本发明属于兽用生物制品生产工艺领域，尤其是菌液灭活工艺领域。
背景技术：
：鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种鸡急性上呼吸道传染病。该病单独发生时，可引起蛋鸡产蛋量下降，育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，死亡率一般不高，但与鸡毒支原体病、鸡痘、传染性支气管炎、传染性喉气管炎并发时，会使症状加重、病程延长和死亡率增加，肉鸡发生该病时会引起严重的肉质下降，死淘率增加，造成很大的经济损失。目前，对于鸡传染性鼻炎的防治主要采取药物或疫苗免疫两种方法，其中药物疗法存在许多弊病，因为药物的原形或其代谢产物及有关杂质可能蓄积、残留在动物的组织、器官或食用产品中，这样便造成了兽药在动物性食品中的残留，对人体造成严重的危害。所以当前治疗鸡传染性鼻炎的副鸡禽杆菌疫苗仍是首选。在疫苗生产过程中，灭活无疑是最重要的环节之一，兽用生物制品生产中的灭活是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性，目前最常见的副鸡禽杆菌的灭活工艺可以概括为：先加入灭活剂，再加入菌液，2-8℃灭活，周期为5-10天，常用灭活剂包括甲醛、硫柳汞等；通常情况下，甲醛作为灭火剂具有破坏免疫原性，高度致癌性等缺点，硫柳汞中的汞属于重金属，长期使用会造成汞富集，存在重金属中毒风险。其他的灭活剂剂量虽然不高，但也有残留的风险，和药物疗法一样也会有损人类的健康。技术实现要素：本发明的目的还在于解决了因加入灭活剂后对疫苗安全性和在动物体内灭活剂残留的问题。本发明的目的在于提供了一种新型菌液灭活工艺，以解决现有技术中副鸡禽杆菌菌液的灭活周期长的技术问题。为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：一种副鸡禽杆菌发酵菌液灭活方法，其具体步骤为：收集培养的副鸡禽杆菌并重悬得到重悬液，将重悬液置50℃-65℃环境中恒温灭活；恒温灭活后的重悬液置于低温环境中不低于24h。进一步的，所述的生理盐溶液为生理盐水或磷酸盐缓冲液；进一步的，所述的高温灭活是指将重悬液置于60℃-65℃环境中恒温灭活；进一步的，所述的高温灭活是指在60℃-65℃的环境下水浴恒温灭活。进一步的，所述的60℃-65℃环境恒温的灭活过程中需要震荡混匀；进一步的，所述的60℃-65℃环境恒温的灭活时间为30-45分钟。进一步的，所述的低温静置的低温环境为2-8℃。进一步的，所述的低温静置时长为24-96h。更进一步的，所述的低温静置时长为72h。采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：1.用高温灭活配合低温放置的工艺代替引入灭活剂的工艺，克服了现有技术中出现灭活剂残留的问题，提高了灭活疫苗的安全性，降低了副鸡禽杆菌灭活工艺的成本。2.选择先高温灭活再低温放置的工艺有效的提高了副鸡禽杆菌疫苗的免疫活力。具体实施方式以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。实施例1：菌液灭活工艺的研究菌种：副鸡禽杆菌a型c-hpg-8株，由天津瑞普生物技术股份有限公司空港经济区分公司提供。培养基：半合成培养基、鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂，配方参照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》，由本公司实验室自制。灭活用菌液：根据规程，将培养后菌液用离心机离心后，再用磷酸盐缓冲液制成悬浮液后，经推算每毫升浓缩液中含100亿菌体。以上菌液为100ml。1.将以上菌液分成3份分别放入45℃、50℃、60℃、65℃水浴锅中灭活，期间需要震荡混匀。每个温度分别在15分钟、30分钟、45分钟取200μl样本进行灭活检验。结果如下：表1不同灭活时间和温度灭活效果灭活温度45℃50℃60℃65℃15分钟++++30分钟++11cfu/0.2ml2cfu/0.2ml45分钟+64cfu/0.2ml--+：表示未完全灭活且平板上菌落数量高于300cfu。-：表示完全灭活结果表明，在60-65℃灭活30分钟，副鸡禽杆菌可被完全灭活。2.将50℃，灭活45分钟的菌液置于2-8℃冰箱，每天取样进行灭活检验，最多检验7天。结果如下：表22-8℃不同时间灭活效果放置时间24小时48小时72小时96小时灭活效果----结果表明，在2-8℃放置24小时后，热灭活时少量未灭活菌液即可完全灭活。3.不同灭活工艺对抗原活力的影响菌种：副鸡禽杆菌c型hpg-668株，由天津瑞普生物技术股份有限公司空港经济区分公司提供。培养基：半合成培养基、鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂，配方参照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》，由本公司实验室自制。灭活用菌液：根据规程，将培养后菌液用离心机离心后，再用磷酸盐缓冲液制成悬浮液后，经推算每毫升浓缩液中含c型菌浓度分别为96亿菌体。以上浓缩菌液体积分别为6l。实验动物：28日龄spf鸡，购于北京维通利华公司。将c型菌液分为两份分别通过传统灭活方法(参照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》)和本发明方法。本方法为将3l菌液置于65℃灭活罐中进行灭活。从罐内温度升至设定温度开始计时，灭活60分钟，而后将灭活好的抗原放入2-8℃冷库，静置72小时后进行灭活检验。灭活检验结果合格。按照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》将两种灭活方法的抗原分别配制成疫苗，对实验动物进行免疫。免疫时间分别为21天、28天、35天、42天、49天、8周；取两种方式不同免疫时间免疫后的血清，进行血凝抑制试验检测，得出的结果如下表所示：表3.不同灭活方式的血凝抑制试验检测结果免疫天数21天28天35天42天49天8周传统方式25.198428.674834.822026.390122.97397.08785热灭活方式40.000053.0986105.560113.13798.491556.5685结果表明热灭活方式不但没有影响该菌的活力，反而明显高于传统灭活方式的抗体水平。4.不同灭活工艺对抗原免疫性的影响菌种：副鸡禽杆菌c型hpg-668株，由天津瑞普生物技术股份有限公司空港经济区分公司提供。培养基：半合成培养基、鸡肉汤培养基、鸡肉汤琼脂，配方参照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》，由本公司实验室自制。灭活用菌液：根据规程，将培养后菌液用离心机离心后，再用磷酸盐缓冲液制成悬浮液后，经推算每毫升浓缩液中含c型菌浓度分别为96亿菌体。以上浓缩菌液体积分别为6l。实验动物：28日龄spf鸡，购于北京维通利华公司。将c型菌液分为两份分别通过传统灭活方法(参照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》)和本发明方法。本方法为将3l菌液置于65℃灭活罐中进行灭活。从罐内温度升至设定温度开始计时，灭活60分钟，而后将灭活好的抗原放入2-8℃冷库，静置72小时后进行灭活检验。灭活检验结果合格。按照《鸡传染性鼻炎灭活疫苗制造及检验规程》将两种灭活方法的抗原分别配制成疫苗，对其疫苗安全性和效力进行检验。结果如下：表4疫苗对试验鸡安全检验及效力检验结果当前第1页12