一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术：

乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在食品、医药、饲料、精细化学品等与人类生活密切相关的重要工业领域也具有重要的应用价值。

但是，在乳酸菌的工业化发酵生产以及作为益生菌在人体胃肠道系统发挥作用的过程中，不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，这些环境胁迫均严重限制着乳酸菌生长性能。

而在乳酸菌面临的众多胁迫条件中，酸胁迫是影响其生理活性的重要胁迫条件。

酸胁迫是由乳酸菌代谢产物乳酸、乙酸等酸性物质造成的，随着菌体的代谢生长过程，酸性物质也随之产生并积累，这些积累的乳酸、乙酸等酸性物质通过被动扩散进入细胞质，由于胞内的ph通常较胞外的ph高0.5～1.0，进入胞内的乳酸、乙酸等迅速解离，导致胞内ph的快速降低，使得细胞面临严重的酸胁迫，严重影响了细胞的生理活性，大大降低了乳酸菌食品微生物制造的效率，其中，以乳酸的积累导致的酸胁迫是最重要的胁迫之一。

对于酸胁迫，为维持乳酸菌发酵生产的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在乳酸菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持ph处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(氨水或naoh)来控制发酵环境的ph值。

然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。

目前，提高乳酸菌的乳酸、乙酸等酸胁迫抗性的方法则主要有：(1)诱变育种，该方法具有简便、类型繁多等特点，但工作量大、效率低是其主要缺点；(2)生化工程策略，已有报道用过外源添加天冬氨酸以提高乳酸菌的酸胁迫耐受性，但该方法的使用造成了生产成本的增加；(3)代谢工程策略，目前利用代谢工程策略提高乳酸菌环境胁迫的方法主要包括构建新的代谢途径、拓展已有代谢途径和削弱已有代谢途径，但是，此方法存在成本高、成功率低的问题，

因此，急需找到一种新的效果优异、成本低、成功率高、操作简单、工作量少、效率高的可提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用。本发明以编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2(energy-couplingfactortransportsystematp-bindingprotein)的基因为目的基因，以乳酸菌为表达宿主，成功构建了一种可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的乳酸菌工程菌；此乳酸菌工程菌的酸胁迫抗性得到了显著提高，较野生菌株最高提高了598.7倍。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2来源于乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，编码所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pnz8148。

本发明提供了一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法，所述方法为在乳酸菌中过量表达能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2来源于乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，所述编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述过量表达为先通过编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因与表达载体构建含有编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因重组质粒，再将重组质粒导入乳酸菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pnz8148。

本发明提供了利用上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法制备得到的酸胁迫抗性提高的乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述酸胁迫抗性提高的乳酸菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因；所述表达宿主为乳酸菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2来源于乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000。

在本发明的一种实施方式中，所述编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的氨基酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pnz8148。

本发明提供了上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在提高乳酸菌酸胁迫抗性方面的应用。

本发明提供了上述一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌或上述一种提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法在制备食品、药品、饲料以及化学品方面的应用。

有益效果：

(1)本发明首次发现在乳酸菌中过量表达ecfa2蛋白可显著提高乳酸菌的酸胁迫抗性；

(2)本发明通过在乳酸乳球菌中过量表达ecfa2蛋白，得到了酸胁迫抗性显著提高的重组乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148/ecfa2)；

(3)利用本发明的方法得到的重组乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000(pnz8148/ecfa2)对酸胁迫的抗性较野生型有了明显的提高，其对乳酸的抗性较野生型提高了598.7倍。

附图说明

图1：重组质粒pnz8148/ecfa2的结构图；

图2：重组质粒pnz8148/zitp的结构图；

图3：重组质粒pnz8148/zitq的结构图；

图4：重组质粒pnz8148/bglf的结构图；

图5：重组质粒pnz8148/ganp的结构图；

图6：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)和对照菌株的生长曲线；

图7：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)、llactisnz9000(pnz8148/zitq)和对照菌株的生长曲线；

图8：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/bglf)、llactisnz9000(pnz8148/ganp)和对照菌株的生长曲线；

图9：ph4.0(乳酸调节)条件下重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)与对照菌株的存活率对比；

图10：ph4.0(乳酸调节)条件下重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)与对照菌株的存活率对比；

图11：ph4.0(乳酸调节)条件下重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitq)与对照菌株的存活率对比；

图12：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)和对照菌株酸胁迫前后的胞内atp含量对比；

图13：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)和对照菌株酸胁迫前后的胞内亮氨酸含量对比；

图14：重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)和对照菌株酸胁迫前后的胞内天冬氨酸含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

下述实施例中涉及的乳酸乳球菌lactococcuslactisnz9000来源于荷兰nizo研究所。

下述实施例中涉及的培养基如下：

氯霉素平板：蛋白胨(英国oxoid公司)1％(m/v)、酵母粉(oxoid)0.5％(m/v)、氯化钠1％(m/v)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/ml氯霉素。

gm17液体培养基：在m17培养基(oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(glucose)。

gm17氯霉素平板：在m17培养基(oxoid)中补充5‰(m/v)的葡萄糖(glucose)及2％(m/v)琼脂条，灭菌后添加终浓度10μg/ml氯霉素。

实施例1：重组菌株的构建

具体步骤如下：

(1)从ncbi数据库的中得到如seqidno.1所示的ecfa2基因序列(编码能量偶联因子转运蛋白atp酶ecfa2的基因，膜上用于转运atp的蛋白)、如seqidno.3所示的zitp基因序列(编码金属离子abc转运蛋白通透酶zitp的基因，膜上用于转运金属离子的蛋白)、如seqidno.4所示的zitq基因序列(编码金属离子abc转运atp结合蛋白zitq的基因，膜上用于转运金属离子的蛋白)、如seqidno.5所示的bglf基因序列(编码β-葡萄糖苷特异性pts系统iiabc组分bglf的基因，膜上用于转运β-葡萄糖苷的蛋白)、如seqidno.6所示的ganp基因序列(编码麦芽糖abc转运蛋白通透酶ganp的基因，膜上用于转运麦芽糖的蛋白)，根据的基因序列设计分别如表1所示的引物；

(2)以l.lactisnz9000的基因组为模板，分别以表1中的引物通过pcr扩增获得seqidno.1、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6所示的基因片段；

(3)将pcr产物和载体pnz8148分别用表1中的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接；

(4)将连接产物转化大肠杆菌mc1061(商业化菌株)感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落pcr验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pnz8148/ecfa2(结构如图1所示)、pnz8148/zitp(结构如图2所示)、pnz8148/zitq(结构如图3所示)、pnz8148/bglf(结构如图4所示)、pnz8148/ganp(结构如图5所示)；

(5)从重组e.colimc1061中提取重组质粒，电转化感受态l.lactisnz9000细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落pcr验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)、llactisnz9000(pnz8148/zitp)、llactisnz9000(pnz8148/zitq)、llactisnz9000(pnz8148/bglf)、llactisnz9000(pnz8148/ganp)。其中，电转化条件为：1μl质粒中与40μ的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中，冰上放置10min；调节电压2000v，电容25μf，电阻200ω进行电击；电击完毕后，立即向电转杯中加入含有20mmmgcl2和2mmcacl2的gm17培养基(培养基配方：m17broth培养基+0.5％glucose)；然后置于30℃静置培养1.5h，涂布于含有氯霉素的gm17平板上，培养36h，挑取转化子验证。

表1引物与酶切位点

实施例2：重组菌株的生长性能试验

具体步骤如下：

(1)将菌株llactisnz9000(pnz8148)(对照)和实施例1得到的菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)、llactisnz9000(pnz8148/zitp)、llactisnz9000(pnz8148/zitq)、llactisnz9000(pnz8148/bglf)、llactisnz9000(pnz8148/ganp)分别接种于加了10μg/ml氯霉素的gm17液体培养基中进行活化，放在30℃培养箱中静置培养过夜；

(2)分别以2％的接种量将上述得到的种子液转接至新鲜的氯霉素(10μg/ml)gm17液体培养基中，30℃静置培养；

(3)在培养过程中，每隔一定时间取样，测定600nm波长下的od值；

(4)培养至od6000.4时加入10ng/ml的nisin诱导表达转运蛋白，以时间为横坐标，od600值为纵坐标，绘制生长曲线(绘制得到的生长曲线如图6-8所示)。

结果如图6所示，经生长性能试验分析，重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)的生物量与对照菌株没有太大差距，说明在llactisnz9000中过量表达ecfa2蛋白对菌株的生长性能没有影响。

结果如图7所示，经生长性能试验分析，重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)和llactisnz9000(pnz8148/zitq)的生物量与对照菌株没有太大差距，说明在llactisnz9000中过量表达zitp和zitq蛋白对菌株的生长性能没有影响。

结果如图8所示，经生长性能试验分析，重组菌株llactisnz9000(pnz8148/bglf)和llactisnz9000(pnz8148/ganp)的生物量明显低于对照菌株，说明在llactisnz9000中过量表达bglf和ganp蛋白影响菌株的正常生长。因此后续实验对能正常生长的重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)和llactisnz9000(pnz8148/zitq)的耐酸性能进行试验。

实施例3：重组菌株在乳酸胁迫条件下的耐受性试验

具体步骤如下：

将菌株llactisnz9000(pnz8148)(对照)和实施例1得到的菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)、llactisnz9000(pnz8148/zitp)、lactisnz9000(pnz8148/zitq)分别诱导培养6h，离心收集细胞，经0.85％的生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的新鲜的ph4.0(乳酸调节)的gm17(含有氯霉素10μg/ml)中，胁迫不同时间；将胁迫后的菌悬液洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，取10μl重悬液，稀释不同梯度点种于gm17氯霉素平板上测定活菌数和存活率(结果如图9-11所示)；

存活率＝(n/n0)×100％；

其中，n0是未经酸胁迫处理的菌悬液在平板上的活菌落数；n是胁迫后平板上长出的活菌落数。

如图9-11所示，经耐受性实验分析，在ph4.0的gm17中胁迫4h后，重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)的存活率为对照的598.7倍，说明重组菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)对酸胁迫的耐受性显著提高；在ph4.0的gm17中胁迫4h后，重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)和lactisnz9000(pnz8148/zitq)的存活率分别为对照的14.5倍和9.4倍，说明重组菌株llactisnz9000(pnz8148/zitp)和lactisnz9000(pnz8148/zitq)对酸胁迫的耐受性略有提高。

实施例4：重组菌株胞内atp含量的测定

具体步骤如下：

将菌株llactisnz9000(pnz8148)(对照)和实施例1得到的菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)分别诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·l^-1，ph7.0)洗涤2次重悬于等体积的新鲜的ph4.0(乳酸调节)的gm17(含有氯霉素10μg/ml)中，胁迫不同时间，取4.0ml菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用。用atp检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)测定胞内atp的含量。

结果如图12所示，酸胁迫前后重组菌株胞内atp含量均高于对照菌株，结果表明重组菌株可以释放更多的atp，满足胁迫条件下细胞对能量的需求，进而增强l.lactisnz9000的酸胁迫抗性。

实施例5：重组菌株胞内氨基酸含量的测定

具体步骤如下：

将菌株llactisnz9000(pnz8148)(对照)和实施例1得到的菌株llactisnz9000(pnz8148/ecfa2)分别诱导培养6h，用等体积磷酸缓冲液(200mmol·l^-1，ph7.0)洗涤2次重悬于等体积的新鲜的ph4.0(乳酸调节)的gm17(含有氯霉素10μg/ml)中，胁迫不同时间，取10.0ml菌液、离心、洗涤，收集菌体并用液氮预冻液氮预冻，保存备用。应用高效液相色谱仪对重组菌株胞内氨基酸含量进行检测。

高效液相色谱仪检测样品的制备：取1ml磷酸缓冲液重悬菌体，菌悬液转移至破碎管，使用fastprep-24振荡破碎细胞(4.0m·s^-1)至菌悬液澄清；离心，取上清500μl，加等体积5％(m/v)的三氯乙酸(tca)，静止放置30min去除可溶性蛋白；离心，取上清液，用水系滤膜(0.2μm)过滤到干净的样品瓶中备用。

高效液相色谱仪分析方法：opa和硼酸进行柱前衍生；柱温设定为40.0℃；流速设定为1.0ml·min^-1；紫外检测器的波长为338nm；色谱柱选用odshypersil(250.0mm×4.6mm×5.0μm)。

结果如图13-14所示，酸胁迫前后重组菌株胞内亮氨酸含量均高于对照菌株，亮氨酸合成过程中竞争性消耗丙酮酸降低甲酸等产量，可缓解细胞受到的胁迫压力；酸胁迫前后重组菌株胞内天冬氨酸含量均高于对照菌株，天冬氨酸在天冬氨酸脱羧酶的作用下，消耗h⁺，脱掉β位置的羧基，生成丙氨酸和co2，有效维持phi的相对平衡。重组菌株通过调节氨基酸代谢，消耗胞内h⁺，生成碱性物质，从而维持胞内ph的稳态，进而帮助细胞抵御酸胁迫。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用

<160>16

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>867

<212>dna

<213>人工序列

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<400>5

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