本发明属于菌种培养技术领域，尤其是一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法。
背景技术：
灰黄霉素(griseofulvin)属芳香族衍生物类抗生素，它是一种抗真菌抗生素，在临床上被用于治疗皮肤癣菌属引起的感染，在农业上被用于抗植物真菌病。灰黄霉素产品的市场前景广阔。
灰黄霉素菌种是由野生型penicilliumpatulum4541菌株经人工诱变而来的d-756菌种的后代，该菌种主要是以野生型菌种为出发菌，采用紫外照射和licl为诱变剂而选育出来的高产菌种。菌种在长时间的保存和传代过程中，极易发生菌种退化，尤其是诱变菌种。因此，要使菌种保持其优良性状，菌种的分离和制备方法尤为重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，该方法优化了菌种选育过程，减少菌种传代次数，防止菌种退化，保持菌种优良性状；减少菌种在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证菌种发酵效价的稳定性。
本发明的技术方案是这样实现的：一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
s1，分离单菌落：
取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-5、10-6、10-7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；
s2，制备单菌落甘油管：
取步骤s1培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的试管中，振荡打下孢子，再加1.5～2.5ml的8～12％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱保藏；
s3，筛选单菌落菌种：
取步骤s2制备的相同单菌落编号的两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；
s4，制备单菌落冷冻菌：
将步骤s3筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养6～7天成熟后，加入适量灭菌的8～12％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸10～20ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。
优选的，步骤s1所述的平板培养基按如下重量百分比配制：籼米粉2～4％、蔗糖2～4％、磷酸二氢钾0.4～0.6％、氯化钾0.3～0.5％、氯化钠0.1～0.3％、硫酸镁0.04～0.06％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2～3％和余量水。
优选的，步骤s1所述的平板培养基按如下重量百分比配制：籼米粉3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钾0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2.5％和余量水。
优选的，本发明的方法还包括杂菌检验步骤，抽取s4步骤制备的灰黄霉素单菌落冷冻菌做无菌检查，抽取方法：小于10支，随机抽取1支冷冻菌；10～20支，随机抽取2支；20～30支，随机抽取3支；30支以上的按10％进行随机抽取，肉汤培养检验无杂菌后，方可使用。
本发明和现有技术相比的优点为：
本发明分离纯化过程中的单菌落甘油孢子悬液分装于3支甘油管，其中2支单菌落甘油管分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，另外1支单菌落甘油管直接用于单菌落冷冻菌的制备。此过程减少了菌种在复壮选育过程中和制备过程中的传代次数，提高了灰黄霉素的发酵效价；减少和减慢了菌种分生孢子在保藏过程中的死亡率和死亡速度，保证了菌种生长繁殖和发酵效价的稳定，简化了菌种制备过程中的许多无菌操作环节，从而大大降低了菌种的染菌率。
本发明的方法优化了菌种选育过程，减少菌种传代次数，防止菌种退化，保持菌种优良性状，保证菌种发酵效价稳定性。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清楚，下面通过具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1：一种灰黄霉素单菌落冷冻菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
s1，配制平板培养基：
按重量百分比计，由籼米粉3％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.5％、氯化钾0.4％、氯化钠0.2％、硫酸镁0.05％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2.5％和余量水配制平板培养基；
s2，分离单菌落：
取预先选定的灰黄霉素出发菌种，接种茄瓶斜面，斜面孢子培养成熟后，选取外观质量合格的斜面孢子，用无菌水制成单孢子悬液，然后将悬液按10倍的浓度梯度稀释至10-5、10-6、10-7，再分别将三个浓度的单孢子悬液涂布到步骤s1配制的平板培养基上，在28～30℃条件下培养6～7天；
s3，制备单菌落甘油管：
取步骤s2培养好的平板，选择菌型较大、孢子丰满、边缘整齐的主型菌落，用接种环挑下，放入预先加有玻璃珠的18×180mm试管中，振荡打下孢子，再加2ml的10％甘油保护剂，摇动制成孢子悬液；用无菌吸管将孢子悬液分别吸入3支甘油管中，贴好标签，写好编号和日期，3支甘油管编写相同的单菌落编号，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱保藏；
s4，筛选单菌落菌种：
取步骤s3制备的相同单菌落编号两只单菌落甘油管，分别用于摇瓶初筛和摇瓶复筛，根据摇瓶初筛和摇瓶复筛的筛选结果，选择与发酵效价高的单菌落甘油管编号对应的另外1支单菌落甘油管作为入选的单菌落冷冻菌的菌种；
s5，制备单菌落冷冻菌：
将步骤s4筛选出的单菌落冷冻菌的菌种接种茄瓶斜面，斜面孢子培养7天成熟后，加入适量灭菌的10％甘油制成菌悬液，然后再用吸管吸15ml菌悬液于冷冻瓶中，塞好塞子，并用封口膜包好，贴好标签，写好编号和日期，使用-70℃丙酮预冻后放入-70℃的超低温冰箱，制得灰黄霉素单菌落冷冻菌。
s6，杂菌检验：
抽取灰黄霉素单菌落冷冻菌做无菌检查，抽取方法：小于10支，随机抽取1支冷冻菌；10～20支，随机抽取2支；20～30支，随机抽取3支；30支以上的按10％进行随机抽取，肉汤培养检验无杂菌后，方可使用。
实施例2：
其它步骤与实施例1相同，不同之处在于配制平板培养基，本实施例平板培养基，按重量百分比计，由籼米粉2％、蔗糖4％、磷酸二氢钾0.6％、氯化钾0.3％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.04％、硫酸亚铁0.001％、琼脂3％和余量水配制。
实施例3：
其它步骤与实施例1相同，不同之处在于配制平板培养基，本实施例平板培养基，按重量百分比计，由籼米粉4％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.4％、氯化钾0.5％、氯化钠0.3％、硫酸镁0.06％、硫酸亚铁0.001％、琼脂2％和余量水配制。