本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法。
背景技术：
纤维连接蛋白(fibronectin，fn)，也做纤维结合蛋白，是一种分布极为广泛的高分子量糖蛋白。存在于血浆、细胞胞内物质及不同细胞表面中，它通常以分子量为450kd左右的二聚体形式存在，单体分子量为220-250kd，由位于蛋白质羧基端的二硫键相连。纤维连接蛋白大多以可溶的形式存在于血浆等体液中，以不可溶的形式存在于细胞外基质中。它具有与细胞外基质蛋白如胶原、循环血液蛋白如血纤蛋白、糖胺聚糖如肝素等物质的结合，因此，在很多重要的生理过程如胚胎发育、伤口愈合、止血和凝血中都发挥着重要的作用。
早期从组织中纯化fn的方法多为冷沉淀法，fn与一些杂蛋白在4℃以下静置时会以沉淀形式析出，之后再以沉淀和离子交换层析等方法进一步纯化；从培养纤维原表面分离fn蛋白则采用低浓尿素的提取方法；而anti-fn介质则可广泛地应用于血浆及细胞培养物中fn的纯化。但这些方法都逐渐以亲和层析所取代，原理是基于它与变性胶原蛋白(通常为明胶)的高特异亲和性的结合，然后以1mollkbr、1-8moll尿素或胺盐洗脱。
纤维连接蛋白在血浆中的含量极为丰富，约为300mg/l，因此血浆是获得fn的一个主要来源。国外生产的fn产品都是从人血浆中提取的,作为化妆品添加剂并可用于药物中治疗创伤、烧伤、休克等，具有重大的社会效益及经济价值，但血浆来源有限，且生产工艺复杂，不利于规模化放大。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法，依次包括以下步骤：
1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；
2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；
3)将初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白。
步骤1)中以重组人纤维连接蛋白基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳抛光成半精米，并研磨成80-100目的米粉；将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得粗蛋白提取物；所述提取缓冲液为：0-50mmtris、0-50mmpb，0-110mmnacl，ph5.9-8.0；优选的提取组分中可添加0.8-1mmpmsf或5-10mmgsh或0.05-0.1％tween80中的一种或数种。
步骤2)中阳离子交换层析的填料选自nanogel30/50sp、unigel30/80sp、spbestaroseff、spbestarosehp、bestarosediomondmmc、unipheres、macropreps、porosxs、sp-6ff、sp-6hp、spsepharosetmfastflow；优选使用nanogel50sp或spbestarosehp。阳离子交换层析可选择ph梯度洗脱或者氯化钠浓度梯度洗脱，优选氯化钠梯度洗脱。在一种实施方式中，选择ph和氯化钠梯度结合的方式洗脱，洗杂缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.13m氯化钠，0.3m氯化钠，ph为5.9，洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.1m氯化钠，0.3m氯化钠，ph为7.0。在另一种实施方式中，选择氯化钠梯度洗脱，层析过程的洗杂和洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.15m氯化钠，0.3m氯化钠，ph为7.0。
步骤3)中阴离子交换层析的填料选自qbestarosefastflow、qbestarosehp、bestarosedeae、qsepharosetmhp、qsepharosetmfastflow、deaesepharosetmfastflow、unigel30/80q、nanogel30/50q、unosphereq。优选使用博格隆qff或汇研qhp。阴离子交换层析可选择氯化钠浓度梯度洗脱。在一种实施方式中，层析过程的洗杂和洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液，0.2m氯化钠，0.3m氯化钠，ph均为7.0。
经阴离子交换层析获得的目标洗脱组分可用已知的方法进行浓缩、冷冻干燥法等制成成品。
在阳离子交换层析中，使用的上样缓冲液包括磷酸盐缓冲液，其ph小于7.5，盐浓度小于0.12m。
阳离子交换层析中目标物(重组人纤维连接蛋白)的洗脱缓冲液包括磷酸盐缓冲液和氯化钠；ph为6.8-7.1，优选的氯化钠浓度为0.3m，缓冲液的ph为7.0。
在一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为spbestarosehp时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、0.09-0.13m氯化钠，ph为5.8-7.1。
在另一种实施方式中，当阳离子交换层析的填料为nanogel50sp时，使用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液、0.12-0.3m氯化钠，ph为6.8-7.1。
在另一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为汇研qhp时，使用的缓冲液包括磷酸盐、0.1-0.3m氯化钠，ph为6.8-7.1。
在另一种实施方式中，当阴离子交换层析的填料为博格隆qff时，使用的缓冲液包括磷酸盐、0.1-0.3m氯化钠，ph为6.8-7.1。
本发明还提供一种用于制备所述的基因工程水稻种子的植物表达载体，所述表达载体是将表达人纤维连接蛋白的基因与水稻特异性启动子gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。优选的，所述表达人纤维连接蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述质粒载体为pospmp626。
本发明所用的原料来源于表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子，利用水稻胚乳特异性表达的启动子和信号肽，介导fn进入水稻胚乳细胞的内膜系统，并储存到水稻胚乳的蛋白体中，从而使fn能在水稻种子内大量积累，最终达到较高的表达水平。由于水稻表达体系中不存在fg和vwf等血浆特有的杂质，因此以水稻种子进行fn的分离纯化具有非常大的优势，具有与其他来源不同的纯化方法。
本发明利用阳离子和阴离子交换两步层析对表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取fn并进行纯化，并对工艺条件进行摸索和优化，为水稻种子种分离纯化重组人纤维连接蛋白提供了一种可规模化放大的纯化工艺。
附图说明
图1为质粒pospmp626结构示意图。
图2为质粒pospmp627结构示意图。
图3为质粒pospmp628结构示意图。
图4为t1代基因工程材料中目的基因的阳性检测，其中m为dna标准分子量marker；pmp628-51、628-62、628-63、628-64、628-65、628-68、628-69和628-71为t1代转基因材料；nc，阴性对照受体品种；p为阳性对照质粒。
图5为t1代基因工程材料中标记基因的阳性检测，其中m为dna标准分子量marker；pmp628-51、628-62、628-63、628-64、628-65、628-68、628-69和628-71为t1代基因工程材料；nc，阴性对照受体品种；p为阳性对照质粒。
图6为sds-page鉴定t1代基因工程种子中fn的表达量检测，其中m为标准分子量marker；pc为220kd的humanplasmafibronectin(fn)纯蛋白(merck公司)；pmp628-51、628-62、628-63、628-64、628-65、628-68、628-69和628-71为转基因材料。图7为不同heparin亲和层析洗脱样品的sds-page检测，其中纳微、千纯、博格隆、ge、汇研分别对应nw、qc、bgl、ge、hy；
图8为heparin层析优化的洗杂条件所获样品的sds-page检测，其中m为标准分子量maker，load为蛋白提取液，ft为穿透液，10％b为100mmnacl，18％b、21％b、29％b、36％b分别对应180mm、210mm、290mm、360mmnacl。
图9为heparin层析优化的洗杂条件所获样品的sds-page检测，其中load为蛋白提取液，ft为穿透液，12％b、14％b、16％b、29％b分别对应120mm、140mm、160mm、290mmnacl，cip为再生液。
图10为汇研qff层析ph、上样电导、流速doe实验预测刻画结果。
图11为汇研qff层析上样电导、洗脱ph、洗脱电导doe实验预测刻画结果。
图12为geqhp和汇研qff层析填料的对比实验样品sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，load为蛋白提取液，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu为洗脱液。
图13为geqhp和汇研qhp层析填料的对比实验样品sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，load为蛋白提取液，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu为洗脱液，cip为再生液。
图14为提取液ph稳定性研究样品sds-page检测，其中m为标准分子量marker，上清为调ph后样品离心后的上清，沉淀为调ph后样品离心后的沉淀再次复溶。
图15为博格隆sphp层析样品的sds-page检测，其中m为标准分子量marker，load为蛋白提取液，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu(10x)为洗脱液浓缩10倍。
图16为纳微nanogel50sp填料的层析样品sds-page检测，其中m为标准分子量marker，load为蛋白提取液，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu为洗脱液。
图17为汇研qhp、纳微unigel80q、博格隆qff填料的层析样品sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，load为nanogel50sp层析洗脱收集液，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu为洗脱液，cip为再生液。
图18为博格隆sphp-汇研qhp两步层析纯化样品的sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，还原为汇研qhp层析洗脱液加入还原型上样液处理的样品，非还原为汇研qhp层析洗脱液加入非还原型上样液处理的样品。
图19为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化样品的sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，load为蛋白提取后样品调ph至上样ph，ft为穿透液，wash为洗杂液，elu为洗脱液。
图20为纳微nanogel50sp层析图谱。
图21为博格隆qff层析图谱。
图22为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化工艺验证样品的sds-page检测结果，其中m为标准分子量marker，p为fn阳性参照，0927、0928、0929为不同批次样品，还原为还原性电泳，非还原为非还原型电泳。
图23为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化工艺验证样品的sec-hplc图谱。
图24为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化工艺得到的目标蛋白细胞活性检测结果。
具体实施方式
下文将通过实施例和附图以详细说明本发明的技术方案，从而更好地阐述本发明的特点和优势。所提供的实施例应被解释为对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的技术方案。
以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。
实施例1：重组人纤维连接蛋白基因工程稻谷的制备
本实施例选用水稻特异性启动子gt13a及其信号肽来介导重组人纤维连接蛋白基因在水稻胚乳细胞中的表达，具体参考公开号为cn100540667中的方法来构建本发明的水稻特异性表达重组人纤维连接蛋白载体以及筛选基因工程水稻植株，将其中所述的重组人血清白蛋白换成本发明的重组人纤维连接蛋白。用如图1所示的质粒pospmp626来构建水稻胚乳特异性表达盒。将所述合成的经密码子优化的人fn基因(seqidno.1)用myli和xhoi酶切后克隆到pospmp02中构建成质粒pospmp627，如图2所示；然后用hindiii和ecori酶切pospmp627，将长度为7152bp的含gt13a启动子及其信号肽序列还有经密码子优化的fn基因以及nos终止子的整个表达盒插入到双元表达载体1300，构建农杆介导菌质粒，命名为pospmp628，具体如图3所示。将所述pospmp628质粒转化根癌农杆菌eha105(美国invitrogen公司)，通过根癌农杆菌介导共转化将pospmp628转化到水稻品种tp309的愈伤再生组织中，经培养、筛选和诱导后形成完整的植株；然后，通过pcr扩增来鉴别阳性转化植株，用目的基因的正向引物fn-f1(seqidno.2:5’-atcaactaccgcaccgagat-3’)和反向引物fn-r1(seqidno.3:5’-tcttctccttcggggtcac-3’)进行pcr扩增，产物大小为679bp。鉴别结果表明，通过根癌农杆菌介导转化获得72株独立的重组人纤维连接蛋白转基因水稻和4株独立的高产重组人纤维连接蛋白基因工程水稻。鉴定结果如图4和图5所示。
本实施例还通过sds-page方法测定上述4株基因工程水稻中osrhfn的表达水平，结果显示pmp628-71家系中fn的表达最高。如图6所示。通过以上多种检测方法，最终筛选获得基因工程水稻植株。
seqidno.1
实施例2：重组人纤维连接蛋白(hfn)粗提液的制备；
将重组人纤维连接蛋白基因工程稻谷脱壳抛光成半精米，研磨成80-100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1：5(重量/体积，kg/l)的比例混合，于常温提取1小时。提取缓冲液的成分为：20mm磷钠盐(pb)ph8.0，提取液中预先加入5mm谷胱甘肽、1mmpmsf、0.1％tween80。将上述得到的混合物经滤布式板框压滤机压滤，得到澄清的hfn蛋白粗提液。加入谷胱甘肽可提高hfn的提取量，减少二聚体和多聚体，加入pmsf是广谱蛋白酶抑制剂，可以减少hfn提取过程中的降解，加入tween80可保持hfn提取过程中稳定性。
实施例3：osrhfn小试纯化工艺优化
1.osrhfn粗纯条件优化
1.1作为粗纯的亲和层析介质筛选及层析条件优化
本发明选取纳微、千纯、博格隆、ge、汇研五家公司生产的不同类型的heparin亲和填料在同一条件下进行对比实验。实验最终步骤的样品用sds-page进行检测，结果见图7。
经过比较发现，纳微、博格隆、ge三家的heparin填料纯化效果较好，考虑到纳微填料基架为聚苯乙烯，稳定性和重复性更适合作为捕获步骤层析介质。通过实验条件摸索，heparin在高盐条件下未能减少非特异性吸附且有大量目的蛋白损失，因此选择低盐条件进行上样。在此基础上进行了洗杂条件优化，洗杂的盐浓度范围为100-180mm，ph为8.0，洗脱盐浓度为290mm，ph为8.0。最终确定heparin最佳层析条件为120mmnacl，洗脱条件为290mmnacl。优化结果见图8和图9。
1.2作为粗纯的阴离子层析介质筛选及层析条件优化
由于heparin亲和层析特征主要表现为离子交换作用，结合heparin亲和层析和阴离子交换层析结果，可用阴离子交换层析进行替换。从37种阴离子填料qbestarosefastflow、qbestarosehp、bestarosedeae、qsepharosetmhp、qsepharosetmfastflow、deaesepharosetmfastflow、unigel30/80q、nanogel30/50q、unosphereq，均能有效富集目的蛋白，且能去除部分杂蛋白。
以汇研qff用于层析条件摸索，选取ph值、电导、流速三个因素，每个因素选择三个水平，进行doe实验。最终确定电导9.6ms/cm，ph为7.6、流速为0.58ml/min作为层析的最佳上样条件，此条件下fn回收率最高为58.13％，doe实验预测结果见图10。为进一步提高qff的回收率，固定上样ph，选取上样电导、洗脱电导、洗脱ph三个因素，每个因素选择三个水平进行doe实验。模型显示当上样电导为9.6ms/cm，洗脱电导为30ms/cm，ph为7.0时，fn回收率最高为58.5％，纯度为13.2％，doe实验预测结果见图11。
无论在低电导还是在高电导条件下，汇研qff均有穿透，导致回收率偏低，根据阴离子填料筛选复筛结果，可尝试用汇研qhp和geqhp作为替换填料，替换结果见图12和图13。优化之后的洗杂缓冲液成份为50mmtris-hcl，194mmnacl，ph7.6，洗脱缓冲液成份为50mmtris-hcl，268mmnacl，ph7.6。
1.3作为粗纯的阳离子层析介质筛选及层析条件优化
1.3.1博格隆sphp层析条件优化
为更好衔接阳离子交换层析，将tris缓冲体系改变为pb缓冲体系，按照同样条件进行提取后，上样样品的澄清度有较大改善，通过调节提取液的ph对样品的稳定性进行研究，结果见图14，当ph＜6.5时，提取液开始变浑浊，因此选择博格隆sphp层析上样ph为7.0。在此条件下，优化的洗杂条件为20mmpb，130mmnacl，ph5.9为洗杂缓冲液，洗脱缓冲液为20mmpb，100mmnacl，ph6.95。层析样品检测结果见图15。
1.3.2纳微nanogel50sp层析条件优化
纳微nanogel50sp层析介质是一种高交联的多孔聚苯乙烯微球，具有高流速、高载量、耐高盐、低反压等特性；实验发现nanogel50sp在高流速下载量高达22.7g米粉/ml填料，经过放大确认后安全载量依然有12.5g米粉/ml填料，作为捕获步骤比较合适。优化的洗杂缓冲液成分为20mmpb，150mmnacl，ph为7.0；洗脱缓冲液成分为20mmpb，300mmnacl，ph7.0。层析样品检测结果见图16。
2.osrhfn精纯条件优化
为了获得简单的工艺，根据前期研究结果，选择汇研qhp、博格隆qff、纳微unigel80q进行实验。发现汇研qhp和博格隆qff均有较好的分离效果，在同样条件下unigel80q目的蛋白的洗脱盐浓度降低，有利于后期工艺。综合考虑，选择粒径较大的qff作为精纯介质，qhp作为备选方案。检测结果见图17。
实施例4：博格隆sphp-汇研qhp两步纯化工艺
根据实施例3粗纯和精纯层析条件筛选结果，博格隆sphp和汇研qhp两步层析作为优选的工艺之一进行osrhfn的分离纯化。
提取：称取1000g基因工程水稻米粉，按照实施例1进行提取。
阳离子交换层析作为初级纯化：235mlspbestarosehp层析柱以20mmpb，ph7.0为平衡缓冲液，采用ph为5.9的20mmpb，130mmnacl为洗杂缓冲液，采用ph7.0的20mmpb，100mmnacl为洗脱缓冲液进行层析。
阴离子交换层析作为末级纯化：28ml汇研qhp层析柱以ph为7.0的20mmpb为平衡缓冲液，采用ph为7.0的20mmpb，200mmnacl为洗杂缓冲液，采用ph为7.0的20mmpb，300mmnacl为洗脱液进行层析。层析样品sds-page检测结果见图18。
实施例5：纳微nanogel50sp–博格隆qff两步纯化工艺
根据实施例3粗纯和精纯层析条件筛选结果，纳微nanogel50sp–博格隆qff两步层析作为优选的工艺之一进行osrhfn的分离纯化。
提取：称取1000g基因工程水稻米粉，按照实施例1进行提取。
阳离子交换层析作为初级纯化：90mlnanogel50sp层析柱以20mmpb，ph7.0为平衡缓冲液，20mmpb，145mmnacl，ph7.0为洗杂缓冲液，20mmpb，300mmnacl，ph7.0为洗脱缓冲液进行层析纯化。
阴离子交换层析作为末级纯化：16ml博格隆qff层析柱以ph为7.0的20mmpb为平衡缓冲液，采用ph为7.0的20mmpb，200mmnacl为洗杂缓冲液，采用ph7.0的20mmpb，300mmnacl为洗脱缓冲液进行层析。层析样品sds-page检测结果见图19。
实施例6：osrhfn纯化工艺验证
为验证小试工艺的重复性，将优选的纳微nanogel50sp–博格隆qff两步层析工艺进行了三次验证，验证程序具体实施步骤如下：
提取：向5000ml20mmpb，ph8.0提取液中加入7.7ggsh(100ml超纯水溶解)，用2mnaoh复调ph至8.0；加入0.87gpmsf(435ml异丙醇溶解)，5mltween80，搅拌混匀；称取1kgfn米粉，加入提取液中室温搅拌提取1h，加入250g助滤剂，正压过滤，压滤液用0.45μm滤膜过滤获得含有osrhfn的粗提液。
阳离子交换层析作为初级纯化：层析柱以20mmpb，ph7.0为平衡缓冲液，20mmpb，140mmnacl，ph7.0为洗杂缓冲液，20mmpb，300mmnacl，ph7.0为洗脱缓冲液进行层析，层析图谱见图20。
阴离子交换层析作为末级纯化：层析柱以20mmpb，ph7.0为平衡缓冲液，20mmpb，200mmnacl，ph7.0为洗杂缓冲液，20mmpb，300mmnacl，ph7.0为洗脱缓冲液进行层析，层析图谱见图21。
三批验证批次纯度、蛋白浓度和产率结果见下表。
三批验证批次的sds-page检测结果见图22。根据实验数据，所获得的目标蛋白的纯度大于95％。图23为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化工艺验证样品的sec-hplc图谱。图24为纳微nanogel50sp-博格隆qff两步层析纯化工艺得到的目标蛋白细胞活性检测结果。本发明提取纯化方法所获得的重组人纤维连接蛋白的纯度和活性均令人满意。
sequencelisting
<110>武汉禾元生物科技股份有限公司
<120>一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法
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