铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原PA5505的纯化方法与流程

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法。

背景技术：

pa是临床上最为常见的条件致病菌之一，在临床感染的革兰阴性菌中居首位，目前已成为全球icu病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一(horinot等,internmed，2012)。pa感染可发生在人体任何部位和组织，常见于烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道，也可引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症。其感染可有单一性，也有混合性，机制复杂。近年来，pa院内感染尤其是肺部感染的发病率不断增加，严重感染尤其是呼吸机相关性肺炎患者和败血症患者死亡率居高不下。临床上主要采用抗生素对pa感染进行治疗，但由于抗生素滥用等原因，pa耐药性日趋严峻，耐药菌株不断涌现，给临床治疗带来了极大挑战。chinet资料显示，2013年pa对亚胺培南和美罗培南的年度耐药率分别为29.1％和27.1％，而hap检出标本对二者的耐药率分别高达70.7％和48.8％。基于此，疫苗和治疗学抗体等非抗生素治疗手段越来越引起人们的重视。pa5505是本室前期通过反向疫苗学技术从pa全基因组中筛选得到的免疫优势抗原之一，在动物试验中表现出了良好的免疫原性和保护效果，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答，并有效降低肺组织细菌的定植，有利于铜绿假单胞菌感染的预防和治疗，可作为pa疫苗研发的候选抗原。

现有技术存在的问题是：pa5505为假定蛋白，结构和功能未知，也未有任何文献对其进行报导，更没有针对该重组蛋白纯化方法的研究。解决上述技术问题的难度和意义：pa5505为一个全新的蛋白，理化性质不清楚，没有成熟的纯化工艺流程进行参考，需要根据经验摸索该蛋白的纯化工艺。通过本发明的技术，实现了对pa5505的分离纯化，得到了高纯度的目的蛋白，使得深入研究该蛋白的理化性质，评价其免疫保护功能和机制成为了可能，并为蛋白生产工艺的建立奠定了基础。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法。

本发明是这样实现的，一种重组工程菌pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue，所述重组工程菌pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue表达抗原pa5505的核酸序列如seqidno：1所示、氨基酸序列如seqidno：2所示。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述重组工程菌pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法包括：收集表达pa5505的基因工程菌；按照高压破菌、离心，gst亲和纯化；sphp层析纯化，qhp层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。

进一步，所述铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法具体包括：

1)高压破菌

收集表达pa5505的基因工程菌，用ph为7.0-7.5的pbs缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2)gst亲和纯化

gst亲和层析填料进行初步纯化，采用pbs洗脱杂蛋白后，用prescissionprotease酶酶切洗脱目标蛋白，酶切和洗脱缓冲液为a液；

3)sphp层析纯化

经步骤2)收集的目标蛋白，用b液平衡层析系统及sphp层析柱后上样，c液线性梯度洗脱；

4)qhp层析纯化

将经步骤3)纯化的标蛋白，d液平衡层析系统及qhp层析柱后上样，去除痕量非目标蛋白、内毒素等杂质，获得目标蛋白；

其中，a液为ph值7.0-7.5的20mmna2hpo4-nah2po4缓冲溶液，b液为ph6.0的10mmhistidine缓冲溶液，c液为ph6.0的10mmhistidine，1mnacl缓冲溶液，d液为ph6.0的10mmhistidine，0.9％nacl缓冲溶液，pbs缓冲液为a液加入150mmnacl。

进一步，所述步骤1)所述的高压匀浆破菌采用60-80mpa压力，破菌后高速离心获取破菌上清。

进一步，所述步骤2)的gst亲和层析使用的填料为glutathionesepharose4b或glutathionesepharose4ff或glutathionesepharosehp。

进一步，所述步骤2)的prescissionprotease酶带有gst标签。

进一步，所述步骤3)的sphp层析柱的填料为spsepharosehp或spsepharoseff或captosp。

进一步，所述步骤4)的qhp层析柱的填料为qsepharosehp或qsepharoseff或captoq。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：通过大肠杆菌基因工程菌表达获得了pa疫苗候选抗原pa5505，采用本发明中的工艺流程纯化得到了高纯度的目的蛋白。所述重组蛋白经动物试验证明，可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用，有利于铜绿假单胞菌的预防、诊断和治疗。目前，尚未见针对该重组蛋白pa5505纯化方法的报道，本发明主要对pa5505的制备工艺进行介绍。

采用本发明所述的纯化方法，从表达铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的大肠杆菌工程菌中可以获得纯度大于97％，回收率大于40％的目的蛋白，通过氨基酸序列预测本发明人构建获得的蛋白pa5505分子质量约为26.0kd，等电点在ph6.5左右。

本发明所述的纯化方法主要包括gst亲和纯化、sphp层析、qhp层析，通过上述方法纯化的蛋白用12％sds-page检测，呈现出单一目标蛋白条带，分子质量约为26kd。hplcc3柱分析目的蛋白纯度98.5％。纯化后的pa5505经al(oh)3佐剂吸附后注射免疫balb/c小鼠，发现免疫血清中的igg水平显著高于阴性对照组(pbs组)(p<0.01)，证明使用本发明纯化方法获得的pa5505可有效刺激机体产生高效的免疫应答。使用临床株xn-1(cctccm2015730)感染，计算得pa5505抗pa感染的保护率为70.3％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的重组质粒pgex-6p-2-pa5505的双酶切鉴定结果示意图；

图中：泳道1：核酸(dna)分子量标准(marker)，从上到下大小分别为：4500、3000、2000、1200、800、500、200bp；泳道2～6：重组表达质粒pgex-6p-2-pa5505经酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段约4000bp和约720bp。

图3是本发明实施例提供的蛋白pa5505诱导鉴定结果示意图；

图中：泳道1：蛋白分子量标准(marker)，从上到下大小分别为：130kda、100kda、70kda、55kda、40kda、35kda、25kda、15kda、10kda；泳道2：结合诱导表达的超声上清的gst填料；泳道3：经pp酶酶切后的上清；泳道4：经pp酶酶切后的gst填料。

图4是本发明实施例提供的gst亲和层析、pp酶酶切及sphp层析纯化pa5505的sds-page结果示意图；

图中，泳道m:蛋白分子量marker；泳道1：破菌上清；泳道2：蛋白与gst亲和填料结合；泳道3：pp酶酶切后洗脱样本；泳道4：sphp洗脱样品；泳道5：pp酶酶切后gst亲和填料。

图5是本发明实施例提供的sphp层析图。

图6是本发明实施例提供的qhp层析图。

图7是本发明实施例提供的qhp层析后sds-page结果示意图；

图中，泳道m:蛋白分子量marker；泳道1和2为qhp流穿样品。

图8是本发明实施例提供的pa5505蛋白hplc检测结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对尚未见针对该重组蛋白pa5505纯化方法的报道的问题；本发明纯化方法获得的pa5505可有效刺激机体产生高效的免疫应答。使用临床株xn-1(cctccm2015730)感染，计算得pa5505抗pa感染的保护率为70.3％。质粒pgex-6p-2购自gehealthcarelifesciences公司；大肠杆菌菌株xl-1blue购自上海超研生物科技有限公司；重组工程菌中的插入片段pa5505在ncbi中的gi:15600698，proteinaccession:np_254192.1，该蛋白全长260个氨基酸。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505，该抗原的核酸序列如seqidno：1所示、氨基酸序列如seqidno：2所示。

如图1所示，本发明实施例提供的铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法包括以下步骤：

s101：收集表达pa5505的基因工程菌；

s102：按照高压破菌、离心；

s103：gst亲和纯化；

s104：sphp层析纯化；

s105：qhp层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

菌株与各种试剂如下：

1.铜绿假单胞菌菌株

铜绿假单胞菌国际标准株pao1从美国atcc购买(baa-47^tm)；

2.试剂

质粒pgex-6p-2、glutathionesepharose4b、spsepharosehp、sephadexg-25medium、qsepharosehp等填料购自gehealthcarelifesciences公司，申请人保存；

大肠杆菌菌株xl-1blue购自上海超研生物科技有限公司，申请人保存；

na2hpo4.12h2o、nah2po4.2h2o、nacl、naoh、tween-20、nahco3，na2co3购自国药集团化学试剂有限公司；

pbs、hrp标记的羊抗小鼠igg抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；

tryptone、yeastextract均购自英国oxoid公司；

ampicilline、0.9％氯化钠注射液购自太极集团西南药业；

琼脂粉、iptg、l-组氨酸、购自生工生物工程(上海)股份有限公司；

蛋白上样缓冲液购于碧云天生物技术；蛋白marker购于thermo公司；

tfa、乙腈购自tedia公司；

al(oh)3购自brenntage公司；

tris购自angus公司；

硫酸、盐酸购自成都科龙化工试剂厂；

牛血清白蛋白v购自biosharp公司；

异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

实施例1：重组工程菌pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue的构建

根据pa5505的编码序列设计上下游引物，采用pcr扩增得到目的序列，将目的序列和pgex-6p-2载体经bamh1和xho1双酶切后采用t4连接酶进行连接，得到重组质粒pgex-6p-2-pa5505(图2为重组质粒双酶切鉴定结果)。将上述重组质粒转化感受态大肠杆菌xl-1blue，得到重组工程菌pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue。

实施例2：pa5505的表达及酶切鉴定

取保存在4℃冰箱中备用的pgex-6p-2-pa5505/xl-1blue菌液200μl加入到20ml含amp抗性的lb培养基中进行一次活化，200rpm37℃培养5～6h后，加入终浓度为200μm的iptg置于16℃摇床中诱导过夜，诱导结束后5000rpm离心10min收集菌体，再加1.5mlpbs重悬菌体后，将菌液进行超声裂解2min(200v)，收集上清与40μl用于结合gst融合蛋白的glutathionesepharose4b(ge公司)凝胶珠(beads)结合处理，结合条件为4℃结合3h；结合结束后采用pbs洗脱未结合的杂蛋白3次，然后将用40μlpbs重悬填料后取40μl用于电泳。向余下约40μl已结合蛋白的glutathionesepharose4b中加入5μlprescissionprotease(pp酶，ge公司)，室温酶切2h后，离心吸取上清后，用pbs洗涤填料3次，各取20μl样品变性处理后进行蛋白电泳(方法同上)，在呈相系统下观察结果，酶切下来的pa5505蛋白分子量～26kda，与预期蛋白分子量大小相符合，见图3。

实施例3pa5505的纯化工艺研究

通过对pa5505的纯化条件进行摸索，最终确定了该蛋白纯化的工艺流程，如图1所示，具体操作如下。

1.高压破菌、离心

将上述表达pa5505的大肠杆菌工程菌，通过高密度发酵，离心收集菌体备用。

取菌体300g左右，按重量：体积比1：5比例以pbs缓冲液混匀悬浮，4℃预冷。

高压匀浆机：使用蒸馏水冲洗高压匀浆机管道，低温循环系统开启预冷至1-4℃备用。

预冷的悬浮菌液加入高压匀浆机，压力维持在60-80mpa破菌3-5次，取破菌液涂片结晶紫染色，油镜每个视野下未破碎菌小于1-2个视为破菌完全。

高速离心：破菌后的液体装入离心桶，4℃，10,000-15,000g离心15-30min，收集上清备用。

2.gst亲和纯化

选择gst亲和层析填料进行初步纯化，gst亲和填料为glutathionesepharose4b、glutathionesepharose4ff、glutathionesepharosehp之一，破菌菌体湿重每100g填料用量为100ml。

prescissionprotease酶(pp酶)进行酶切洗脱：所使用的pp酶带有gst标签，以利于去除pp酶，获取目的蛋白，酶切缓冲液为a液(20mmna2hpo4-nah2po4，phph7.0-7.5)。电泳结果如图4所示。经过gst初纯，目的蛋白的纯度已达到90％以上，但仍有待提高，除去痕量杂质。

3.sphp层析纯化

收集gst亲和层析的样品，使用b液(10mmhistidine，ph6.0)平衡层析系统及sphp层析柱，c液(10mmhistidine，1mnacl,ph6.0)线性梯度洗脱,设定洗脱流速10ml/min，洗脱梯度为b％从0到100％，洗脱体积为500ml，收集洗脱下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图5所示，电泳结果如图4所示。

4.qhp层析纯化

将上述sphp纯化获得的样品，采用d液(10mmhistidine，0.9％nacl，ph6.0)平衡层析系统及qhp层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，收集流穿下来的目的蛋白保存在4℃备用。层析图如图6所示，电泳结果如图7所示。

6.hplc检测

使用c3(购自agilent公司)对pa5505蛋白进行纯度检测，用0.1％tfa水溶液平衡柱子，上样10ul样品，0.1％tfa乙腈溶液洗脱，设定柱温60℃，流速0.5ml/min。洗脱程序为：10％～100％b，30min，通过曲线测出pa5505蛋白的纯度为98.5％，层析图如图8所示。

其中，0.1％tfa水溶液的配制：1li级水加1mltfa混匀，0.22μm滤膜过滤。

0.1％tfa乙腈溶液的配制：1l乙腈加1mltfa混匀。

纯化后的抗原，做以下实验：

实施例5免疫动物

疫苗的制备：采用pbs稀释pa5505蛋白抗原，加入浓度为al(oh)3佐剂对抗原进行吸附，最终的疫苗成品中抗原浓度为0.5mg/ml，铝含量为0.7mg/ml；

免疫方法：将雌性balb/c小鼠随机分为3组，每组30只，实验组采用上述疫苗通过肌肉注射(股四头肌)的方式对小鼠进行免疫，每只小鼠注射量为100μl，对照组采用100μl的pbs和al(oh)3佐剂分别进行免疫，免疫方案为d0，d14，d21三次免疫。

实施例6抗体的检测

第三次免疫后第7天和第14天，采集balb/c小鼠的尾静脉血，用elisa检测免疫后小鼠血清中特异性igg抗体水平。

1.制备液体

(1)包被液：在电子天平上称取na2co31.6g，nahco32.9g，nan30.2g，加蒸馏水500ml，调至ph9.6，蒸馏水定容至1000ml，批次设置为当日配制时间，标识：包被液。

(2)抗体稀释液：在电子天平上称取nacl8g，kh2po40.2g，na2hpo4·12h2o2.9g，kcl0.2g，tween200.5ml，调至ph7.4，加蒸馏水定容至1000ml，批次设置为当日配制时间，标识：抗体稀释液。

(3)洗涤液：0.05％tween20-pbs(ph7.4)，取规格为1000ml/袋pbs1袋溶于1000ml纯水中，加入0.5mltween20。

(4)封闭液：现配现用，量取适量体积的抗体稀释液，按1％的比例加入bsa，4℃放置备用。

(5)终止液：2mol/l硫酸，用移液枪吸取(18mol/l)h2so4111ml至889mlddh2o中。

2.elisa检测pa5505重组蛋白免疫小鼠产生的抗体效价

1)包被：用包被液将纯化后的pa5505重组蛋白稀释为2μg/ml。200μl/孔加入酶标板，4℃过夜后用洗涤液洗涤3遍，空干后用保鲜膜包上，置于4℃冰箱中备用；

2)封闭：酶标板加封闭液100μl/孔，置于37℃孵育箱中2小时，洗涤3遍；

3)将血清进行1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000等倍比稀释；取封闭好的酶标板，依次加入稀释血清，100μl/孔，,置于37℃孵育箱30min，洗涤3遍，空干；

4)100μl/孔加入hrp标记的羊抗小鼠igg抗体(1:5000稀释)，，置于37℃孵育箱1h，洗涤三遍，空干；

5)加入底物显色液(tmb)100μl/孔，室温避光反应5min；

6)加入终止液(2mh2so4)，立即置于酶标仪上以450nm波长处测定od值；

7)结果判断：a样品/a阴性值≧2.1为阳性(阴性对照为小鼠免疫前血清1:1000倍稀释)。

结果：pa5505蛋白抗原免疫小鼠产生的抗体效价几何平均滴度为1:47200；末次免疫后第7天的抗体阳性率达到100％，说明本发明构建的sbp重组蛋白具有良好的免疫原性。

实施例7pa5505免疫后攻毒保护效果评价

pa5505重组蛋白动物免疫的攻毒保护评价按照参考文献：gaochen等clinimmunol2017,183,354-363进行。pa5505末次免疫后10～14天，用生理盐水将准备paxn-1菌液并调节浓度至1.5×1010cfu/ml，用异氟烷麻醉小鼠后采用滴鼻的方式感染，每只小鼠感染量为20μl，采用同样剂量的生理盐水(ns)作为空白对照。感染结束后每隔1天观察小鼠死亡情况，观察周期为7天，观察期结束后剩余动物以co2吸入法安乐处死。统计各组小鼠的存活率。结果示于表1。

表1pa5505重组蛋白免疫小鼠后的攻毒保护效果

表1显示：阴性对照组和空白对照组的存活率为分别为16.7％和10.0％，重组融合蛋白pa5505加al(oh)3佐剂组的存活率为73.3％，通过公式计算得到pa5505的保护率为70.3％。因此，本发明的pa5505重组蛋白具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生免疫应答，并且能够对paxn-1的感染起到保护作用，可以辅以铝佐剂制备亚单位疫苗用于预防铜绿假单胞菌的感染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>重庆艾力彼生物科技有限公司

<120>铜绿假单胞菌基因工程疫苗候选抗原pa5505的纯化方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>717

<212>dna

<213>铜绿假单胞菌标准株pao1(pseudomonasaeruginosapao1)

<400>1

gccgagtccctcaccgtcgcggccaccccggtgccgcacgcggagatcctcaacgtggtc60

aagccgctgctggccaaggaaggcgtggacctgaagatcaaggagttcaccgactacgtg120

cagccgaacgtgcaggtctcggaaaagcgcctggacgccaacttcttccagcaccagccg180

tacctcgatgagttcaacaaggccaagggcaccgacctggtcgccgtgaccggcgtacac240

atcgagccgctgggcgcctactcgagcaagtacaagaagctcgacgaactgccttccggc300

gctaccgtggtgattcccaacgacgccaccaacggcggccgcgccctgctcctgctggac360

aaggccggggtgatcaagctcaaggacaacaagagcatcaccgccacgccgaaggacatc420

gtcgacaatccgaagaacatcaagatccgcgaactggaagccgcgaccctgccgcgcgtg480

ctgacccaggtcgacatggcgctgatcaataccaactacgccctggaagccaagctgaac540

ccaaccaaggatgcgctggccatcgaaggcagcgactcgccctacgtgaacatcctcgtc600

gcgcggccggacaacaaggacagcgacgccatgcagaagctggccaaggccctgcacagc660

gccgagatcaagcagttcatccaggagaagtacaaaggcgcggtggtaccggcgttc717

<210>2

<211>239

<212>prt

<213>铜绿假单胞菌标准株pao1(pseudomonasaeruginosapao1)

<400>2

alagluserleuthrvalalaalathrprovalprohisalagluile

151015

leuasnvalvallysproleuleualalysgluglyvalaspleulys

202530

ilelysgluphethrasptyrvalglnproasnvalglnvalserglu

354045

lysargleuaspalaasnphepheglnhisglnprotyrleuaspglu

505560

pheasnlysalalysglythraspleuvalalavalthrglyvalhis

65707580

ilegluproleuglyalatyrserserlystyrlyslysleuaspglu

859095

leuproserglyalathrvalvalileproasnaspalathrasngly

100105110

glyargalaleuleuleuleuasplysalaglyvalilelysleulys

115120125

aspasnlysserilethralathrprolysaspilevalaspasnpro

130135140

lysasnilelysilearggluleuglualaalathrleuproargval

145150155160

leuthrglnvalaspmetalaleuileasnthrasntyralaleuglu

165170175

alalysleuasnprothrlysaspalaleualailegluglyserasp

180185190

serprotyrvalasnileleuvalalaargproaspasnlysaspser

195200205

aspalametglnlysleualalysalaleuhisseralagluilelys

210215220

glnpheileglnglulystyrlysglyalavalvalproalaphe

225230235