源于巴马长寿村的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物对、鉴定方法及其应用与流程

本发明涉及生物技术领域，特别涉及源于广西巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的pcr菌株鉴定及其应用。

技术背景

随着经济社会的发展和生活节奏的加快，越来越多的人处于亚健康状态或者患有“富贵病”。近年来，大量的研究表明，乳酸菌是人体肠道中重要的益生菌，对维持宿主肠道的微生态平衡，改善人体代谢机能和免疫系统功能起着至关重要的作用，能够缓解人体亚健康状态，甚至治疗部分疾病。然而乳酸菌同菌种不同菌株的发酵性能、肠道耐受能力和益生功能差异极大，益生菌的功能研究需要达到菌株水平。源于广西巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301益生作用突出，但是由于菌株鉴定较为复杂困难，尚缺少快速有效的手段对其进行快速确认。本发明利用多基因组比对，设计出4对能够对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301形成特异性扩增图谱的标志引物，能够快速确认鉴定鼠李糖乳杆菌hsryfm1301，并为其他菌株的快速鉴定提供思路。

技术实现要素：

本发明目的在于提供能够快速鉴定鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物及其应用，本发明设计的引物对能够从鼠李糖乳杆菌hsryfm1301扩增到稳定条带，并组成特异性图谱，且扩增能力稳定，可以作为鼠李糖乳杆菌hsryfm1301菌株的标志引物。

本发明通过多菌株全基因组基因家族分析，设计了4对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物(引物特性见表1)。经pcr扩增证明，该4对引物能够对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301形成特异性扩增图谱，具有从大量菌株中确认鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的能力，能够作为鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物。

表1标志引物特性

本发明还公开了一种鉴定鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的方法：

(1)提取待测样本中的dna；

(2)利用权利要求1所述的引物对，使用rtaqdna聚合酶对待测样本的dna进行扩增，pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行电泳；

(3)eb染色之后观察：

如果hsryfm1301-1f/r能够从待测样本dna中扩增条带大小为900bp，则证明样本中含有鼠李糖乳杆菌hsryfm1301；

如果hsryfm1301-2f/r能够从待测样本dna中扩增条带大小为1100bp，则证明样本中含有鼠李糖乳杆菌hsryfm1301；

如果hsryfm1301-3f/r能够从待测样本dna中扩增条带大小为1000bp，则证明样本中含有鼠李糖乳杆菌hsryfm1301；

如果hsryfm1301-4f/r能够从待测样本dna中扩增条带大小为800bp，则证明样本中含有鼠李糖乳杆菌hsryfm1301。

优选的，扩增条件见表2：

表24对引物的扩增条件和程序

优选的，电泳条件为：120v，300ma，30min。

本发明又公开了上述鉴定方法在发酵制品中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301存在验证中的应用。

本发明又公开了上述鉴定方法在粪便中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301存在验证中的应用。

本发明又公开了上述鉴定方法在鼠李糖乳杆菌同种异株混合培养物的菌株计数中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

第一，对分离自广西巴马长寿村的、具有肠道环境耐受能力和益生功能的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301和lv108进行全基因组测序，将此2基因组与鼠李糖乳杆菌gg和lc705基因组进行基因家族分析，得到鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的特有基因；根据特有基因的序列设计4对引物，并评价其快速鉴定鼠李糖乳杆菌hsryfm1301菌株的能力。结果表明，利用4对引物hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r能够从鼠李糖乳杆菌hsryfm1301扩增到明显的特异性条带。

第二，利用4对引物对植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜热链球菌和其他16株鼠李糖乳杆菌的dna进行扩增，所得扩增图谱均不同于hsryfm1301；4对引物均能从生产中的鼠李糖乳杆菌hsryfm1301扩增条带。表明hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r能够从鼠李糖乳杆菌hsryfm1301扩增到稳定条带，并组成特异性图谱，且扩增能力稳定，可以作为鼠李糖乳杆菌hsryfm1301菌株的标志引物。使用此引物能够从混合物中鉴定鼠李糖乳杆菌hsryfm1301，不需要复杂仪器，并能够极大节省操作时间和成本。

附图说明

图1是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株和参照菌株lgg的pcr扩增图谱。

图2a-1是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对非同种乳酸菌的pcr扩增图谱；

图2a-2是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对非同种乳酸菌的pcr扩增图谱；

图2b是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌不同菌株的pcr扩增图谱；

图中：lv108是引物设计的参照菌株，属于鼠李糖乳杆菌；lv-1、r13、r26、lpra-1均为不同的鼠李糖乳杆菌菌株；

图2c是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌不同菌株的pcr扩增图谱。

图中：sp1、1505、ly0、bg、bm03均为不同的鼠李糖乳杆菌菌株；

图2d是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌不同菌株的pcr扩增图谱。

图中：grx19、bm01、f和grx10均为不同的鼠李糖乳杆菌菌株；

图2e是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hn001的pcr扩增图谱；

图中：hn001是从市售菌粉产品(葆迪乐)中分离出的鼠李糖乳杆菌；

图3a是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301生产菌株和产品的pcr扩增图谱；

图3b是hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301生产菌株和产品的pcr扩增图谱；

图3a、3b中：样品a为hsryfm1301菌粉产品(萨科)；b为混合菌株发酵乳富集培养物(皇氏甲天下乳业),c,d,e为利用选择培养基从发酵乳中纯化所得的菌株。

具体实施方式

本发明通过多菌株基因家族分析，筛选出鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的特有基因，在特有基因中设计引物(hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r)，并利用pcr扩增验证这4对引物的有效性。通过对非同种乳酸菌(植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜热链球菌)和同种不同菌株(lv108、lv-1、r13、r26、lpra-1、grx19、sp1、1505、ly0、bg、bm03、bm01、f和grx10)的pcr扩增实验，证实hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301形成明显有别于其他菌株的特异性扩增图谱。

1引物合成及母株检验

对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301进行全基因组测序，以lgg、lc705和lv08为参照菌株，通过多菌株基因家族分析，筛选出鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的特有基因，并在这些基因中设计引物：hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r。4对引物委托生工生物工程股份有限公司(上海)合成。鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株在mrs固体培养基中划线纯化，挑取单菌落至mrs培养基37℃培养24h，转接至新鲜mrs培养基(2％v/v)，37℃培养24h；收集菌体，使用柱式dna抽提试剂盒(生工生物，上海)提取鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株的dna。使用rtaqdna聚合酶(takara，大连)按照表3程序对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株的dna进行扩增，pcr产物利用1％琼脂糖凝胶进行电泳(120v,300ma,30min)，eb染色之后观察。

表34对引物的扩增条件和程序

hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r均能够从鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株的dna扩增出清晰条带，扩增条带大小分别约为900bp、1100bp、1000bp和800bp，与表1中的预计长度吻合(图1)。4对引物均无法从参照菌株lgg的dna扩增到条带，表明基因家族分析的结果可信，4对引物均具有可用性。

2非同种乳酸菌扩增检测

dna提取及pcr方法同上。为了验证4对引物的特异性，首先对乳酸菌其它菌种dna进行了扩增，结果表明4对引物均无法从植物乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的dna扩增到条带(图2a-1、图2a-2)；hsryfm1301-1f/r能够从干酪乳杆菌dna扩增到大于5000bp的条带，对区分效果不造成影响(图2a-1、图2a-2)。结果表明hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对几种乳酸菌的扩增图谱与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301不同，在种的水平上有较好的区分效果。

3鼠李糖乳杆菌不同菌株的扩增检测

本发明的目的是进行菌株间鉴定，将4对引物对实验室分离保存的其它14株鼠李糖乳杆菌进行扩增检测。鼠李糖乳杆菌lv108也是引物设计的参照菌株，4对引物均无法获得扩增条带(图2b)，进一步证实了基因家族分析的有效性。其他菌株方面，4对引物无法从实验室分离获得的13个鼠李糖乳杆菌的dna扩增到条带(图2b,2c,2d)，表现出较好的分辨效果。为了进一步验证4对引物的可靠性，我们从市售菌粉产品(葆迪乐)中分离出了鼠李糖乳杆菌hn001，4对引物对其dna均无扩增条带(图2e)。结果表明hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对15株鼠李糖乳杆菌的扩增图谱均显著不同于鼠李糖乳杆菌hsryfm1301，能够作为鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物。

4鼠李糖乳杆菌生产菌株和产品的扩增检测

为了验证hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301扩增图谱的稳定性，提取不同产品中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的dna进行扩增检测。结果表明hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r能够从鼠李糖乳杆菌hsryfm1301菌粉、发酵乳纯化菌株和混合菌株的dna扩增得到与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株相同的图谱(图3a、图3b)，表明4对引物对hsryfm1301的扩增效果并未受到生产培养和其他菌株的影响，证实了hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的扩增不仅具有特异性，而且具有稳定性，可以作为证实鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物。

应用实施例

1利用本发明引物快速鉴别鼠李糖乳杆菌hsryfm1301。

将不同鼠李糖乳杆菌进行培养、纯化，提取dna，利用hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r对dna进行扩增(程序见表3)，并将扩增图谱与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株扩增图谱进行比较，相同者为鼠李糖乳杆菌hsryfm1301。

2利用本发明引物验证发酵制品中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的存在。

收集浓缩发酵制品中的微生物(浓度较高时可不浓缩)，并对其进行裂解；以裂解液为模板，利用hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r进行pcr扩增(程序见表3)，得到与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株相同的扩增图谱，表明发酵产品中存在鼠李糖乳杆菌hsryfm1301。

3利用本发明引物验证粪便中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的存在。

收集浓缩粪便中的微生物(浓度较高时可直接裂解悬液)，并对其进行裂解；以裂解液为模板，利用hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r进行pcr扩增(程序见表3)，得到与鼠李糖乳杆菌hsryfm1301母株相同的扩增图谱，表明粪便样品中存在鼠李糖乳杆菌hsryfm1301。

4鼠李糖乳杆菌多菌株混合培养物中hsryfm1301的计数

基于hsryfm1301-1f/r、hsryfm1301-2f/r、hsryfm1301-3f/r和hsryfm1301-4f/r，利用含有对应基因片段的puc19重组质粒做标准曲线。收集混合培养物中的微生物(浓度较高时可不浓缩)，并对其进行裂解；利用rt-qpcr技术对其计数，计算得出混合样品中鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的数量。

<110>扬州大学皇氏集团股份有限公司

<120>源于巴马长寿村的益生菌鼠李糖乳杆菌hsryfm1301的标志引物对、鉴定方法及其应用

<160>8

seqidno.1

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctattgacgagcaagcaggatc22

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<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<211>25

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<213>人工序列

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