一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法与流程

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法。

背景技术：

丁二酸（又名琥珀酸），是一种重要的四碳平台化合物，广泛应用于食品、塑料、医药、香料等工业。此外，丁二酸还是合成可降解塑料的主要原料，它可以与丁二醇、乙二醇、丙二醇等缩合聚合生产聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丙二醇丁二酸酯等具有优良特性且可完全被生物降解的高分子材料，是丁二酸潜在的最具发展前景的领域。美国能源部2004年公布的12种最有潜力大宗产品中，丁二酸排在第一位。

目前商品化的丁二酸主要是以顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐等石油基材料为原料通过催化加氢或电化学合成，其过程中伴随大量温室气体及有毒废弃物的排放，对环境污染严重。随着石油资源供应日益紧张以及环境意识的日益增强，化学法合成逐渐受到限制，不利于丁二酸相关产业的发展。而微生物发酵法生产丁二酸具有以可再生的生物质资源为原料、发酵条件温和、可固定co2等一系列优点，成为近年来国内外的研究热点之一。

在众多产丁二酸的微生物中，产琥珀酸放线杆菌（actinobacillussuccinogenes）以其产量高（最高可达110g/l）、耐受性（最高可耐160g/l葡萄糖）等优点，是目前最具发展前景的生产菌种之一。但目前微生物发酵法生产丁二酸的生产成本偏高，影响了其产业化的进程。采用廉价或废弃的非粮生物质资源替代葡萄糖进行丁二酸生产，不仅是对废弃的生物质资源再利用，而且可以有效降低丁二酸生产原料成本，对促进丁二酸生物发酵法生产具有重要的意义。谷物秸秆中的主要成分为纤维素和半纤维素，其中半纤维素的主要组分为木聚糖，能以木聚糖为唯一碳源生产丁二酸可以大大降低生产成本，并且还可以变废为宝。

嗜热厌氧杆菌是可以通过一体化生物加工工程直接利用半纤维素为碳源进行发酵的嗜热型野生菌株。cn106995790a公开了一株能够直接利用木质纤维素为碳源的热解糖高温厌氧菌株m5（thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum），其可以高效降解木质纤维素。

混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术。是纯种发酵技术的新发展，也是一种不需要进行复杂的dna体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。优点是可提高发酵效率甚至可形成新产品。根据生物间的结合方式，可分如下四型。（1）联合发酵：用两种或多种微生物同时接种和培养，例如我国发明的维生素c生产中山梨糖转化为二酮基古龙酸过程中的混菌发酵。（2）顺序发酵:先用甲菌进行常规发酵，再由乙菌等按顺序进行发酵，以共同完成数个生化反应，例如少根根霉(rhizopusarhizus)先把葡萄糖转化为反丁烯二酸，然后再由产气肠杆菌(enterococcusaerogenes)或普通变形杆菌(proteusvulgaris)将它还原为发酵产物琥珀酸。（3）共固定化细胞混菌发酵：把两种或多种微生物细胞同时包埋或吸附于同一载体上而进行的混菌发酵，例如黑曲霉(aspergillusniger)和运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)共同把淀粉转化为酒精等；（4）混合固定化细胞混菌发酵：将两种或多种微生物细胞分别固定化后，再把它们混在一起进行混菌发酵。

产琥珀酸放线杆菌不能够利用淀粉和纤维素等多糖类物质，但其可利用单糖作为碳源，如木糖，进行丁二酸的高效生产。而热解糖高温厌氧菌株可以将木聚糖等半纤维素高效降解成木糖。将热解糖高温厌氧菌株和产琥珀酸放线杆菌进行混菌发酵，可以实现利用木聚糖高效生产丁二酸的目标。目前还没有利用木质纤维素混菌生产丁二酸的报道。

技术实现要素：

发明目的：为了解决传统丁二酸发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本发明提供了一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法。

技术方案：本发明所述一种利用热解糖高温厌氧菌和产琥珀酸放线杆菌混菌发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：

（1）将活化的热解糖高温厌氧菌接种到含有木聚糖的发酵培养基中进行发酵，发酵24~120小时，得到发酵液；

（2）将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，混菌发酵生产丁二酸。

优选地，步骤（1）所述发酵时间优选为24~72h，更进一步地优选为发酵48小时，将活化的产琥珀酸放线杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中。此时发酵液中有一定量木糖，且木聚糖酶和木二糖酶的活性最高，能够连续降解木聚糖为木糖，而产琥珀酸放线杆菌可以利用降解得到的木糖生产丁二酸。接种时间过早（m5发酵少于24h），木聚糖酶的酶活较低，不利用后续木聚糖的降解；接种时间过晚（m5发酵72h-120h），则会导致菌株m5培养时间过长，木聚糖酶和木二糖酶分泌量减少，而先前分泌出的酶在55℃下的酶活下降，从而导致酶系的酶活下降，且部分降解得到的木糖也被菌株m5利用，从而减少了产琥珀酸放线杆菌的碳流量，最终导致丁二酸产量降低。因此，产琥珀酸放线杆菌的接种时间是混菌发酵生产丁二酸极为关键的步骤。

步骤（1）所述活化的热解糖高温厌氧菌的接种量为发酵培养基体积的1-10%；所述含有木聚糖的发酵培养基配方为：0.5-2.0g/lnacl，0.5-2.0g/lk2hpo4，0.5-2.0g/lkh2po4，1.0-5.0g/l酵母粉，1.0-3.0g/l玉米浆干粉，0.2-1.0g/lmgcl2·6h2o，0.1-0.6g/lnh4cl，0.01-0.05g/lcacl2·2h2o，0.5-2.0g/lfecl2·4h2o，0.1-0.5g/lkcl，木聚糖30-90g/l，溶剂为水，调节ph至6.0-6.5，通二氧化碳10-20min，121℃灭菌15min；所述发酵条件为：发酵温度50-65℃，发酵时间为36-72h，发酵ph为5.5-8.5（每隔12-24h调节ph），转速0-120rpm，可静置发酵，也可搅拌发酵。

优选地，所述含有木聚糖的发酵培养基中木聚糖浓度为60g/l。

优选地，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度55℃，发酵时间48h，发酵ph为7.5，转速120rpm。

所述热解糖高温厌氧菌的活化培养基配方为0.5-2.0g/lnacl，0.5-2.0g/lk2hpo4，0.5-2.0g/lkh2po4，1.0-5.0g/l酵母粉，1.0-3.0g/l玉米浆干粉，0.2-1.0g/lmgcl2·6h2o，0.1-0.6g/lnh4cl，0.01-0.05g/lcacl2·2h2o，0.5-2.0g/lfecl2·4h2o，0.1-0.5g/lkcl，木聚糖30-90g/l，溶剂为水，调节ph至6.0-6.5；活化条件为：将热解糖高温厌氧菌以接种量5%v/v接种到活化培养基中，50-65℃、0-120rpm活化48-96h，每隔12h调节ph至5.5-8.5。

其中，热解糖高温厌氧菌（thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum），菌株号为m5，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年2月27日，保藏号为cctccno:m2017072，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，已公开于中国申请专利cn106995790a中。所述产琥珀酸放线杆菌分类命名为产琥珀酸放线杆菌（actinobacillussuccinogenes），菌株号为130z，该菌株已在文献中公开，是现有菌株。

步骤（2）所述活化的产琥珀酸放线杆菌的接种方式如下：将活化的产琥珀酸放线杆菌培养液离心，将离心得到的沉淀接种到步骤（1）得到的发酵液中，其中活化的产琥珀酸放线杆菌培养液与步骤（1）得到的发酵液体积相同；所述发酵条件为：发酵温度35-39℃，发酵时间为24-96h，发酵ph为6.0-7.5，转速为100-200rpm。

优选地，步骤（2）所述发酵条件为：发酵温度37℃，发酵时间为72h，发酵ph为6.8，转速为150rpm。

所述产琥珀酸放线杆菌的活化培养基配方为0.5-2.0g/lnacl，10-20g/lk2hpo4，5-15g/lnah2po4，5-15g/lnahco3，1.0-5.0g/l酵母粉，1.0-5.0g/l玉米浆干粉，木糖30-90g/l，加入40-70g/l碱式碳酸镁，溶剂为水；活化条件如下：将产琥珀酸放线杆菌以接种量5%v/v接种到活化培养基中，37℃、150rpm活化12-24h得到活化的产琥珀酸放线杆菌培养液。

有益效果：与现有技术相比，本发明的技术优势如下：

（1）本发明通过先培养可以利用木聚糖为唯一碳源生长的热解糖高温厌氧菌m5，在高温厌氧的情况下将木聚糖降解为木糖，产琥珀酸放线杆菌不能直接利用半纤维素但可以利用木糖进行丁二酸的生产；目前以木质纤维素为底物生产丁二酸的报道都是利用酸解、碱解和酶解将木质纤维素进行水解，利用其水解液进行发酵，其成本高。而本发明采用的是混菌发酵中的顺序发酵方法，通过热解糖高温厌氧菌m5发酵时分泌的木聚糖酶和木二糖酶，将木聚糖逐步分解为木糖，在酶活较高时接入产琥珀酸放线杆菌，其利用已经分解而成的木糖和正在逐步被分解的木糖进行发酵，生产丁二酸。

（2）当热解糖高温厌氧菌m5培养了48h时加入产琥珀酸放线杆菌菌泥，丁二酸产量最高，达到43.10g/l，这也是目前利用木聚糖为唯一碳源时混菌发酵得到的最高丁二酸产量。m5培养48h时，此时发酵液中木聚糖酶的酶活最高，木聚糖酶有效地降解了木聚糖，并得到约20g/l的木糖；此后，在混菌体系中，木聚糖酶和木二糖酶仍具有较高的酶活，能够源源不断降解木聚糖为木糖，而产琥珀酸放线杆菌可以利用降解得到的木糖生产丁二酸，实现同步糖化发酵。

（3）该方法是一种不需要进行复杂的dna体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术。该方法降低了工业生产丁二酸的成本，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为优化混菌发酵条件下60g/l木聚糖为底物的产物；

图2为优化混菌发酵条件下60g/l木聚糖为底物，且m5发酵48h进行混合的发酵液中产物浓度变化图。

具体实施方式

实施例1不同木聚糖浓度对最终丁二酸产量的影响

（1）将热解糖高温厌氧菌以接种量5%v/v接种到活化培养基中，55℃、120rpm活化48h，每隔12h调节ph至7.5；

活化培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，5g/l酵母粉，2.5g/l玉米浆干粉，0.5g/lmgcl2•6h2o，0.3g/lnh4cl，0.015g/lcacl2•2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，0.3g/lkcl，木聚糖60g/l，溶剂为水，调节ph至7.5；

（2）将活化的热解糖高温厌氧菌m5以接种量5%v/v接种到发酵培养基中，55℃、120rpm发酵48h，每隔12h调节ph至7.5，得到发酵液；

发酵培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，5g/l酵母粉，2.5g/l玉米浆干粉，0.5g/lmgcl2·6h2o,0.3g/lnh4cl,0.3g/lkcl,0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，溶剂为水，ph7.5，通氮气10～20min，121℃灭菌15min；设置三组发酵培养基，其中木聚糖浓度分别为30g/l，60g/l，90g/l；

（3）将产琥珀酸放线杆菌以接种量5%v/v接种到产琥珀酸放线杆菌的活化培养基中，37℃、150rpm活化12-24h；

活化培养基配方为：1g/lnacl，0.75g/lk2hpo4，0.75g/lkh2po4，3g/l酵母粉，0.5g/lmgcl2·6h2o，0.3g/lnh4cl，0.015g/lcacl2·2h2o，1.5g/lfecl2·4h2o，0.3g/lkcl，木糖60g/l，加入50g/l碱式碳酸镁，溶剂为水；

（4）以混合时间为72h为例，将活化好的产琥珀酸放线杆菌以10%v/v接种到步骤（2）得到的发酵液中，37℃，150rpm发酵72h。

培养过程中，每隔12h取样测定其丁二酸产量。当木聚糖浓度60g/l时，混菌发酵得到的丁二酸浓度最高，达到了15.80g/l；当木聚糖浓度为30g/l时，混菌发酵得到的丁二酸浓度仅有6.28g/l；当90g/l木聚糖浓度时的丁二酸浓度为17.69g/l，但从经济性来考虑，最终选择60g/l木聚糖作为底物浓度。

实施例2产琥珀酸放线杆菌actinobacillussuccinogenes130z不同接种方法对丁二酸产量的影响

方法同实施例1，不同的是发酵培养基中木聚糖的浓度为60g/l，步骤（3）活化好的产琥珀酸放线杆菌放入4℃离心机离心，转速为6000rpm、10min，然后将上清倒掉，将菌泥加入步骤（2）的发酵液中，其中活化好的产琥珀酸放线杆菌培养液的体积与发酵液的体积相同；然后37℃继续培养，转速150rpm，每隔12h调节ph至6.8，发酵72h；

培养过程中，每隔12h取样并测定其丁二酸产量。当以实施例1的接种方式混合时，丁二酸最高产量仅有15.80g/l；当以本实施例的接种方式混合时，丁二酸产量达到了30.28g/l；故采用本实施例的接种方式更优。

实施例3混菌体系培养基中不同的碱式碳酸镁浓度对最终丁二酸产量的影响

方法同实施例2，其中木聚糖浓度为60g/l，接种方法是离心，不同的是步骤（3）中设置7组实验，每组碱式碳酸镁浓度分别为40g/l，45g/l，50g/l，55g/l，60g/l，65g/l，70g/l。

培养过程中，每隔12h取样并测定其丁二酸产量。当碱式碳酸镁浓度达到65g/l时，丁二酸产量最高，达到36.28g/l。当碱式碳酸镁浓度提高时，其镁离子浓度以及培养基ph对其混菌体系具有很大影响。热解糖高温厌氧菌最适ph为7.5，产琥珀酸放线杆菌最适ph为6.8，通过优化碱式碳酸镁浓度可以对混菌体系ph进行最优的调控。而镁离子作为微量金属离子，也可一定程度上提高产琥珀酸放线杆菌到丁二酸的代谢。而热解糖高温厌氧菌由于也能使用其降解木聚糖而得到的木糖，所以可通过提高镁离子浓度（热解糖高温厌氧菌在提高镁离子浓度后几乎不能生长）和降低发酵温度（接入产琥珀酸放线杆菌后发酵温度为37℃），使其在混菌后不能生长，而其分泌出来的木聚糖酶依然可以在发酵液中稳定存在。

实施例4产琥珀酸放线杆菌不同的接种时间对最终丁二酸产量的影响

方法同实施例3，其中木聚糖浓度为60g/l，接种方式为离心，碱式碳酸镁浓度为65g/l；不同的是步骤（2）中设置5组实验，发酵时间分别为24h，48h，72h，96h，120h。

培养过程中，每隔12h取样并测定其丁二酸产量。当热解糖高温厌氧菌m5培养了48h时加入产琥珀酸放线杆菌菌泥，丁二酸产量最高，达到43.10g/l，见图1、图2。在此体系中，菌株m5分泌的木聚糖酶有效地降解了木聚糖，并得到约20g/l的木糖，此后，在混菌体系中，木聚糖酶和木二糖酶仍具有较高的酶活，能够源源不断降解木聚糖为木糖，而产琥珀酸放线杆菌可以利用降解得到的木糖生产丁二酸。接种时间过早（24h），木聚糖酶活较低，不利用后续木聚糖的降解，而接种过晚（72-120h），则会导致菌株m5培养时间过长，木聚糖酶和木二糖酶分泌量减少，而先前分泌出的酶在55℃下的酶活下降，从而导致酶系的酶活下降，且部分降解得到的木糖也被菌株m5利用，从而减少了产琥珀酸放线杆菌的碳流量，最终导致丁二酸产量降低。

实验证明产琥珀酸放线杆菌单菌无法利用木聚糖进行发酵，而其直接利用60g/l木糖进行单菌发酵时，丁二酸产量为39.03g/l，其收率为65%；而使用混菌体系时，60g/l木聚糖可生产43.10g/l丁二酸，其收率为72%。混菌体系是一种不需要进行复杂的dna体外重组却可取得类似效果的新型发酵技术，其不仅降低了工业生产丁二酸的底物成本，而且可一定程度上提高丁二酸收率。