一种双席夫碱壳聚糖衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药农业领域，具体涉及一种双席夫碱壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

甲壳素(chitin)广泛存在于甲壳纲动物虾和蟹的甲壳、昆虫的甲壳、真菌的细胞壁和植物(如蘑菇)的细胞壁中，是自然界中除纤维素外储备量排第二的天然有机化合物，当甲壳素脱乙酰度达到55％以上时，其在1％乙酸或者1％盐酸等酸性溶液中是可溶的，该种甲壳素可以称之为壳聚糖(chitosan)。壳聚糖，作为自然界中唯一的阳离子多糖，其具有独特地物理化学性质，例如低毒性、生物相容性、生物可降解性、抑菌性、抗氧化性等，广泛应用在材料、环保、食品、农业、医药、化妆品等行业。

近年来，壳聚糖作为一种绿色可再生资源受到广泛地关注，但是其本身活性弱，抗菌谱窄，对细菌抑制效果较好，对真菌抑菌效果差。席夫碱作为一类含有亚胺或甲亚胺特性基团(－rc＝n－)的有机化合物，具有抑菌杀菌的生理活性。基于活性叠加原理，通过化学分子修饰，将席夫碱结构引入壳聚糖分子中，在保持壳聚糖本身性质的同时，进一步改善壳聚糖的抑菌活性，促进其在医药农业领域的应用。

技术实现要素：

本发明目的是提供了一种具有较好抑真菌活性的双席夫碱壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种双席夫碱壳聚糖衍生物，双席夫碱壳聚糖衍生物结构式如式一所示，

其中聚合度n的平均取值范围为300-900。

双席夫碱壳聚糖衍生物的制备方法，以苯胺与乙二醛为原料合成小分子席夫碱，然后与壳聚糖2位氨基反应，产物经纯化即得到如式一所示的双席夫碱壳聚糖衍生物；

所述苯胺的摩尔量为乙二醛摩尔量的1-3倍；壳聚糖的摩尔量为乙二醛摩尔量的0.05-1倍。

进一步的说

步骤1)将乙二醛溶于无水乙醇中，加入醋酸溶液，加热搅拌，待用；其中，无水乙醇体积为乙二醛体积的20-40倍，醋酸溶液体积为乙二醛体积的0.02-0.2倍；

步骤2)将苯胺溶于无水乙醇中混匀，混匀后缓慢滴加到步骤1)溶液中，升高至120℃，回流反应12-24h，而后在60℃下减压悬蒸得到粘稠状液体待用；其中，苯胺的摩尔量为乙二醛摩尔量的1-3倍，无水乙醇的体积为乙二醛体积的10倍。

步骤3)将步骤2)中得到的产物用二甲基亚砜(dmso)溶解，加入壳聚糖，于60-70℃反应6-18h，而后直接用过量的丙酮和乙醚混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，冷冻干燥，即得到双席夫碱壳聚糖衍生物待用；其中，二甲基亚砜(dmso)体积为乙二醛体积的10-30倍，壳聚糖的摩尔量为乙二醛摩尔量的0.05-1倍，丙酮与乙醚的体积比为1:1。

所述步骤3)中反应后产物经体积比为1:1的丙酮和乙醚的混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，然后置于透析袋内用去离子水透析2-4d，产物冻干即为式一所示双席夫碱壳聚糖衍生物。

双席夫碱壳聚糖衍生物的应用，所述双席夫碱壳聚糖衍生物在制备抑真菌剂的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：

本发明所具有的优点：

1.本发明衍生物基于活性叠加原理，利用醛羰基与氨基的反应，将双席夫碱结构引入到壳聚糖分子中，进而获得生物活性显著的衍生物。

2.本发明制备所得成双席夫碱壳聚糖衍生物与壳聚糖相比，其生物活性得到明显提高。

3.本发明合成步骤简单、所需设备及原料易得、成本较低、易于推广，而且本产品产率较高，可到60％以上，本发明所得产品可广泛用于生物、医药、食品、化工等领域。

附图说明

图1为壳聚糖的红外光谱图，其中，1601.37cm^-1为2位氨基的吸收峰。

图2为本发明实施例制备的双席夫碱壳聚糖衍生物的红外光谱图，从图2可知与壳聚糖原料相比，在1621.13cm^-1出现新的吸收峰，为c＝n的吸收峰，在3053.23、1601.66、1497.61、758.23cm^-1处的吸收峰为苯环的吸收峰，证明双席夫碱壳聚糖衍生物的成功合成。

图3为本发明实施例制备的双席夫碱壳聚糖衍生物抑制灰葡萄孢菌生长的能力。

图4为本发明实施例制备的双席夫碱壳聚糖衍生物抑制黄瓜枯萎致病菌生长的能力。

图5为本发明实施例制备的双席夫碱壳聚糖衍生物抑制西瓜枯萎致病菌生长的能力。

具体实施方式

本研究首先利用苯胺与乙二醛制备得到小分子席夫碱，然后与壳聚糖上2位氨基反应，将苯环结构引入到壳聚糖分子中，得到双席夫碱壳聚糖衍生物，并且分别研究了其对灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎致病菌、西瓜枯萎致病菌三种植物致病菌的抑制作用。该类衍生物制备简便、条件温和，为糖类抑真菌剂的研制提供了可行思路。

实施例1：

双席夫碱壳聚糖衍生物的合成路线如下：

聚合度n的平均取值范围为300-900。

本实施例按以上合成路线合成目标化合物双席夫碱壳聚糖衍生物。

步骤1)1.0ml乙二醛溶于20.0ml无水乙醇，加入0.02ml醋酸溶液，80℃加热搅拌30min；

步骤2)1.8ml苯胺溶于10.0ml无水乙醇，混匀后缓慢滴加到步骤1)溶液中，升高至120℃，回流反应12h，而后在60℃下减压悬蒸，得到粘稠状液体；

步骤3)将步骤2)中得到的产物用10.0ml的二甲基亚砜(dmso)溶解，加入0.16g壳聚糖(参见图1壳聚糖聚合度n＝500)，于60℃反应6h，而后直接用过量的体积比为1:1的丙酮和乙醚混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，即得双席夫碱壳聚糖衍生物(参加图2)。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

步骤1)1.0ml乙二醛溶于30.0ml无水乙醇，加入0.04ml醋酸溶液，80℃加热搅拌30min；

步骤2)3.6ml苯胺溶于10.0ml无水乙醇，混匀后缓慢滴加到步骤1)溶液中，升高至120℃，回流反应18h，而后在60℃下减压悬蒸，得到粘稠状液体；

步骤3)将步骤2)中得到的产物用10.0ml的二甲基亚砜(dmso)溶解，加入0.16g壳聚糖，于60℃反应8h，而后直接用过量的体积比为1:1的丙酮和乙醚混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，即得双席夫碱壳聚糖衍生物。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

步骤1)1.0ml乙二醛溶于30.0ml无水乙醇，加入0.1ml醋酸溶液，80℃加热搅拌30min；

步骤2)5.4ml苯胺溶于10.0ml无水乙醇，混匀后缓慢滴加到步骤1)溶液中，升高至120℃，回流反应20h，而后在60℃下减压悬蒸，得到粘稠状液体；

步骤3)将步骤2)中得到的产物用20.0ml的二甲基亚砜(dmso)溶解，加入0.32g壳聚糖，于70℃反应10h，而后直接用过量的体积比为1:1的丙酮和乙醚混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，即得双席夫碱壳聚糖衍生物。

实施例4

与实施例1不同之处在于：

步骤1)1.0ml乙二醛溶于40.0ml无水乙醇，加入0.2ml醋酸溶液，80℃加热搅拌30min；

步骤2)5.4ml苯胺溶于10.0ml无水乙醇，混匀后缓慢滴加到步骤1)溶液中，升高至120℃，回流反应24h，而后在60℃下减压悬蒸，得到粘稠状液体；

步骤3)将步骤2)中得到的产物用30.0ml的二甲基亚砜(dmso)溶解，加入1.6g壳聚糖，于70℃反应18h，而后直接用过量的体积比为1:1的丙酮和乙醚混合溶液沉淀，抽滤，丙酮洗涤，去离子水透析2d，真空冷冻干燥，即得双席夫碱壳聚糖衍生物。

上述实施例获得

应用例

抑制灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎致病菌、西瓜枯萎致病菌能力的测定：

采用菌丝生长速率抑制法分别测定所合成的双席夫碱壳聚糖与壳聚糖抑制灰葡萄孢菌、黄瓜枯萎致病菌、西瓜枯萎致病菌三种植物致病菌的能力并做对比：将实施例中制备的双席夫碱壳聚糖和壳聚糖真空冷冻干燥至恒重后，以水做溶剂，配制成6.0mg/ml的样品水溶液后，分别取2.0ml，1.0ml，0.2ml样品溶液加入至体积为10.0ml，11.0ml，11.8ml的市售的真菌培养基中，配制成样品浓度为1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml的培养基。以等浓度的多菌灵为阳性对照，以等体积的灭菌水代替样品作空白对照。将培养基摇匀倒入直径为6cm的培养皿中，待其完全凝固后，在每个培养皿中接种直径为5mm的菌饼。在温度为28℃湿度为60％的无菌培养箱里培养48h至72h，待空白组的真菌菌丝长到培养皿的内边缘，采用十字交叉法测量菌落的直径，计算样品的抑菌率，全部实验重复一次。

抑菌率(％)＝1-[(d样品-5)/(d空白-5)]×100

实验结果：本发明所合成的双席夫碱壳聚糖衍生物与壳聚糖的抑制灰葡萄孢菌生长的能力如图3所示，本发明所合成的双席夫碱壳聚糖衍生物的抑制灰葡萄孢菌能力明显优于壳聚糖，当样品浓度为1.0mg/ml时，双席夫碱壳聚糖衍生物抑制率达到88.7％。本发明所合成的双席夫碱壳聚糖衍生物与壳聚糖的抑制黄瓜枯萎致病菌生长的能力如图4所示，抑菌结果与上述类似，当样品浓度为1.0mg/ml时，双席夫碱壳聚糖衍生物对黄瓜枯萎致病菌的抑制作用可以达到90.5％，明显优于壳聚糖的抑菌能力。本发明所合成的双席夫碱壳聚糖衍生物与壳聚糖的抑制西瓜枯萎致病菌生长的能力如图5所示，在抑制西瓜枯萎致病菌的活性测试过程中，壳聚糖的抑菌作用较弱，当样品浓度为1.0mg/ml时，双席夫碱壳聚糖衍生物的抑菌率为82.5％。双席夫碱壳聚糖衍生物的抑菌活性与取代基有关，苯环的接入明显提高了壳聚糖的抑制真菌的活性。