一株生产青霉酸的菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物的开发利用领域，具体涉及一株生产青霉酸的菌株及其应用。

背景技术：

青霉酸是一种无色针状结晶化合物，熔点83℃，分子式为c8h10o4，相对分子量为170.16，极易溶于热水、乙醇、乙醚和氯仿，但不溶于戊烷、己烷(汪昭贤，2005)。青霉酸主要是由圆弧青霉菌产生的多聚乙酰类霉菌毒素，由alsberg等于1913年首次分离。青霉酸能对动物器官引起毒性反应，例如青霉酸能抑制na⁺、k⁺、ca²⁺进入青蛙的离体心肌，引起心脏骤停。在小鼠皮下注射青霉素，在注射区局部发生纤维瘤，同时青霉酸对尼西鸡的毒性表现在肝细胞脂肪变性、肾小管商品细胞浊肿、心肌细胞颗粒变性。家兔青霉素急性中毒时，表现为体温降低，心率先快后满，呼吸加快，肠胃蠕动加强，脱毛，蛋白尿和引起孕兔流产等。此外，青霉酸还能引起细胞毒性，例如对体外培养的小鼠成纤维细胞，浓度大于5mg/ml时，可以抑制dna合成，而对体外培养的仓鼠卵巢细胞，浓度大于0.5mg/ml时，引起dna单链的断裂。

青霉酸是自然界已知的具有潜在致癌性的物质，对人们生产生活有巨大影响，目前，青霉酸的毒理学研究是寻找治疗动物青霉素中毒的有效方法。同时青霉酸的毒理学研究必须要求浓度纯度高的化合物作为标准品，然而目前生产青霉酸的方法常常采用生物方法生产，但是由于目前生物方法生产的青霉素存在产量和纯度偏低的问题，往往依赖于后续纯化工艺，给生产青霉酸造成供应不足，同时还大大提高生产成本。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生产青霉酸的菌株及其应用，利用该菌株进行青霉酸发酵生产，具有产量高、纯度高的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株生产青霉酸的菌株，penicilliumsp.，所述菌株的保藏编号为cgmccno.16496。

本发明提供了上述菌株在生产青霉酸中的应用。

优选的，所述生产青霉酸的方法，包括以下步骤：

(1)将所述菌株接种至发酵培养基中，在25～30℃条件下发酵培养40～50d后，得到发酵物；

(2)用乙酸乙酯浸泡所述发酵物，超声提取青霉酸，分离得到的乙酸乙酯浸提液经减压蒸馏回收溶剂，得到青霉酸。

优选的，所述步骤(1)中发酵培养基为每120ml海水中包含以下重量的组分：80g大米和0.24g蛋白胨。

优选的，所述步骤(1)中发酵培养的温度为28℃，所述发酵培养的时间为42～45d。

优选的，所述步骤(2)中超声的频率为50～65khz，超声的温度为20～25℃，超声的功率为135w，超声的时间为10min。

优选的，所述步骤(2)中减压蒸馏的压力为-0.1～0mpa相对压力；减压蒸馏的水浴温度为30～35℃。

优选的，所述步骤(2)中回收溶剂后还包括对回收的粗提液进行提纯；所述提纯的方法包括以下步骤：

a.将所述粗提液经减压硅胶正相柱分离，收集液相；

b.将所述液相经高压液相分离，得到青霉酸纯品。

优选的，所述步骤a中减压硅胶正相柱的固定相为200～300目硅胶，减压硅胶正相柱的流动相为二氯甲烷或甲醇-二氯甲烷混合溶剂；所述甲醇-二氯甲烷混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1～50:50～99。

优选的，所述步骤b中高压液相分离用流动相为体积浓度40％甲醇水溶液。

本发明提供了一株生产青霉酸的菌株penicilliumsp.及其在生产青霉酸中应用，所述菌株的保藏编号为cgmccno.16496。所述菌株具有优异的生产青霉酸的特性。将利用所述菌株发酵得到的发酵粗提物进行指纹谱图分析发现，13.3min时出峰化合物为青霉酸，且产青霉酸量大，同时青霉酸峰周围无明显杂峰，这表明本发明提供的菌株与以往产青霉酸的微生物菌株相比，更易得到纯度大且产量高的青霉酸。

进一步的，本发明提供的应用，进一步限定了提纯步骤，结果发现本发明提供的菌株产青霉酸的产量为每200g大米发酵生产得到1g青霉酸，并且青霉酸的纯度在99.5％以上，较常规产青霉酸的微生物菌株相比，本发明生产青霉酸的产量提高了100～200％。

菌种保藏信息

生产青霉酸的菌株(penicilliumsp.)，本发明所述的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年11月6日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为cgmccno.16496。

附图说明

图1为菌株penicilliumsp.发酵粗提物指纹谱图；

图2为青霉酸高效液相制备谱图；

图3为青霉酸氢谱谱图；

图4为青霉酸碳谱谱图。

具体实施方式

本发明提供了一株生产青霉酸的菌株，penicilliumsp.，所述菌株的保藏编号为cgmccno.16496。

鉴于上述菌株具有生产青霉酸产量高，纯度高的特点，本发明提供了上述菌株在生产青霉酸中的应用。

在本发明中，所述生产青霉酸的方法，优选包括以下步骤：

(1)将所述菌株接种至发酵培养基中，在25～30℃条件下发酵培养40～50d后，得到发酵物；

(2)用乙酸乙酯浸泡所述发酵物，超声提取青霉酸，分离得到的乙酸乙酯浸提液经减压蒸馏回收溶剂，得到青霉酸。

本发明将所述菌株接种至发酵培养基中，在25～30℃条件下发酵培养40～50d后，得到发酵物。

在本发明中，将所述菌株接种至发酵培养基前，优选包括将所述菌株进行扩大培养。所述扩大培养用培养基优选为以海水为溶剂的pda培养基。所述扩大培养的温度优选为28℃。所述扩大培养的环境优选为生化培养箱。所述扩大培养的时间为3d。

在本发明中，所述发酵培养基优选盛装在500ml的锥形瓶中。所述发酵培养基为每120ml海水中包含以下重量的组分：80g大米和0.24g蛋白胨。接种至发酵培养基的接种量为三个琼脂块/瓶；所述琼脂块的规格为0.5cm×0.5cm×0.5cm。

在本发明中，所述发酵培养的温度优选为28℃，所述发酵培养的时间优选为42～45d。所述发酵培养期间优选静置培养。所述发酵培养的环境优选为生化培养箱，有利于维持恒定的温度。

得到发酵物后，本发明用乙酸乙酯浸泡所述发酵物，超声提取青霉酸，分离得到的乙酸乙酯浸提液经减压蒸馏回收溶剂，得到青霉酸。

在本发明中，所述浸泡的时间优选为10～14h，更优选为12h。所述浸泡有利于将发酵物中的青霉酸溶解于乙酸乙酯中。所述浸泡的温度优选为20～27℃，更优选为22～25℃。

在本发明中，所述超声的频率优选为59khz；超声的温度优选为20～25℃，更优选为23℃；超声的功率优选为135w，超声的时间优选为10min。本发明对所述超声用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的超声仪即可。所述超声提取有利于加强青霉酸充分溶解于乙酸乙酯中。

在本发明中，所述减压蒸馏的压力优选为-0.1～0mpa相对压力；减压蒸馏的水浴温度优选为30～35℃。本发明对所述减压蒸馏的方法没有特殊限制，采用本领域技术所熟知的减压蒸馏的方法即可。

在本发明中，回收溶剂得到的是青霉酸粗提液，将所述青霉酸粗提液进行指纹谱图分析。具体分析的流动相的浓度如下：

0～5min体积浓度10％甲醇水溶液；

5～25min体积浓度10％～100％甲醇水溶液；

25～40min纯甲醇。

经指纹图谱分析，13.3分钟时出峰化合物为青霉酸。

在本发明中，所述回收溶剂后还优选包括对回收的粗提液进行提纯；所述提纯的方法优选包括以下步骤：

a.将所述粗提液经减压硅胶正相柱分离，收集液相；

b.将所述液相经高压液相分离，得到青霉酸纯品。

在本发明中，所述步骤a中减压硅胶正相柱的固定相优选为200～300目硅胶，减压硅胶正相柱的流动相优选为二氯甲烷或甲醇-二氯甲烷混合溶剂；所述甲醇-二氯甲烷混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为1～50:50～99。

在本发明中，所述步骤b中高压液相分离用流动相优选为体积浓度40％甲醇水溶液。

为了明确提取物成分，收集高压液相分离7分钟时出峰的化合物分别进行核磁共振、高效液相制备谱图、氢谱和碳谱分析，结果发现，提取物为青霉酸，结构式如式(1)所示。

下面结合实施例对本发明提供的一株生产青霉酸的菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

从青岛市崂山区地区野生的中华补血草的根际采集根际土壤，用于后续分离。将中华补血草根际土接种于分离培养基(麦芽浸膏3％，蛋白胨0.5％，琼脂2％，1000ml海水)上在28℃条件下进行分离培养，经形态鉴定，筛选得到的菌株为penicilliumsp.。将分离得到的菌株于2018年11月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.16496。

实施例2

将实施例1分离得到penicilliumsp.菌株接种至菌种培养基(海水的pda培养基)上培养，得到菌种。配制大米培养基作为发酵培养基，每500ml的锥形瓶中添加80g大米，120ml海水，0.24g蛋白胨，经过高压灭菌，得到发酵培养基。将上述制备的0.5cm×0.5cm×0.5cm规格的琼脂块菌种接种三块至锥形瓶中，接种50个锥形瓶置于28℃恒温静置培养40～50d，得到发酵物。

向每个瓶中加入200ml乙酸乙酯浸泡过夜，然后在超频率59khz，超声温度为室温(20℃)，超声功率135w的条件下连续超声10minn，将超声后的物料进行固液分离，得到的乙酸乙酯相经减压蒸馏回收溶剂(转蒸发仪：水浴温度为35c，循环水式真空泵使装置为真空状态，真空表读数约为-0.1mpa相对压力)，最后所得粗提物40.71g。将粗提物进行指纹谱图分析，分析条件如下：0～5min体积浓度10％甲醇水溶液，5～25min体积浓度50％甲醇水溶液，25～40min纯甲醇。粗提物的指纹谱图见图1，13.3分钟出峰化合物经检测为青霉酸。

实施例3

将实施例2制备的粗提物过减压硅胶正相柱，固定相为200～300目硅胶，流动相为甲醇-二氯甲烷混合溶剂，甲醇和二氯甲烷的体积比为50:50，分离得到青霉酸和二氢青霉酸混合物。将得到的混合物经高压液相分离，高压液相仪器参数：tianjinbonna-agelatechnologiesco.,ltd.,china，泵型号—hp-q-p050，紫外检测器型号—hp-q-uv100s，柱参数—innovalcolumn(10×250mm,10μm)，得到精制提取物。高效液相分析得到的青霉酸高效液相制备谱图见图2。40％甲醇水溶液作为流动相，在第7分钟出峰，收集峰组分进行核磁共振分析、氢谱分析和碳谱分析。经核磁数据鉴定为青霉酸，其中核磁共振结果见表1。青霉酸氢谱谱图见图3。青霉酸碳谱谱图见图4。

表1.化合物青霉酸核磁数据(500，125mhz,cdcl3,tms,δppm)

经紫外检测器检测，本发明提取得到的青霉酸纯品，纯度在99.5％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。