一株具有溶藻能力的交替单胞菌及其对东海原甲藻的应用的制作方法

本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一株具有溶藻能力的交替单胞菌及其应用。

背景技术：

近二十年来，随着我国沿海城市化进程的不断推进，沿海工业、农业、养殖业和旅游业得到迅速发展，同时也导致了近海富营养化的日趋加剧，由此引发的有害藻华发生频率和规模也呈现明显增加趋势。甲藻是形成有毒有害赤潮的主要种群，其中东海原甲藻是我国赤潮爆发最重要的原因种。近年来，随着全球气候和近海环境的近一步恶化，特别是近海富营养化加剧和海水中二氧化碳浓度和水温的增加，致使我国近海海域每年都爆发东海原甲藻大规模赤潮，已成为我国影响面积最大的赤潮物种，给我国近海海洋生态系统造成破坏性影响。因此，开展东海原甲藻赤潮的防控研究尤为迫切和必要。

对于赤潮的控制目前主要有物理法、化学法和生物法。物理方法虽然见效很快并且不会对生态环境造成危害，但是极有可能对底栖生物造成负面影响，并且无法从根本上治理赤潮。化学方法是目前相较之下最有效的方法，但是它容易对环境造成二次污染，无法针对性的只对赤潮生物产生影响，会在杀死赤潮生物的同时对非赤潮生物也造成一定程度上的伤害。溶藻微生物由于直接分离于目标水体，具有生态安全性好、除藻效果稳定、高效等特点，近年来逐渐被应用与水华防治生物制剂的开发与研究领域。同时也有研究人员结合传统除藻剂与溶藻微生物制剂的优点，开发出新型的溶藻制剂。通过高效溶藻细菌的分离、鉴定，并最终开发经济、高效、安全的溶藻细菌菌剂已成为控制赤潮问题的新思路。然而目前尚未有高效杀灭东海原甲藻的溶藻菌及菌剂报道。

技术实现要素：

鉴于东海原甲藻带来的严重生态破坏性以及目前物理方法和化学方法防控东海原甲藻的严重缺陷，本发明的目的是提供一株具有溶藻能力的交替单胞菌及其应用，并做成菌粉用于东海原甲藻赤潮的控制。

为实现上述目的采用以下技术方案：

一株具有溶藻能力的交替单胞菌，为交替单胞菌(alteromonasmacleodii)fdhy-03，已于2018年12月14日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctccno：m2018895，地址为武汉武汉大学。

所述的交替单胞菌，菌种生物学特征如下：杆状，单个，革兰氏染色呈阴性，菌落形态为圆形，不透明，菌落呈米白色，表面光滑湿润，挑起为粘稠状，芽孢染色、甲基红（mr）、v-p测定、脲酶、柠檬酸盐、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，接触酶、淀粉水解、葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇反应为阳性。

所述的具有溶藻能力的交替单胞菌的培养方法，包括以下步骤：

（1）菌种：采用所述的交替单胞菌fdhy-03；

（2）斜面培养：将步骤（1）中的菌种接种于固体斜面培养基上，在28℃条件下培养24小时；

（3）初级培养：无菌条件下取培养好的斜面，用接种环取一环于50ml液体培养基中，28℃，摇床200rpm培养24小时，获得初级培养菌液；

（4）扩大培养：将初级培养菌液接种于500ml液体培养基中，接种量为5%，28℃，摇床200rpm培养24小时，获得扩大培养菌液；

（5）发酵培养：将扩大培养的菌液接种于2000ml发酵液中，接种量为5%，28℃，200rpm培养60小时后，收集发酵液。

步骤（3）和（4）中所述的液体培养基配方为：蛋白胨5g/l、酵母提取物1g/l、磷酸高铁0.1g/l、海盐30g/l，调节ph至7.5，121℃高温蒸汽灭菌20min；步骤（2）所述固体斜面培养基为上述液体培养基中添加终浓度1.5wt.%的琼脂粉；步骤（5）中所述发酵液配方为上述液体培养基加入终浓度为甘露醇1.5wt.%，酵母粉1wt.%，ph值调至7.5。

同时还提供包含所述交替单胞菌的溶藻菌剂及菌粉剂。菌粉剂为向所述的菌剂中加入灭菌后的锯末，锯末质量分数10-15%，吸附6小时后冷冻干燥得到菌粉剂。

所述交替单胞菌在溶解藻类中的应用，所述藻类包括东海原甲藻(prorocentrumdonghaiense)、赤潮异弯藻（heterosigmaakashiwo）、强壮前沟藻（amphidiniumcarteraehulburt）、伊姆裸甲藻（gymnodiniumimpudicum）、亚历山大藻（alexandriumtamarense）、中肋骨条藻（skeletonemacostatum）。

本发明提供了上述交替单胞菌fdhy-03在控制东海原甲藻赤潮中的应用。

上述应用，可将溶藻菌粉剂用无纺布过滤袋包裹，应用于东海原甲藻的溶藻，溶藻菌袋可回收并重复利用于东海原甲藻的溶藻。

本发明的主要效果及优点是：

1、菌种筛选方法简单、容易培养。所筛选的交替单胞菌fdhy-03溶藻效果好，具有光谱溶藻性能，尤其是对东海原甲藻等具壳甲藻具有很强的溶藻效果。细菌发酵液对东海原甲藻的溶藻性能在24小时内达到90%以上。是国内外报道的少数几个高溶藻性细菌之一。

2、用交替单胞菌fdhy-03制成的菌粉溶藻率高、可重复利用，经三次重复利用后48小时溶藻效率没有显著变化。

3、交替单胞菌fdhy-03来源于海洋环境，对环境友好，使用过程中不会造成二次污染，在控制东海原甲藻赤潮方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为交替单胞菌fdhy-03对东海原甲藻的溶藻效果图。

图2为交替单胞菌fdhy-03对东海原甲藻的溶藻显微图。

图3为交替单胞菌fdhy-03菌液、菌细胞及代谢物在24小时处理后的溶藻率。

图4为交替单胞菌fdhy-03菌粉回收利用溶藻效率。

具体实施方式

实施例1溶藻细菌的筛选

在福建霞浦一次东海原甲藻赤潮事件后期，采取表层海水水样，将海水样品通过平板划线的方式接种到2216e固体培养基上，28℃培养48小时。将长出的各个单菌落接种在1ml的2216e液体培养基中，28℃、200rpm培养24小时，取0.5ml菌液接种到10ml处于经过无菌处理的对数生长期东海原甲藻藻液中，48小时后，使藻液呈现黄化的菌株认为是溶藻菌。选取了其中溶藻效果最好的一株细菌进行进一步研究，并将该株细菌代号为fdhy-03。

东海原甲藻培养条件：东海原甲藻（prorocentrumdonghaienselu）用l1培养基进行培养，培养于20℃光照培养箱中，光照强度100μmolphotons·m⁻²·s−1，光暗周期14h:10h（光：暗）。

溶藻效率计算方法：溶藻效率（%）=（1-实验组藻细胞浓度/对照组藻细胞浓度）×100%。其中东海原甲藻的藻细胞浓度用0.1ml水样计数板通过显微镜计数。

实施例2交替单胞菌fdhy-03菌株鉴定

对fdhy-03菌株进行形态观察、生理生化反应、染色以及糖发酵实验，结果显示fdhy-03细菌有如下生物学特征：杆状，单个，革兰氏染色呈阴性，菌落形态为圆形，不透明，菌落呈米白色，表面光滑湿润，挑起为粘稠状，芽孢染色、甲基红（mr）、v-p测定、脲酶、柠檬酸盐、苯丙氨酸脱氨酶反应为阴性，接触酶、淀粉水解、葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇反应为阳性（表1）。

表1fdhy-03菌株生理生化反应结果

扩增fdhy-03菌株的16srrna，对基因序列进行克隆和序列分析，结果显示其与alteromonasmacleodiistrainpel71a同源性为99%，因此鉴定为交替单胞菌alteromonassp.，命名为交替单胞菌fdhy-03。该菌株已于2018年12月14日于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：cctccno：m2018895。菌株的16srrna基因序列在genbank中的登录号为mh919332。

实施例3不同浓度交替单胞菌fdhy-03对东海原甲藻的溶藻效果

交替单胞菌fdhy-03的发酵方法：

（1）菌种：采用所述的交替单胞菌fdhy-03；

（2）斜面培养：将步骤（1）中的菌种接种于固体斜面培养基上，在28℃条件下培养24小时；

（3）初级培养：无菌条件下取培养好的斜面，用接种环取一环于50ml液体培养基中，28℃，摇床200rpm培养24小时，获得初级培养菌液；

（4）扩大培养：将初级培养菌液接种于500ml液体培养基中，接种量为5%，28℃，摇床200rpm培养24小时，获得扩大培养菌液；

（5）发酵培养：将扩大培养的菌液接种于2000ml发酵液中，接种量为5%，28℃，200rpm培养60小时后，收集发酵液。

步骤（3）和（4）中所述的液体培养基配方为：蛋白胨5g/l、酵母提取物1g/l、磷酸高铁0.1g/l、海盐30g/l，调节ph至7.5，121℃高温蒸汽灭菌20min；步骤（2）所述固体斜面培养基为上述液体培养基中添加终浓度1.5wt.%的琼脂粉；步骤（5）中所述发酵液配方为上述液体培养基加入终浓度为甘露醇1.5wt.%，酵母粉1wt.%，ph值调至7.5。

将溶藻细菌fdhy-03发酵培养的产物以体积终浓度为0.5%、1%、2%的细菌发酵培养物和藻液的比例进行共培养。设置空白对照，对照组为加入0.5%、1%、2%体积无菌的2216e培养基的同时期藻液。实验组与对照组均设置3个重复。在0h、6h、24h、48h、72h取样，每次取2ml培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（表2）。

表2不同浓度溶藻菌对东海原甲藻的溶藻效率

从表2可知，以0.5%初始菌浓度将菌株fdhy-03发酵培养的产物加入对数期生长期的东海原甲藻中，72h溶藻率为36.92%，以1%初始菌浓度添加时，24h溶藻效果为52.54%，48h为81.05%，到72h可达86.05%。以2%浓度添加时，24h溶藻活性可达91.75%，48h可达94.91%，到72h溶藻率可达97.74%。可见交替单胞菌fdhy-03对东海原甲藻具有较高的溶藻效率。

实施例4交替单胞菌fdhy-03对常见赤潮藻的杀灭作用

将溶藻细菌fdhy-03发酵培养的产物以2%的体积浓度接种于无菌的对数生长期东海原甲藻(prorocentrumdonghaiense)、伊姆裸甲藻（gymnodiniumimpudicum）、亚历山大藻（alexandriumtamarense）、强壮前沟藻（amphidiniumcarteraehulburt）、赤潮异弯藻（heterosigmaakashiwo）、米氏凯伦藻(kareniamikimotoi)、中肋骨条藻（skeletonemacostatum）和三角褐指藻（chaetoceros）藻液中，每个藻种的处理设置三个重复，分别在0h、6h、24h、48h、72h取样，每次取2ml培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（表3）。

表3:fdhy-03对于常见赤潮藻的溶藻率

可见交替单胞菌fdhy-03对东海原甲藻、伊姆裸甲藻、强壮前沟藻、赤潮异弯藻和中肋骨条藻具有较强的溶藻作用，而对于米氏凯伦藻和三角褐指藻的溶藻效果较弱。

实施例5交替单胞菌fdhy-03菌株溶藻方式的研究

将培养到对数期的东海原甲藻用100ml锥形瓶分装，每瓶50ml，溶藻细菌fdhy-03使用东海原甲藻作为目标藻种，每次溶藻细菌鉴定实验将藻分成4组，每组3个平行。第1组加入1ml溶藻细菌菌液，第2组加入1ml经0.22μm微滤膜过滤后的溶藻细菌的胞外产物（菌液经8000rpm离心8min，将上清用0.22μm微滤膜过滤），第3组加入1ml溶藻细菌的细菌培养液经8000rpm离心8min，去上清，用等体积无菌海水重悬清洗一次，再用8000rpm离心8min，去上清，得到溶藻细菌的菌细胞，用等体积无菌海水重悬。第4组加入1ml无菌细菌培养基作为对照组。四组样品培养于20℃光照培养箱中，光照强度100μmolphotons·m⁻²·s⁻¹，光暗周期14h:10h（光：暗），各样品分别在处理后24h，每个样品取2ml培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（附图3）。结果显示fdhy-03通过细菌分泌物溶藻。

实施例6交替单胞菌fdhy-03菌粉的制备

称取一定量的锯末，经过121℃20min高温高压灭菌2次后，于烘箱烘干，作为载体。以质量分数15%的比例将载体加入到fdhy-03菌液发酵产物中。然后放置于摇床中以28℃，200rpm吸附培养6小时。将吸附完毕的载体过滤出来，滤去多余未吸附的发酵液，将吸附了发酵液的载体置于18cm培养皿上，于-80℃冰箱冷冻一夜，隔天进行冷冻干燥，冻干时间24h。冻干完的菌粉，于-20℃保存。

实施例7交替单胞菌fdhy-03菌粉的可回收利用研究

按照3g/100ml的添加量将上述制备的交替单胞菌fdhy-03菌粉装置到无菌的无纺布过滤袋中，并将装有溶藻菌剂的菌袋加入到对数生长期的东海原甲藻培养液中，于0h、24h、48h取样，每次取2ml培养液，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算溶藻率（附图4）。将菌袋回收后立刻加入到新的对数生长期的藻培养液中并计数藻细胞浓度和计算溶藻率。菌袋连续回收利用三次，比较每次的溶藻率。从结果来看，经过三次重复利用，菌粉在48小时的溶藻率没有明显降低。

上述结合附图表对本发明的具体实施方式进行了描述，然而这些并非对本发明保护范围的全部。应当理解，本领域的技术人员在本发明的技术方案基础上不需要付出创造性劳动即可做出的各种变形和修改仍在本发明的保护范围之内。