一种关于水稻柱头外露主效QTL位点的分子标记方法与流程

本发明属于分子遗传育种学领域，涉及水稻柱头外露主效qtl位点的分子标记方法，主要用于杂交水稻不育系的柱头外露高低的分子标记辅助改良以及种质资源的创新利用。

背景技术：

我国北方杂交粳稻由于异交性差而制种产量低，发展一直很缓慢。而不育系的柱头外露率是三系、两系育种体系中决定杂交制种产量的关键因素，水稻柱头外露特性一直是不育系选育中的重要性状。在育种过程中设法提高粳型不育系的柱头外露率，将有效地改善粳型不育系的异交特性，提高杂交制种产量，大大推动杂交粳稻的发展。水稻柱头外露率的遗传较为复杂，是受多基因控制的数量性状，较易受到环境的影响，但主要受遗传因素控制。随着分子生物学的发展和基因组计划的实施，水稻数量性状的qtl研究取得了重大进步，当前研究已逐渐从对某一目标性状的初步定位走向精细定位、图位克隆以及生物学功能分析。国内外学者利用dna分子标记技术对控制水稻柱头外露率qtl的定位研究报道已有很多。近几年，国内外不同学者分别采用不同的亲本材料、作图群体、分子标记等，分析得到不同的与柱头外露率相关的qtl位点达70多个，且水稻12条染色体上都有检测到与柱头外露率相关的qtl。联合分析结果表明，miyatam.等在第3号染色体上检测到的一个qtl(qes3)，其贡献率达31.63％，被认为是一个主效qtl，其他研究者检测到的qtl的贡献率普遍较低。以上研究只停留在对于水稻柱头外露qtl定位的初步探索阶段，但未对某一主效qtl进行精细定位及克隆。

2011年，norikotakano-kai等报道gs3同时也是与水稻柱头外露率相关的qtl，并且该qtl与miyatam.等检测到的qes3位于第3号染色体同一区间内，而gs3是chuchuanfan等在2006年在第3号染色体上检测到的一个与粒长和粒重相关的主效qtl，这一研究结果对揭示水稻柱头外露分子机理是一个很大的进步。

技术实现要素：

本发明的目的是首先找到控制柱头外露主效qtl的分子标记，通过检测与主效qtl位点连锁的分子标记，可以确定有无控制柱头外露的主效位点导入到育种品系中，提高杂交水稻不育系改良的目的性与有效性；提高该性状的选择效率、加快育种进度。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

水稻柱头外露主效qtl位点qpes-3b的分子标记方法，其特征在于以下步骤：

(1)取水稻叶片，提取高柱头外露亲本ds及低柱头外露亲本c9083及后代群体的dna。

(2)利用rm15206和gs09中一个或两个分子标记引物对所述的基因组dna进行pcr扩增，pcr扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的dna片段，标志着qpes-3b增效等位变异位点的存在。

其中，所述的pcr反应：体积为10μl，其中10×pcrbuffer(25mmol/lmg²⁺)1μl，引物对(2μm)1μl，dntp(10mm)0.2μl，taq酶(5u/μl)0.25μl，模板(10-100ng/μl)1.5μl，加水至10微升。pcr反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

(3)pcr扩增产物的检测

indel分子标记gs09与ssr分子标记rm15206的上下游引物扩增水稻品种ds或ds与c9083的杂交后代的基因组dna，如果能够扩增出亲本ds的扩增片段，则标志着ds的增效等位变异qpes-3b的存在；如果扩增出另一个亲本的谱带，则表明增效基因位点没有导入。在2000个f2分离群体中，用交换配子数计算，此标记与柱头外露的主效qtl是紧密连锁的，单标记选择效率达98％。

上述两个标记对qpes-3b的选择效率在98％以上，上述两个标记可以择一使用或两个标记组合使用，选择效率可以达到100％。

主要结果：

本发明所提供的水稻柱头外露主效qtl位点的分子标记方法，具有以下特点：

(1)通过本发明的分子标记定位了位于第3染色体上来自高柱头外露ds的主效qtl新位点qpes-3b，并获得了与其紧密连锁的indel标记gs09和ssr标记rm15206。

(2)通过本发明分子标记定位的柱头外露qpes-3b的位置准确、精细，鉴定方法快速简便，选择效率高。只需检测这些标记的扩增条带特征，可以判定柱头外露主效qtl位点qpes-3b的增效变异存在与否，以此预测水稻柱头外露的表型。有目的性的筛选柱头外露高的品种或品系，用于改良杂交水稻不育系的柱头外露率。

(3)辅助选择目标明确，不受环境影响。在传统育种方法中，首先要收集具有高柱头外露的亲本与骨干亲本进行一系列的杂交，回交，对水稻柱头外露表型鉴定要等到开花期，表型对柱头外露也有一定的影响。通过分子标记检测柱头外露主效qtl位点，可以在苗期就鉴定柱头外露较高的单株，淘汰其它单株，可以有效的控制育种规模，提高柱头外露育种的进程和选择效率。

附图说明

图1：ds/c9083后代群体在第3染色体柱头外露qtls位点初定位。

图2：ds/c9083后代群体在第3染色体柱头外露qtls位点精细定位及qpes-3b在图中位置

图3：新开发的与qpes-3b紧密连锁的indel标记gs09多态性电泳条带。

具体实施方式

(一)材料与方法：

1.材料：高柱头外露种质ds与粳稻品种c9083杂交，种植杂交种，自交获得f2分离群体，用于柱头外露qtl检测与定位。

2.用sds法提取个体基因组dna。

3.多态标记筛选：用600对ssr引物对，以ds与c9083的dna为模板，进行pcr扩增，筛选多态性标记。

4.pcr反应：体积为10μl，其中10×pcrbuffer(25mmol/lmg²⁺)1μl，引物对(2μm)1μl，dntp(10mm)0.2μl，taq酶(5u/μl)0.25μl，模板(10-100ng/μl)1.5μl，加水至10μl。pcr反应程序为94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。在600对ssr引物中有101对引物扩增产物在亲本间存在多态，用于连锁图构建和qtl检测。

5.利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为mapmaker3.0，最小lod值设为3，获得连锁图谱；利用winqtlcart2.5软件对柱头外露性状进行了初步定位。

6.标记开发：在初定位区设计新的indel标记及筛选新的ssr标记，见表1，在双亲间进行多态性分析，pcr反应和反应程序同步骤4的pcr扩增体系，获得gs09、rm15206等多态性标记。

表1.ds/c9083在第3染色体上初定位区间的多态性标记

7.f2群体中选择539个单株，对其表型柱头外露率进行调查，用新设计的及筛选的新的ssr标记对后代单株进行qtl精细定位，得到qpes-3b位点，并获得与其紧密连锁的标记。

(二)结果与分析

ds(柱头外露率80.68％)与c9083(柱头外露率低于4.65％)杂交、自交获得f2分离群体。利用分布于12条染色体的101个ssr多态标记，在f2代的168个个体，建立分子标记图谱。利用winqtlcart2.5软件对柱头外露进行了qtls定位，采用复合合区间作图法，抽样1000次迭代来确定lod值。qtls分析表明，控制qtl主效的qtls分布于第3染色体，其中贡献率最大的qtl位于rm15128～ac099323之间，如图1所示。

采用构建的新的回交群体，结合新筛选出的标记，缩小定位区间。利用ds/c9083的bc1f2群体，将目的qtl定位在rm15206～gs09之间，如图2所示

从ds/c9083的bc2f2群体中，通过分子标记选择，挑选目标区域较小，背景单一，整株表型接近c9083的个体与c9083回交，在bc3f1群体中，通过分子标记选择，挑选含有目的区域、背景接近c9083的个体，收取单株种子，种植形成bc3f2群体500株。

对500株分离个体的表型鉴定与标记分析，结果：在分离群体中，柱头外露率高的单株均含有gs09及rm15206分子标记所扩增的ds的带型。这说明gs09及rm15206与控制柱头外露主效位点qpes-3b紧密连锁。

通过检测与控制柱头外露主效基因位点连锁的分子标记，可以确定有无控制柱头外露的主效qtl位点导入到育种品系中，提高粳稻不育系柱头外露的选择效率，加快育种进度。利用与qpes-3b紧密连锁的标记gs09、rm15206进行单标记选择，选择效率可达到99.7％-100％，双标记组合选择效率均达到100％，可用于分子标记辅助选择育种。