专利名称：产河豚毒素的气单胞菌从暗纹东方鲀组织分离、发酵培养和所产河豚毒素的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种从暗纹东方飩Takifugu fasciatus组织分离产河豚毒素的气单 胞菌Aeromonas molluscorum，气单胞菌的发酵培养及所产河豚毒素的检测方法，本发明涉 及药用微生物开发和利用的领域，更具体地涉及从细菌中提取河豚毒素，可用作河豚毒素 的规模化生产，可为科学研究、医药行业等相关领域提供原料。
背景技术：
河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，是一种神经毒素，特异性阻断神经细胞细胞膜上 的电压门控钠离子通道，可潜在地作为镇痛、麻醉、戒毒、美容等的药品，临床实践证明了 TTX对头痛、关节炎、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘、百日咳、晚期癌症等多种疾病都有一定疗效 目前，河豚毒素的应用还主要局限在科学研究领域。虽然河豚毒素的人工合成成功了，但合成成本非常昂贵，目前，人工提取的河豚毒 素主要来自于于东方飩属的河飩。一方面，目前国内外TTX的提取的原材料全部来源于野 生河豚的内脏组织，人工养殖的河豚内脏组织几乎不含TTX或含量极低，仅为野生河豚鱼 TTX含量的1%，由于野生河飩鱼数量有限、且原料昂贵、提取成本也相对较高。因为另一方 面，从河飩中提取河豚毒素，会破坏河飩鱼的天然资源。因此，有必要从其它生物资源中提 取河豚毒素。已有很多研究表明河飩体内的河豚毒素，是来自其体内的某些细菌所分泌的，但 细菌分泌的河豚毒素和来自河豚体内的河豚毒素是否完全一样，还没有定论。如果两者是 同一物质，那么通过分离筛选产河豚毒素的细菌，再经过微生物发酵技术，就可以大规模的 TTX,降低生产成本，也会相应地保护野生河飩鱼的资源。虽然，目前国内已经有从红鳍东方飩Takifugu obscurus中分离能产河豚毒素细 菌的报道，但这些细菌所分泌的产物是否为真正的河豚毒素，还需要更严格的检测鉴定。 目前鉴定从河飩中提取的河豚毒素的常见方法有小鼠法、高效液相色谱法、质谱法、酶联免 疫法等，其中，最可靠的方法是质谱法和酶联免疫法。质谱法可以鉴定分子量，酶联免疫法 可以帮助鉴定有相似或相同的分子结构。在目前还不清楚细菌来源的河豚毒素晶体三维结 构的情况下，应该需要同时利用高效液相色谱-质谱和酶联免疫法来鉴定细菌来源的河豚 毒素，否则，很难确定细菌来源的河豚毒素和河豚来源的河豚毒素是同一物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从野生暗纹东方飩(Takifugu obscurus)卵巢中分离 的能产河豚毒素的气单胞菌Aeromonas molluscorum的方法，包括分离气单胞菌Aeromonas molluscorum所用的方法、气单胞菌Aeromonasmolluscorum发酵培养方法、气单胞菌 Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的竞争性ELISA检测方法、气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的LC-MS检测方法。
河飩为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡 水江河中，当遇到外敌，腹腔气囊则迅速膨胀，使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的 小刺竖起，借以自卫。每年3月由外海游至江河口的咸淡水区域产卵。唯有暗纹东方飩 (Takifugu obscurus，英文名0bscure puffer) 一种成群溯河进入淡水，5-6月在江河中有 产卵；怀卵量一般在4-5万粒间。秋季水温下降，开始降河，和其它种类一样游向深海区，12 月初返回深海区越冬。当年出生的幼鱼在江河或通江的湖泊中生活，到翌年春才回到海里， 在海里长大至性成熟后再复进入江河产卵。进入长江的河飩于4-6月，在中游江段或洞庭 湖、鄱阳湖中产卵。河飩的食性杂，以鱼、蝦、蟹、贝壳类为食，亦食昆虫幼虫、枝角类、桡足类 以及高等植物的叶片和丝状藻类。在生殖洄游期间一般很少摄食。暗纹东方飩Takifugu obscurus中分离出能产河豚毒素的细菌 Aeromonasmolluscorum的方法，该细菌所产的河豚毒素与河豚来源的河豚毒素一样或非常 相似，可用作河豚毒素的商业开发和相关的科学研究。产河豚毒素的气单胞菌(Aeromonas molluscorum)，保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心。保藏地址中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所邮编100101。保藏日期2010年4月23日，保藏编号CGMCC N0. 3760。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现作为本发明的第一方面，一种产河豚毒素的气单胞菌Aeromonasmolluscorum从 暗纹东方飩Takifugu fasciatus组织分离方法，其特征在于，包括如下步骤(1)取具河飩毒素(TTX)的暗纹东方飩组织。(2)勻浆处理，并以生理盐水1 10的比例制成稀释液，取Iml稀释液涂布于TCBS
固体培养基上。(3) 23°C培养48h，以挑取平板上的特征菌落，划线于另一 TCBS固体培养基上。(4)23°C培养24h，再将分离到的单菌落再次划线分离培养。(5)重复划线分离培养，直到分离到单菌落。其中，步骤⑴所述组织为卵巢组织。其中，所述TCBS固体培养基的组成为0. 5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0.5% 牛肉蛋白胨，1.0%柠檬酸钠，1.0%硫代硫酸钠，0.5%牛胆汁，0.3%胆酸钠，2.0%蔗糖， 1. 0%氯化钠，0. 柠檬酸铁，0. 004%百里酚蓝，0. 004%溴酚蓝，1. 4%琼脂，余量为蒸馏 水，pH 8. 6。利用16S rDNA全长序列鉴定细菌的方法(1)将分离得到的菌株基因组DNA的提取；(2) 16S rDNA 全长序列的 PCR 扩增，上游引物5，-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3，；(3)25μ 1 PCR 反应体系中，包括2. 5μ 1 IOxPCR 反应缓冲液，1 μ 1 2. 5mM dNTP， IU Taq酶，各Ιμ 6. 25mM的上下游引物，细菌基因组DNA50ng ；(4)PCR反应程序95°C预变性5min后，进行30个循环95°C lmin,50°C lmin，72°C 延伸2min。最后72°C延伸IOmin0(5)将16S rDNA全长序列的扩增产物纯化回收；(6)回收的产物克隆在pMD18-T载体中；
(7)转化大肠杆菌T0P10 ；(8)挑选阳性克隆测序。(9)测序结果经BLAST N在GenBank比对，获得同源性较高的序列；(10)利用MEGA 4. 0软件进行聚类分析，确定该分离的菌株为气单胞菌Aeromonas molIuscorum0作为本发明的第二方面，所述气单胞菌Aeromonas molluscorum的发酵培养方法， 其特征在于，包括如下步骤(1)将细菌接种在ORI液体培养基中；(2) 23°C 下，225 转 / 分钟，培养 5-6 天。其中，所述ORI液体培养基的组成为0. 2%动物蛋白胨，0. 2%植物蛋白胨，0. 1% 酵母抽提物，0.088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，pH 8.0。作为本发明的第三方面，所述的气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素 的竞争性酶联免疫吸附试验方法(即竞争性ELISA)检测方法，其特征在于，包括如下步 骤(1)在0-250叫/1111范围内分别把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素标准样品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素单克隆抗体MAb_TTX(购自商业公司(北京中卫食品 卫生科技公司)，分光光度计检测吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素浓度在0-250ng/ml范围的标准曲线；(4)发酵培养的河豚毒素和河豚毒素单克隆抗体MAb-TTX —起加入微孔板中，分 光光度计检测吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出气单胞菌Aeromonas molluscorum的细菌源河豚毒素的浓度。作为本发明的第四方面，所述的气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素 的液相色谱质谱(即LC-MS)检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌发酵培养后，4°C下4000Xg离心3Omin 收集细胞；(2)用0. 乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3) 100°C煮20-25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)上清用直径0. 25 μ m滤纸过滤；(5)过滤液过活性碳柱，用洗脱液洗脱活性碳，洗脱液的配方为甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脱液45°C减压至0. 001-0. 003MPa浓缩，冷冻干燥；(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集，收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18 Sep-Pak cartridges 过柱(Waters，Milford, ΜΑ)；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个 柱体积的洗脱液；
(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中；(14)利用系统来分析河豚
毒素；(15)对河豚毒素质谱分析。其中，步骤(10)所述C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml
水清洗。其中，步骤(12)洗脱液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifugefilter (Micron YM-3, Waters)过滤。其中，步骤(14)利用ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford,MA)系统来分析河豚毒素。其中，步骤(15)河豚毒素质谱分析利用Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)。本发明的有益效果1)本发明是通过选择合适的培养基TCBS分离到能产河豚毒素的细菌。2)本发明所提供的细菌气单胞菌Aeromonas molluscorum能分泌与河豚源河豚 毒素一样的物质。
以下结合附图和具体实施方式
来进一步说明本发明。图1为气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌全长16S rDNA的细菌鉴定。图2为气单胞菌Aeromonas molluscorum的细菌源河豚毒素鉴定的竞争性酶联免 疫吸附试验的定量结果。图3为离子色谱图表明来自气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌源样品(A)和 河豚毒素标准品(B)都在m/z 320. 11出现。图4为气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌源样品(A)和河豚毒素标准品(B) 的质谱图。
具体实施例方式为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具 体图示，进一步阐述本发明。实施例1从野生暗纹东方飩Takifugu fasciatus的卵巢中分离气单胞菌 Aeromonasmolluscorum的方法,可按照以下步骤操作(1)选取野生暗纹东方飩Takifugu fasciatus活体，发明人采集自中国，江苏省。(2)用95%酒精擦洗消毒鱼体体表，用无菌解剖刀、剪刀和镊子解剖鱼体，取出卵桌。(3)用无菌的勻浆器勻浆卵巢，并以0.9%的生理盐水以1 10的比例制成稀释 液，(4)取Iml稀释液涂布于TCBS固体培养基上，23°C培养48h。
(5)挑取培养基上的特征菌落，划线于另一 TCBS固体培养基上，(6)23°C培养24h，再将分离到的单菌落重新划线分离培养，(7)重复划线分离培养，直到分离到足够纯的单菌落。(8)分离到的各个单菌落用作细菌鉴定分离气单胞菌Aeromonas molIuscorum的TCBS固体培养基组成如下0.5%酵母抽提物，0.5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉蛋白胨，1.0%柠檬酸钠，1.0%硫代 硫酸钠，0.5%牛胆汁，0.3%胆酸钠，2.0%蔗糖，1.0%氯化钠，0. 柠檬酸铁，0. 004%百 里酚蓝，0. 004%溴酚蓝，1. 4%琼脂，余量为蒸馏水，pH8. 6。实施例2利用16S rDNA全长序列鉴定Aeromonas molluscorum细菌的方法，可按照以下步 骤操作(1)将分离到的细菌菌株接种在液体培养基ORI中。(2) 23 °C 下，225 转 / 分钟，培养 5-6 天。(3)提取菌株基因组DNA。(4) 16S rDNA全长序列的PCR扩增，所用的上游引物5，_AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG-3，，下游引物:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3，。(3) 25 μ 1 PCR反应体系中，包括2. 5 μ 1 IOxPCR 反应缓冲液，1 μ 1 2. 5mM dNTP,IU Taq 酶，各1 μ 1 6. 25mM的上下游引物，细菌基因组DNA50ng。(4) PCR 反应程序95°C预变性 5min 后。进行30 个循环95°C Imin，50 °C Imin，72°C 延伸 2min。最后72°C延伸 lOmin。(5)将16S rDNA全长序列的扩增产物纯化回收。(6)回收的产物克隆在pMD18-T载体中。(7)转化大肠杆菌T0P10。(8)挑选阳性克隆测序。(9)测序结果经BLAST N在GenBank比对，获得同源性较高的序列。(10)利用 MEGA 4. 0 软件进行聚类分析，确定 Aeromonas molluscorum。(11)结果如图1所示，该分离的菌株为气单胞菌Aeromonas molluscorum。气单胞菌Aeromonas molIuscorumORI液体培养基的组成为0. 2 %动物蛋白胨，0. 2 %植物蛋白胨，0. 1 %酵母抽提物，0. 088 %柠檬酸铁，3 % NaCl，余量为蒸馏水，pH 8.0。实施例3气单胞菌Aeromonas molluscorum的细菌源河豚毒素鉴定的竞争性酶联免疫吸附 试验方法，包括以下步骤进行
(1)在0-250叫/1111范围内分别把0、50、100、150、200、250叫/1111的河豚源的河豚毒
素标准样品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入购自商业公司(北京中卫食品卫生科技公司)的河豚毒素单 克隆抗体MAb-TTX，分光光度计检测吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素浓度在0-250ng/ml范围的标准曲线。(4)发酵培养河豚毒素和河豚毒素单克隆抗体MAb-TTX —起加入微孔板中，分光 光度计检测吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，可以得知气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌源河豚毒素的浓度。(6)结果如图2所示的河豚毒素竞争性酶联免疫吸附试验的定量结果。实施例4气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌源河豚毒素鉴定的液相色谱质谱检测方 法，包括如下步骤(I)Aeromonas molluscorum 细菌发酵培养后，4°C下 4000Xg 离心 30min 收集细 胞；(2)用0. 乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3) 100°C煮约20min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)上清用直径约0. 25 μ m滤纸过滤；(5)过滤液过活性碳柱，用洗脱液洗脱活性碳，洗脱液的配方为甲醇的乙 酸溶液=20 80;(6)洗脱液45°C减压至0. 001-0. 003MPa浓缩，冷冻干燥；(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过 IX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集，收集2ml ；(10)洗脱液再用 C18 Sep-Pak cartridges 过柱(Waters，Milford, MA), C18 Sep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗；(11)用IOmlO. 3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个 柱体积的洗脱液；(12)洗脱液用 3000MW cut-off Ultrafree microcentrifuge filter (Micron YM-3, Waters)过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中；(14)利用 ACQUITY Ultra Performance LC system(UPLC) (Waters, Milford, MA) 系统来分析河豚毒素；(15) 可月豕普 禾lJffl Quadrupole-Time of Flight MassSpectrometry (Q-T0F MS) (Waters, Milford, MA)；(16)结果如图4所示的质谱图，(A)为来自Aeromonas molluscorum细菌源样品； (B)为河豚毒素标准品。在本发明中，采用从暗纹东方飩卵巢中分离细菌，采用TCBS培养基进行筛选，首 次从河豚鱼体中分离到能产河豚毒素的气单胞菌Aeromonasmolluscorum，所分离的细菌采用了 16S rDNA法进行了鉴定。分离到的气单胞菌所产的河豚毒素首次采用竞争性酶联免疫吸附试验检测方法 (竞争性ELISA)和液相色谱质谱检测方法(LC-MS)，同时检测的方法，竞争性酶联免疫吸附 试验适用于河豚毒素的检测，灵敏度高。本发明的所要检测的河豚毒素为大分子、热不稳定 化合物，所以选择液质联用仪。明确所产河豚毒素与从河豚体内提取的河豚毒素为同一种 物质。本发明所分离的气单胞菌Aeromonas molluscorum，经培养后可从细菌中大规模 分离河豚毒素。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等同物界定。
权利要求
1.一种产河豚毒素的气单胞菌Aeromonas moIluscorum从暗纹东方飩Takifugu fasciatus组织分离方法，其特征在于，包括如下步骤(1)取具河飩毒素(TTX)的暗纹东方飩卵巢组织；(2)勻浆处理，并以生理盐水1 10的比例制成稀释液，取Iml稀释液涂布于TCBS固体培养基上；(3)23°C培养48h，以挑取平板上的特征菌落，划线于另一TCBS固体培养基上；(4)23°C培养24h，再将分离到的单菌落再次划线分离培养，(5)重复划线分离培养，直到分离到单菌落。
2.根据权利要求1所述的产河豚毒素的气单胞菌从暗纹东方飩组织分离方法，其特征 在于，其中，所述组织为卵巢组织。
3.根据权利要求1所述的产河豚毒素的气单胞菌从暗纹东方飩组织分离方法，其特 征在于，所述的TCBS固体培养基的组成为0. 5%酵母抽提物，0. 5%酪蛋白胨，0. 5%牛肉 蛋白胨，1. 0 %柠檬酸钠，1. 0%硫代硫酸钠，0. 5 %牛胆汁，0. 3 %胆酸钠，2. 0 %蔗糖，1. 0 % 氯化钠，0. 柠檬酸铁，0. 004%百里酚蓝，0. 004%溴酚蓝，1. 4%琼脂，余量为蒸馏水，pH 8. 6。
4.一种如权利要求1所述气单胞菌Aeromonas molluscorum的发酵培养方法，其特征 在于，包括如下步骤(1)将细菌接种在ORI液体培养基中；(2)23°C下，225转/分钟，培养5-6天。
5.根据权利要求4所述的气单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，其特征在于，所 述ORI液体培养基的组成为0. 2%动物蛋白胨，0.2%植物蛋白胨，0. 酵母抽提物， 0. 088%柠檬酸铁，3% NaCl，余量为蒸馏水，pH 8. 0。
6.一种如权利要求4所述的气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的竞争性 酶联免疫吸附试验检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)在0-250ng/ml范围内分别把0、50、100、150、200、250ng/ml的河豚源的河豚毒素标 准样品先固定在微孔板上；(2)在微孔板中加入河豚毒素单克隆抗体MAb-TTX，分光光度计检测吸光值，以Ao表示；(3)建立河豚毒素浓度在0-250ng/ml范围的标准曲线；(4)发酵培养的河豚毒素和河豚毒素单克隆抗体MAb-TTX—起加入微孔板中，分光光 度计检测吸光值，以Ai表示；(5)Ai/Ao比例，得出气单胞菌Aeromonasmolluscorum的细菌源河豚毒素的浓度。
7.一种如权利要求4所述的气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的液相色 谱质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)气单胞菌Aeromonas molluscorum细菌 发酵培养后，4°C下4000 Xg离心30min收集细胞；(2)用0.乙酸溶解细胞，超声波破碎细胞；(3)100°C煮20-25min，冷却后离心去除细胞碎片；(4)上清用直径0.25 μ m滤纸过滤；(5)过滤液过活性碳柱，用洗脱液洗脱活性碳，洗脱液的配方为甲醇的乙酸溶液=20 80 ；(6)洗脱液45°C减压至0. 001-0. 003M Pa浓缩，冷冻干燥；(7)溶于2ml无菌去离子水中；(8)过lX80cm 的 Bio-Gel P2 柱子(Bio-Rad Lab, Richmond, VA, USA)；(9)用0.03M乙酸洗脱，从洗脱液流出开始收集，收集2ml ；(10)洗脱液再用C18 Sep-Pak cartridges 过柱(Waters，Milford，MA)；(11)用IOmlO.3%的乙酸洗脱，从第二个柱体积洗脱液流出开始收集，收集两个柱体 积的洗脱液；(12)将洗脱液过滤；(13)过滤液冷冻干燥后，溶解在Iml无菌去离子水中；(14)利用系统来分析河豚毒素；(15)对河豚毒素质谱分析。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(10)所述ClSSep-Pak cartridges在使用前，需要用IOml甲醇和IOml水清洗。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(12)洗脱液用3000MWcut-off Ultrafree microcentrifuge filter 过滤。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(14)利用ACQUITYUltra Performance LC system UPLC系统来分析河豚毒素。
11.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤(15)河豚毒素质谱分析利用 Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry。
全文摘要
一种产河豚毒素的气单胞菌Aeromonas molluscorum从暗纹东方鲀Takifugu fasciatus组织分离、发酵培养和所产河豚毒素的检测方法，包括细菌分离、细菌鉴定、细菌发酵培养、气单胞菌所产河豚毒素的竞争性ELISA检测和LC-MS检测等方法。在本发明中，采用从暗纹东方鲀卵巢中分离细菌，采用TCBS培养基进行筛选，首次从河豚鱼体中分离到能产河豚毒素的气单胞菌，所分离的细菌采用了16SrDNA法进行了鉴定，分离到的气单胞菌所产的河豚毒素首次采用竞争性ELISA和LC-MS同时检测的方法，明确所产河豚毒素与从河豚体内提取的河豚毒素为同一种物质。本发明所分离的气单胞菌，经培养后可从细菌中大规模分离河豚毒素。
文档编号C12N1/20GK101993834SQ20101017936
公开日2011年3月30日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者杨桂梅, 鲍宝龙 申请人:上海海洋大学