一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法与流程

文档序号:21108267发布日期:2020-06-16 21:30阅读:2396来源:国知局
技术特征:

1.一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法,依次包括以下步骤:

1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液;

2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析,得到初级产物;

3)将所述初级产物经阴离子交换层析,得到纯化的重组人纤维连接蛋白目标物;

其中阳离子交换层析的填料选自nanogel30/50sp、unigel30/80sp、spbestaroseff、spbestarosehp、bestarosediomondmmc、unipheres、macropreps、porosxs、sp-6ff、sp-6hp、spsepharosetmfastflow;阴离子交换层析的填料选自qbestarosefastflow、qbestarosehp、bestarosedeae、qsepharosetmhp、qsepharosetmfastflow、deaesepharosetmfastflow、unigel30/80q、nanogel30/50q、unosphereq。

2.根据权利要求1所述的方法,其中阳离子交换层析的填料为nanogel50sp。

3.根据权利要求1所述的方法,其中阴离子交换层析的填料为qbestaroseff。

4.根据权利要求1所述的方法,其中步骤1)所述重组人纤维连接蛋白粗提取液是通过下述方法制备,包括步骤:

4a)以表达重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子为原料,将稻谷脱壳抛光成半精米并研磨成80-100目的米粉;

4b)将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合,常温下提取0.5-2小时,获得蛋白粗提取物;所述提取缓冲液为:10-50mmtris、10-50mmpb,0-110mmnacl,ph5.9-8.0;

4c)将粗蛋白提取物过滤,得到含重组人纤维连接蛋白的粗提取液。

5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于步骤4b)中的提取缓冲液中添加0.8-1mmpmsf、5-10mmgsh和0.05-0.1%tween80中的一种或数种。

6.根据权利要求1所述的方法,将由步骤1)获得的含重组人纤维连接蛋白的粗蛋白提取液经过阳离子交换层析,进行初级分离纯化,获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物;其中:所述阳离子交换层析介质为纳微nanogel50sp阳离子交换填料,层析步骤为:

6a)采用5-15倍柱体积的组分为10-50mmpb,0-120mmnacl,ph为6.8-7.1的平衡缓冲液,以50-200cm/小时的流速平衡层析柱;

6b)以步骤1)的蛋白粗提取液作为上样样品,其中样品电导为2.5-13.5

ms/cm,ph为6.8-7.1;

6c)采用组分为10-50mmpb,130-200mmnacl,ph为6.8-7.1的洗杂缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白,洗杂缓冲液体积为20-40倍柱体积。

6d)采用组分为10-50mmpb,250-300mmnacl,ph为6.8-7.1的洗脱缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱样品,所得洗脱液为初级产物。

7.根据权利要求1所述的方法,将由步骤1)获得的含重组人纤维连接蛋白的蛋白粗提取液经过阳离子交换层析,进行初级分离纯化,获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物;其中所述阳离子交换层析介质为博格隆spbestarosehp阳离子交换填料,层析步骤为:

7a)采用5-15倍柱体积组分为10-50mmpb,ph为6.8-7.1的平衡缓冲液,以50-200cm/小时的流速平衡层析柱;

7b)以步骤1)的蛋白粗提取液作为上样样品,其中样品电导为2.5ms/cm,ph为6.8-7.1;

7c)用7a)中的平衡缓冲液20-40倍柱体积进行再平衡,采用组分为10-50mmpb,100-130mmnacl,ph为5.8-6.1的洗杂缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白;

7d)用组分为10-50mmpb,90-110mmnacl,ph为6.8-7.1的洗脱缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱样品,所得洗脱液为初级产物。

8.根据权利要求1所述的方法,将由步骤2)获得的含重组人纤维连接蛋白的初级产物经过阴离子交换层析,获得纯化的重组人纤维连接蛋白目标物;其中:所述阴离子交换层析介质为博格隆qbestaroseff或汇研qhp阴离子交换填料;具体步骤如下:

8a)采用5-15倍柱体积的平衡缓冲液,以50-200cm/小时的流速平衡层析柱,平衡缓冲液的组分为10-50mmpb,0-150mmnacl,ph为6.8-7.1;

8b)以步骤2)的初级产物作为上样样品,其中样品电导为12.5-17.6ms/cm,ph为6.8-7.1;

8c)采用组分为10-50mmpb,200-220mmnacl,ph为6.8-7.1的洗杂缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱杂蛋白;

8d)采用组分为10-50mmpb,250-300mmnacl,ph为6.8-7.1的洗脱缓冲液,以50-200cm/小时的流速洗脱样品,所得洗脱液为终级产物。

9.一种用于制备权利要求1所述的基因工程水稻种子的植物表达载体,其特征在于,所述表达载体是将表达人纤维连接蛋白的基因与水稻特异性启动子gt13a及其信号肽导入质粒载体构建。

10.根据权利要求9所述的植物表达载体,其特征在于所述表达人纤维连接蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示,所示质粒载体为pospmp626。


技术总结
本发明公开了一种表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。将基因工程稻谷粉碎后与提取缓冲液混合提取后过滤,得到含重组人纤维连接蛋白的粗提液;将含重组人纤维连接蛋白的粗提液经过阳离子交换层析,进行初级分离纯化,获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物;将初级产物经过阴离子交换层析,进行末级分离纯化,获得重组人纤维连接蛋白目标物。该方法成本低,易于工业化放大。所获得的OsrhFn目标物SEC‑HPLC纯度大于95%。生物活性较好。

技术研发人员:杨代常;占全
受保护的技术使用者:武汉禾元生物科技股份有限公司
技术研发日:2018.12.10
技术公布日:2020.06.16
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