肝龙胶囊调控JAK-STAT转导抑制HBV的研究方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的研究方法。

背景技术：

hbv感染引起的慢性疾病病程长且难以彻底治愈，这与hbv易变异和hbv复制产生的共价闭合环状dna(covalentlyclossedcirculardna，cccdna)的稳定性有着密切的关系。目前常见的抗hbv药物有ifn-α和聚乙二醇化干扰素(peg-ifn)。临床上用于治疗乙型肝炎的化学药物主要为核苷类药物，如拉米夫定(lamivudine，lam)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil，adv)、恩替卡韦(entecavir，etv)、替比夫定(telbivudine，ldt)、克拉夫定(clevudine，l-fmau)、替诺福韦(tenofovir，tdf)等。

一些天然药物或中药也具有抑制hbsag、hbeag或hbvdna的作用。薛源观察了美洲大蠊提取物治疗阳性慢性乙型肝炎患者的效果，得出美洲大蠊提取物具有免疫调节、改善肝功能的作用，可降低慢性乙型肝炎患者血清中hbvdna含量，使hbeag转阴。研究药物抗hbv的作用机制可以为开发新的非核苷内药物提供一些参考。jak-stat信号通路是多种细胞因子发挥生物作用的一条重要信号转导通道，参与了细胞的增殖、分化、凋亡、免疫调节等过程。酪氨酸蛋白激酶jaks家族有四个成员，分别是：jak1、jak2、jak3、tyk2。jaks可被ifnα、ifnβ、白细胞介素(interleukin，ils)、表皮生长因子等细胞因子激活。stats是jaks的受体，含有sh1、sh2功能域，含有7个成员，分别是：stat1、stat2、stat3、stat4、stat5a、stat5b、stat6。jak-stat信号通路发挥抗病毒的过程如下：ils、ifns等与其受体结合，活化酪氨酸蛋白激酶jak1和tyk2，招募stat1、stat2，并使其磷酸化，激活的stat1和stat2结合成异源二聚体，再与isgf3γ结合成isgf3，isgf3与干扰素刺激应答元件结合后，启动干扰素刺激应答元件转录，继而产生抗病毒蛋白起到抗病毒的作用。

掌握肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的作用机制，可为临床合理、安全、有效用药提供理论参考，也为寻找理想的抗hbv药物提供理论依据。然而，肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的作用机制的研究内容有限，采用何种研究方法和研究手段以获得肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的作用机制是当前急需解决的问题。

技术实现要素：

本发明为了解决上述技术问题，提供了肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的研究方法，该研究方法为药物研发机构和科学工作者提供了一种研究jak-stat转导抑制hbv的作用机制的研究思路，为其研发治疗hbv的新药打下理论和实操的基础。

肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的研究方法，其特征在于，包括：

(a)采用cck-8法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞的tc50和tc0的步骤；

(b)采用elisa法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbsag和hbeag的滴度的步骤；

(c)采用fq-pcr法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液和细胞内hbvdna含量的影响的步骤；

(d)采用rt-qpcr法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞内stat1、stat2、isgf3、oas、pkrmrna表达的影响的步骤；

(e)western-blot法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞内oas、pkr蛋白表达的影响的步骤；

(f)采用rt-qpcr法检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中jak2、stat3mrna表达的影响的步骤；

步骤(a)～步骤(e)的实验结果联合分析。

进一步的，所述的步骤(a)～步骤(c)包括试剂配制和细胞培养，其中

试剂配制包括75％酒精的配制、pbs溶液的配制、dmem完全培养基的配制、含g418的完全培养基的配制、肝龙胶囊溶液的配制和拉米夫定溶液的配制；

细胞培养包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存。

进一步的，所述的步骤(a)包括种板密度筛选、hepg2.2.15细胞接种、对照组设置、肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞毒性作用的计算。

进一步的，所述的步骤(b)包括药物处理、细胞上清液hbeag检测和细胞上清液hbsag检测，其中

细胞上清液hbeag检测包括平衡试剂、配洗涤液、加上清液、加酶结合物、孵育、洗板、加显色剂、终止反应、酶标仪检测和计算抗原的抑制率；

细胞上清液hbsag检测包括平衡试剂、配洗涤液、加上清液、封板、孵育、加酶结合物、振荡、封板、加显色剂、振荡、封板、孵育、终止反应、酶标仪检测和计算抗原的抑制率。

进一步的，所述的步骤(c)包括细胞上清液hbvdna表达量的检测和细胞内hbvdna表达量的检测，其中

细胞上清液hbvdna表达量的检测包括样本处理、pcr扩增和质量控制；

细胞内hbvdna表达量的检测包括细胞内总dna提取和pcr扩增。

进一步的，所述的步骤(d)包括试剂配制、材料准备、总rna提取、逆转录、实时荧光定量pcr、琼脂糖凝胶制备、琼脂糖凝胶电泳验证，其中

试剂配制包括0.1％depc水的配制和75％乙醇溶液的配制；

材料准备包括塑料制品的准备和玻璃制品的准备；

实时荧光定量pcr包括stat1pcr、stat2pcr、isgf3pcr、oaspcr、pkrpcr和β-actinpcr。

进一步的，所述的步骤(e)包括试剂配制、蛋白样品制备和western-blot实验，其中，试剂配制包括10％sds溶液的配制、(2)sds-page电泳缓冲液的配制、30％丙烯酰胺-n，n’亚甲基双丙烯酰(acr-bis)(29:1)胺溶液的配制、1mol/mltirs-hcl(ph＝6.8)溶液的配制、1.5mol/mltirs-hcl(ph＝8.8)溶液的配制、1mol/mltirs-hcl(ph＝7.5)溶液的配制、10％过硫酸铵(ap)溶液的配制、10×tbs溶液的配制、tbst溶液的配制、转膜缓冲液的配制、1％丽春红染料溶液的配制和封闭液的配制；

蛋白样品制备包括细胞总蛋白提取和bca法测定总蛋白含量；

western-blot实验包括安装制胶装置、配制sds-page凝胶、煮蛋白、上样、电泳、切胶、活化pvdf膜、转膜、丽春红染色、封闭、一抗孵育、二抗孵育和cel显色。

进一步的，所述的步骤(f)包括引物合成、总rna提取、逆转录、实时荧光定量pcr、琼脂糖凝胶制备、琼脂糖凝胶电泳验证，其中

引物合成包括jak2和stat3引物设计；

实时荧光定量pcr包括jak2pcr、stat3pcr和β-actinpcr。

进一步的，所述的肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞毒性作用的计算公式如下：

细胞存活率＝[(od药物组-od空白组)/(od溶剂对照组-od空白组)]×100％；

细胞抑制率＝[1－(od药物组-od空白组)/(od溶剂对照组-od空白组)]×100％；

半数治疗浓度(tc50)计算公式：tc50＝antilog[b+(50％-<50％抑制百分率)/(>50％抑制百分率-<50％抑制百分率)×c]，

式中a＝log>50％抑制药物浓度，b＝log<50％抑制药物浓度，c＝a-b；

tc0＝细胞存活率>95％时药物最大浓度。

进一步的，所述的步骤(a)～步骤(e)的实验结果联合分析包括

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞生长抑制的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbeag水平和hbsag水平的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbvdna含量和细胞系中hbvdna含量的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat1、stat2、isgf3、oas、pkrmrna表达的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat1mrna、stat2mrna、oasmrna、pkrmrna和isgf3mrna表达的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中oas、pkr蛋白表达的影响分析；

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中jak2mrna和stat3mrna表达的影响分析。

本发明的有益效果是：提供了肝龙胶囊调控jak-stat转导抑制hbv的研究方法，该研究方法为药物研发机构和科学工作者提供了一种研究jak-stat转导抑制hbv的作用机制的研究思路，为其研发治疗hbv的新药打下理论和实操的基础。

附图说明

图1是提取的hepg2.2.15细胞内dna琼脂糖凝胶电泳图；图2是stat1扩增曲线；图3是stat1融解曲线；图4是stat2扩增曲线；图5是stat2融解曲线；图6是isgf3扩增曲线；图7是isgf3融解曲线；图8是oas扩增曲线；图9是oas融解曲线；图10是pkr扩增曲线；图11是pkr融解曲线；图12是stat3扩增曲线；图13是stat3融解曲线；图14是jak2扩增曲线；图15是jak2融解曲线；图16是β-actin扩增曲线；图17是β-actin扩增曲线；图18是jak2，stat3，β-actinpcr产物凝胶电泳图；图19是jak2，stat3，β-actinpcr产物凝胶电泳图；图20是肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中pkr、oas蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

1、实验用品

肝龙胶囊(昆明赛诺制药股份有限公司，lot：17012401)；拉米夫定片(江苏葛兰素史克制药(苏州)有限公司，lot：17020042)。

hepg2.2.15细胞株，由美国themountsinaimedicalcenter于1987年构建，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

2实验方法

2.1肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞的细胞毒性作用

2.1.1种板密度筛选

将处于对数生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数调整细胞密度为4×10⁵、2×10⁵、1×10⁵、8×10⁴、4×10⁴、2×10⁴、1×10⁴个/ml接种于96孔板中，每个密度3个复孔，细胞悬液终体积100μl，边缘各孔加入100μl的pbs缓冲液，防止边缘效应产生，将接种好的96孔板置于37℃、5％的co2培养箱中培养48h、96h、144h，每隔48h观察细胞的融合率及细胞生长状态，以确定细胞种板密度。

2.1.2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞的影响

将处于对数生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，于15ml离心管中制成细胞悬液，用细胞计数器计算细胞密度，于加样槽中调整细胞密度为6×10⁴个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。边缘各孔加入100μl的pbs缓冲液，防止边缘效应产生，接种好后置于37℃、5％的co2培养箱中培养24h，细胞融合形成单层后给药处理。

将96孔板中的细胞分为空白对照组，溶剂对照组，肝龙胶囊组：含8个浓度(20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、0.156mg/ml)，每个样本设3个复孔，空白对照组和溶剂对照组加入100μl完全培养基，肝龙胶囊组加入相应浓度的药物，终体积100μl，边缘孔加入100μl的pbs缓冲液，置37℃、5％的co2培养箱中继续培养48h、96h、144h后，在倒置显微镜下观察细胞形态，然后弃旧培养基，每孔用100μlpbs清洗2遍后加入cck-8试剂20μl，置37℃、5％的co2培养箱中继续培养1h后，用酶标仪检测其450nm波长处的吸光度值(od)。

2.1.3计算细胞存活率、细胞抑制率、细胞半数治疗浓度(tc50)和细胞最大无毒浓度(tc0)

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞的毒性作用采用下述公式计算：细胞存活率＝[(od药物组-od空白组)/(od溶剂对照组-od空白组)]×100％；细胞抑制率＝[1－(od药物组-od空白组)/(od溶剂对照组-od空白组)]×100％；半数治疗浓度(tc50)计算公式：tc50＝antilog[b+(50％-<50％抑制百分率)/(>50％抑制百分率-<50％抑制百分率)×c]，a＝log>50％抑制药物浓度，b＝log<50％抑制药物浓度，c＝a-b；tc0＝细胞存活率>95％时药物最大浓度。

2.2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbsag、hbeag水平及上清液中和细胞内hbvdna含量的影响

2.2.1药物处理

将处于对数期生长的hepg2.2.15细胞常规消化制成细胞悬液，用血细胞计数板计数，调节细胞密度为1×10⁵个/ml，接种于24孔板，终体积为600μl，置于37℃、5％的co2培养箱中培养24h后给药处理。将细胞分为细胞对照组，拉米夫定组(200μg/ml)，肝龙胶囊组：含5个给药浓度，依次是：1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml，每组每个样品3个复孔，每孔加入相应培养液600μl，置于37℃，5％的co2培养箱中培养，每48h更换一次相应培养基，于第48h、96h，144h后收集细胞上清液，分装于1.5mlep管中，作好标记，-80℃保存备用。

2.2.2细胞上清液hbeag检测

将-80℃冻存的第48h、96h，144h细胞上清液置于4℃冰箱解冻，并置室温平衡30min，严格按乙型肝炎病毒e抗原检测试剂盒说明书检测细胞上清液hbeag含量，具体操作步骤如下：

(1)平衡试剂：从4℃冰箱中取出试剂盒内全部瓶装试剂及微孔反应条，至于37℃平衡30min后置于室温，待用；(2)配洗涤液：精密量取洗涤液20ml加入含有480ml超纯水的烧杯中，用玻璃棒混合均匀，制成500ml工作浓度洗涤液，待用；(3)加上清液：于反应条内加入待测细胞上清液50μl，并设阴性对照组、阳性对照组、空白对照组，阴性对照组、阳性对照组各50μl，空白对照不作处理，每个样品3个复孔；(4)加酶结合物：于每孔中加入50μl酶结合物，空白孔除外；(5)孵育：充分混匀，用封片封板，置于37℃恒温箱中孵育30min；(6)洗板：弃去孔内液体，使用排枪将洗涤液注满各孔，静置5s，甩干，此操作重复5次后，用吸水纸吸干洗涤液；(7)加显色剂：每孔加显色剂a液、显色剂b液各50μl，充分混匀，封片封板，置于37℃恒温箱中孵育15min；(8)终止反应：每孔加入终止液50μl，充分混匀，于10min内完成测定；(9)酶标仪检测：用酶标仪检测od值，波长为450nm。(10)计算抗原的抑制率：

抑制百分率＝(od细胞组-od药物组)/od药物组×100。

2.2.3细胞上清液hbsag检测

将-80℃冻存的第48h、96h，144h细胞上清液至于室温解冻，并置室温平衡30min，严格按乙型肝炎病毒s抗原检测试剂盒说明书检测细胞上清液hbsag含量，具体操作步骤参照细胞上清液hbeag检测步骤，其中，计算抗原的抑制百分率：

抑制百分率＝(od细胞组-od药物组)/od药物组×100。

2.2.4细胞上清液hbvdna表达量的检测

将-80℃冻存的第48h、96h，144h细胞上清液至于室温解冻，严格按乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光法)说明书检测细胞上清液hbvdna含量，具体操作步骤如下：

(1)样本处理

取200μldna抽提a液于作好标记的0.5mlep管中，每管分别加入待检细胞上清液、阴性对照及强阳性对照各50μl；颠倒数次充分混匀，室温静置3min；每管加入200μldna抽提b液；颠倒数次充分混匀，13201×g离心10min，去上清；每管加入200μldna抽提c液；颠倒数次充分混匀，13201×g离心5min，吸弃上清；室温或55℃放置2-5min晾干；加入20μl样本稀释液溶解沉淀物，短暂离心使液体落于管底部，取上清备用。

(2)pcr扩增

(3)质量控制

阴性对照为阴性；强阳性对照：强阳性对照的定量值应为1×10⁵-5×10⁶iu/ml；临界阳性对照：临界阳性对照的定量值应为1×10³-1×10⁵iu/ml；定量标准品：标准曲线的线性r²≥0.97，且全部为阳性。

2.2.5细胞内hbvdna表达量的检测

细胞内hbvdna表达量的检测步骤参照细胞上清液hbvdna表达量的检测步骤。

2.3肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat1、stat2、isgf3、oas、pkrmrna表达的影响

2.3.1总rna的提取

(1)用4℃预冷的pbs将给药处理结束的细胞润洗2次，吸尽pbs，每个孔加入0.5mltrizol，吹打使细胞完全脱落，转移至1.5mlep管中，室温静置30min；(2)加入0.2ml氯仿，剧烈振摇15s，室温放置2-15min，4℃，13201×g，离心15min；(3)吸取上清液至depc水处理过的1.5mlep管中，加入等体积的异丙醇沉淀rna，摇匀后室温静置5-10min；(4)4℃，13201×g，离心l0min；(5)在管底可见白色沉淀，小心倾斜弃去上清；(6)取1ml75％的无水乙醇沿管壁加入，洗涤rna沉淀(不要丢失沉淀)，4℃，13201×g，离心10min，洗涤两次；(7)倒扣于吸水纸上，尽量除去75％的无水乙醇，室温倒扣放置30min，使rna沉淀挥干，但不要让rna沉淀干透；(8)加入适量无核酸水溶解rna沉淀；(9)用核酸蛋白仪测定总rna的纯度及浓度，od(a260)/od(a280)的比值范围应在1.8-2.0之间，提取的总rna应立即逆转录或-80℃冰箱中保存；

2.3.2逆转录

(1)冰上配制逆转录反应体系：

总rna模板1μg

oligo(dt)18引物：1μl

depc灭菌水：至总体积为12μl

(2)低速离心振荡混匀，离心30s，65℃孵育5min，冰浴5min后离心；

(3)置于冰上，依次加入反应物：

(4)低速振荡离心3s混匀，将反应体系置于42℃孵育反应60min，70℃终止反应5min，冰上冷却；(5)-20℃保存合成的cdna。

2.3.3实时荧光定量pcr

以下的引物瞬时离心30s左右，加入超纯水溶解引物，至引物终浓度为10pmol/μl，分装到200μlep管中，置于-20℃备用。

2.3.3.1stat1pcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-atcaggctcagtcggggaata-3′

reverseprimer：5′-tggtctcgtgttctctgttct-3′

(2)扩增目的基因片段大小：186bp；(3)配制反应液：

(4)realtimepcr三步法反应条件：

第一步：95℃预变性

95℃2min

第二步：pcr反应

第三步：融解曲线参数

65℃-95℃(10sec/cycle，0.5℃/cycle)60cycles

2.3.3.2stat2pcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-cagcaagttcaccgtccga-3′

reverseprimer：5′-ggtaaccaaagtcccaaatcaa-3′

(2)扩增目的基因片段大小：197bp；(3)配制反应液；(4)realtimepcr三步法反应。

2.3.3.3isgf3pcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-cactcagtccctctgtgctcc-3′

reverseprimer：5′-gcccgttgtagatgaaggtga-3′

(2)扩增目的基因片段大小：228bp；(3)配制反应液；(4)realtimepcr三步法反应。

2.3.3.4oaspcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-caaggtggtaaagggtggct-3′

reverseprimer：5′-caaacttcacggaaaatgctct-3′

(2)扩增目的基因片段大小：191bp；(3)配制反应液；(4)realtimepcr三步法反应。

2.3.3.5pkrpcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-gccttttcatccaaatggaattc-3′

reverseprimer：5′-gaaatctgttctgggctcatg-3′

(2)扩增目的基因片段大小：301bp；(3)配制反应液；(4)realtimepcr三步法反应。

2.3.3.6β-actinpcr

(1)引物：

forwardprimer：5′-tgactgactacctcatgaagat-3′

forwardprimer：5′-catgatggagttgaaggtagtt-3′

(2)扩增目的基因片段大小：296bp；(3)配制反应液；(4)realtimepcr三步法反应。

2.3.3.7琼脂糖凝胶电泳验证pcr产物

(1)称取0.6g的biowest琼脂糖凝胶粉末加入到含30ml0.5xtbe电泳缓冲液的三角烧瓶中，微波炉加热至琼脂糖完全融化；(2)将三角烧瓶从微波炉中转移至室温冷却至65℃左右时，加适量溴化乙锭(eb)，转动三角烧瓶使eb充分混匀，尽量减少气泡产生；(3)将制好的琼脂糖凝胶液倒入制胶板中，使琼脂糖凝胶液铺满制胶板，形成均匀的胶层；(4)室温放置30-45min，待凝胶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶层放于电泳槽内；(5)向电泳槽内加入约500ml电泳缓冲液，使其没过凝胶层1mm左右；(6)取pcr产物5μl和1μl的6xloadingburffer，混匀后上样，在第一个样品孔中加入6μl的dnamarker；(7)上样结束后，安装好电泳装置，调节电压为100v，电泳时间为60min左右，打开电源开关开始电泳，待溴酚蓝迁移至距凝胶底边2cm处左右时，关闭仪器；(8)电泳完成后，取出凝胶层，吸干其表面的电泳液，于凝胶成像系统中观察pcr产物条带，拍照并保存。

2.4western-blot检测肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中oas、pkr蛋白的表达水平

2.4.1蛋白样品制备

2.4.1.1细胞总蛋白提取

(1)药物处理后的细胞，吸弃旧培养基，用预冷的pbs清洗2遍，pbs预先灭菌置于4℃冰箱，吸干pbs，将六孔板置于冰上；(2)每孔加入ripa配制的裂解液100μl，轻拍六孔板使裂解液充满板底，置冰上充分裂解30min；(3)用干净的细胞刮将板底的细胞裂解碎片刮下，转移至1.5mlep管中；(4)4℃，13201×g，离心5min；(5)将细胞沉淀物吸出后，上清液转移至ep管中，-80℃保存备用。

2.4.1.2bca法测定总蛋白含量

(1)配制蛋白标准溶液：将30mgbsa标准品溶解于1.2ml蛋白标准配制液中，制成浓度为25mg/ml的蛋白标准存储液，充分溶解混匀后分装，保存于-20℃中，用时再稀释至需要浓度；(2)制作蛋白标准曲线：取0、1、2、4、8、10、12、16、20μl的0.5mg/ml的蛋白标准品加入到标记好的96孔板孔中，每孔用pbs补加至20μl，形成总浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.9mg/ml的标准品；(3)配制待测样品：取各组待测样品5μl，加入pbs15μl，使总体积为20μl；(4)配制bca工作液：计算样品数量，按50体积bca试剂a：1体积bca试剂b配制bca工作液，现用现配；(5)每个样品加入100μlbca工作液，轻拍96孔板混匀，于37℃中温育30min；(6)计算待测样品总蛋白浓度；孵育结束后，于酶标仪上测定562nm波长处的吸光度，据标准曲线计算蛋白浓度。

2.4.2western-blot实验

(1)安装制胶装置；(2)配制sds-page凝胶；(3)煮蛋白：取出30μg蛋白样品，按v样品：v蛋白上样缓冲液＝4：1的比例加入到200μl的pcr管中，标记好样品，放入105℃的金属浴中煮5min使蛋白变性；(4)上样：安装好电泳装置后，加满电泳液，内槽电泳液需加满，然后吸取3μl蛋白marker及各蛋白样品加入样品槽内，第一个样品槽加入蛋白marker；(5)电泳：打开电泳槽电源，调节电压为80v，电泳35min，当溴酚蓝泳动到分离胶与浓缩胶的分界面时，调节电压为100v，电泳80min左右，至溴酚蓝泳动至距胶下边缘1cm左右时关闭仪器；(6)切胶：取出玻璃板，用切胶刀切割所需的胶，将不要的部分丢弃；(7)活化pvdf膜：用剪刀剪取比胶大的pvdf膜，于摇床上活化5min，活化液为95％的甲醇，再用干净的tbst漂洗5min后，于转膜液中浸泡30min左右；(8)转膜：转膜滤纸剪好后于转膜液中浸泡30min左右。使用湿转法转膜，将转膜夹子打开，使夹子装置负极即黑色的一面保持水平，按顺序放上海绵垫、转膜滤纸、胶、活化好的pvdf膜、滤纸、海绵垫，注意每层间不能有气泡，将夹子合上，于转膜液中转膜。电流为350ma，转膜时间100min；(9)丽春红染色：取出pvdf膜，用tbst清洗5min，放入丽春红染料中染色5min，再用tbst漂洗，重复3次，观察染色结果，若染色无条带则重做；(10)封闭：tbst漂洗完全脱色后，依据marker的大小，找到目的蛋白所在蛋白的条带，剪去不要的pvdf膜，然后将pvdf膜放入5％的脱脂奶粉中常温孵育2h或4℃过夜；(11)一抗孵育：封闭结束后，pvdf膜用tbst漂洗3次，每次5min。β-actin一抗按照1：1000，oas和pkr一抗按1：1000分别用现配的5％脱脂奶粉配制成体积为2.5ml的一抗稀释液，将洗好的pvdf膜放入一抗稀释液中，4℃摇晃孵育过夜；(12)二抗孵育：一抗孵育结束后，pvdf膜用tbst漂洗3次，每次10min。二抗按照1：1000用5％脱脂奶粉配制成终体积为3ml的二抗稀释液，将洗好的pvdf膜放入二抗稀释液中，室温孵育2h；(13)cel显色：二抗孵育结束后，pvdf膜用tbst漂洗3次，每次10min。取辣根过氧化物酶hrp-ecl发光显色液a液和b液，按体积比为1:1混合后备用，显色液用量依据pvdf膜的大小及数量，打开凝胶成像系统电源，打开genesnap软件，调节好光源、焦距、放大倍数，将pvdf膜上多余的tbst溶液用吸水纸吸干，将pvdf膜放入凝胶成像系统的暗箱中，将显色液滴加到膜的表面，调节曝光条件，然后分析条带灰度值。

2.5肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中jak2、stat3mrna表达的影响

2.5.1引物合成

jak2和stat3引物设计，合成的引物用超纯水溶解，引物浓度为10pmol/μl。

2.5.2总rna的提取

(1)药物处理结束的细胞，吸尽培养基后，加入350μlrnalysis/2-mesolution至六孔板中，晃动六孔板使裂解液覆盖板底，置于室温2min后，吹打细胞至完全脱落，并将液体充分吹打混匀至无细胞团；(2)每孔加入等体积的70％乙醇，充分吹打混匀；(3)将上述细胞裂解液和乙醇的混合液转移至2ml收集管中，15493×g离心1min；(4)弃去收集管中废液，加入500μlrnawashsolutioni，15493×g离心1min；(5)弃去收集管中废液，在收集管膜中心加入82μldnaseisolution，室温放置15min；(6)再次加入500μlrnawashsolutioni至收集管中，15493×g离心1min；(7)弃去收集管中废液，加入600μlrnawashsolutionii至收集管中，15493×g离心1min，去掉滤液，此过程重复一次；(8)15493×g离心3min，去除残留的乙醇，将收集管转移至干净的1.5ml离心管中，于膜中心加入40μl无核酸水，静置1min后，15493×g离心1min，将液体转移至200μlep管中，-80℃保存备用。(9)用核酸蛋白仪测定总rna在260nm、280nm波长处的吸光度值a，测定其纯度及浓度，总rna纯度值应在1.8-2.0之间。

2.5.3pcr扩增

2.5.3.1jak2pcr扩增

(1)扩增目的基因片段大小：146bp；(2)配制反应液；(3)realtimepcr三步法反应。

2.5.3.2stat3pcr扩增

(1)扩增目的基因片段大小：201bp；(2)配制反应液；(3)realtimepcr三步法反应。

2.6统计分析

所有数据采用spss22.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准误表示，多组计量资料的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差数法(lsd)比较。

3实验结果

3.1肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞生长抑制的影响

不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后，对hepg2.2.15细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性。如表1所示。

表1肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞抑制作用的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与溶剂对照组比较；^**p<0.01，与溶剂对照组比较

3.2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbeag水平的影响

结果显示，肝龙胶囊能抑制hepg2.2.15细胞向上清液中分泌hbeag，其抑制作用呈时间、浓度依赖性。见表2。

表2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbeag抑制作用的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.3肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbsag水平的影响

肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbsag有抑制作用，且呈浓度依赖性。见表3。

表3肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbsag抑制作用的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.4肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbvdna含量的影响

如图1所示，肝龙胶囊能不同水平地降低hepg2.2.15细胞上清液和细胞中hbvdna的含量，随着药物剂量和作用时间的增加，降低上清液和细胞中hbvdna的能力增加。结果见表4。

表4肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞上清液中hbvdna表达量的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.5肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中hbvdna含量的影响

对于细胞内hbvdna的表达量，与空白对照组相比，肝龙胶囊能降低细胞中hbvdna的含量。结果见表5。

表5肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞内hbvdna表达量的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat1、stat2、isgf3、oas、pkrmrna表达的影响

3.6.1肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat1mrna表达的影响

由表6，图2，3结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对stat1mrna表达均有不同程度的调节作用。

表6肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中stat1mrna表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat2mrna表达的影响

由表7，图4，5结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对stat2mrna表达有不同程度的调节作用。

表7肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中stat2mrna表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.3肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中isgf3mrna表达的影响

由表8，图6，7结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对isgf3mrna表达呈不同程度的促进作用。

表8肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中isgf3mrna表达的影响(n＝3)

注：^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.4肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中oasmrna表达的影响

由表9，图8，9结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对oasmrna表达有不同程度的调节作用。

表9肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中oasmrna表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.5肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中pkrmrna表达的影响

由表10，图10，11结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对pkrmrna表达有不同程度的调节作用。

表10肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中pkrmrna表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.6肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中stat3mrna表达的影响

由qpcr结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对stat3mrna表达有不同程度的调节作用。

表11肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中stat3mrna表达的影响(n＝3)

注：^**p<0.01，与空白对照组比较

3.6.7肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中jak2mrna表达的影响

由qpcr结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对jak2mrna表达有不同程度的调节作用。

表12肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中jak2mrna表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

3.7肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中oas、pkr蛋白表达的影响3.7.1肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中oas蛋白表达的影响

由表13结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞后对oas蛋白表达均有不同程度的促进作用。

表13肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中oas蛋白表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较

3.7.2肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞系中pkr蛋白表达的影响

由western-blot结果显示，不同浓度肝龙胶囊作用于hepg2.2.15细胞对pkr蛋白表达均有不同程度的促进作用。结果见表14。

表14肝龙胶囊对hepg2.2.15细胞中pkr蛋白表达的影响(n＝3)

注：^*p<0.05，与空白对照组比较；^**p<0.01，与空白对照组比较

4、结论

肝龙胶囊可以抑制hepg2.2.15细胞向上清液中分泌hbsag、hbeag，降低细胞外和细胞内hbvdna的含量，具有一定的抗hbv的作用。肝龙胶囊可以促进jak-stat信号通路的stat1、stat2、isgf3、oas、pkr、jak2、stat3mrna和oas、pkr蛋白的表达，其抗hbv的作用机制是通过调控jak2-stat3信号转导通路而发挥作用的。