多功能酶标仪的化学发光模块测定发光值，计算抑制率。

数值处理：抑制率＝(阳性值-给药组值)/(阳性值-阴性值)×100％；

化合物的实验结果见表1：

表1b14光亲和探针分子对vegfr-2激酶的抑制活性结果

从表1可以看出，本发明制备的b14光亲和探针分子对vegfr-2激酶具有较好的抑制活性。