本发明涉及一种机突变获得的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。
(二)
背景技术：
β-丙氨酸是自然界中天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，又被称作为β-氨基丙酸或者3-氨基丙酸。β-氨基酸是一种潜在的功能性氨基酸。在工业上，β-氨基酸作为一种非常重要的前体物质，在医药、保健品、化工产品、食品及饲料等方面均有广泛应用。在医药方面，β-丙氨酸广泛应用于合成泛酸和泛酸钙，也是合成肌肽的主要前体物质。β-丙氨酸还可用于合成帕米磷酸二钠，用于缓解肿瘤肿瘤性骨痛和治疗高血钙症，以及用于合成巴柳氮治疗结肠炎和直肠炎。在化工产品方面，在食品和饲料方面，β-丙氨酸可作为调味剂，运动营养补充剂，还能提高动物肉制品质，满足市场对瘦肉的需求。在化工产品方面，β-丙氨酸可用于合成沉淀剂，制备电镀缓蚀剂和铅中毒解毒剂。
目前国内外产β-丙氨酸主要是化学合成法与生物法。
化学合成主要是丙烯腈法、丙烯酸法以及琥珀酰亚胺降解法。化学法虽然反应效率高，生产速率快，但是需要强酸强碱以及高温高压的条件，污染环境。且副反应复杂，对后期纯化也有一定的影响。
生物法合成β-丙氨酸主要有酶法和代谢法。酶法有有机腈降解酶催化β-氨基丙腈和l-天冬氨酸-α-脱羧酶作用下合成丙氨酸。以l-天冬氨酸为底物，在和l-天冬氨酸-α-脱羧酶作用下，脱去α位羧基生成β-丙氨酸，目前也被广泛运用与工业合成β-丙氨酸。
目前l-天冬氨酸-α-脱羧酶的研究越来越多，大部分的研究主要集中到escherichiacoli、corynebacteriumglutamicum、bacillussubtilis、mycobacteriumtuberculosis等微生物。高丽娟等将大肠杆菌pand基因转至bl21(de3)中进行高效表达，研究酶转化l-天冬氨酸生成β-丙氨酸的催化能力，每升发酵液酶活达到225u。石增秀等将谷氨酸棒杆菌l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因在大肠杆菌bl21(de3)中诱导表达，重组酶比酶活达到156mmol·g-1·h-1。
本发明旨在对triboliumcastaneum来源的l-天冬氨酸α脱羧酶进行随机突变，提高酶活、产量及催化稳定性，提高其工业应用价值和生产效率。
(三)
技术实现要素：
本发明提供了一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其在偏中性条件下，生物合成β-丙氨酸的酶活有明显的提高。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，所述突变体是将seqidno.1所示氨基酸序列第98位、305位、451位、111位、139位、403位、469位、372位、325位进行单突变或多突变获得的。
进一步，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体为下列之一：(1)seqidno.1所示氨基酸第469位的丝氨酸突变为脯氨酸(pands469p)；(2)seqidno.1所示氨基酸第111位的脯氨酸突变为丝氨酸(pandp111s)；(3)seqidno.1所示氨基酸第139位的谷氨酰胺突变为脯氨酸(pandq139p)；(4)seqidno.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸(pandr98h-k305e)；(5)seqidno.1所示氨基酸第372位的颉氨酸突变为谷氨酸、403位半胱氨酸突变为亮氨酸(pandv372e-c403l)；(5)seqidno.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸、第451位的异亮氨酸突变为颉氨酸(pandr98h-k305e-i451v)；(6)seqidno.1所示氨基酸第325位的色氨酸突变为精氨酸(pandw325r)。
上述任一突变体基因同源性70％以上的核苷酸序列或其编码酶同源性80％以上的氨基酸序列均属于本发明要求保护的范围。
本发明还提供一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体编码基因及其构建的工程菌，所述工程菌是将突变体编码基因的核苷酸序列以pet28a为表达载体，以大肠杆菌bl21(de3)为表达宿主构建获得的。
本发明提供一种所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在转化l-天冬氨酸生产β-丙氨酸中的应用，所述的应用为：以含l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以l-天冬氨酸为底物，以ph7.0磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在37℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，获得β-丙氨酸转化液，分离提取，获得β-丙氨酸。
进一步，所述转化体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为1-10g/l(优选10g/l)，所述底物终浓度为50-100g/l(优选50g/l)。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体基因的工程菌接种于含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h；获得种子液；将种子液以体积浓度2％接种量转接于含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，在37℃，200r/min下培养至od600在0.6-0.8，加入终浓度0.2mm异丙基硫代半乳糖苷，然后30℃，200r/min诱导表达培养12h，在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体细胞。
本发明所述lb培养基组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，溶剂为去离子水，ph值自然；所述lb固体培养基组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂1％-2％，溶剂为去离子水，ph值自然。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明获得的随机突变改造的l-天冬氨酸-α-脱羧酶通过取代具有氨基酸序列为seqidno.1的来源于triboliumcastaneum的l-天冬氨酸-α-脱羧酶的第98位，305位，451位氨基酸位点，获得了比原始酶更高的酶活力和催化稳定性。
本发明通过比较突变体酶pandr98h-k305e、pandr98h-k305e-i451v和未突变酶在偏中性条件下的催化能力，结果发现在ph7.0条件下，突变体酶pandr98h-k305e、pandr98h-k305e-i451v催化l-天冬氨酸生成β-丙氨酸的转化率分别为未突变酶的3.33倍、2.76倍。
本发明构建了两个有意义的突变体，实现了l-天冬氨酸-α-脱羧酶酶活以及稳定性的提高。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。
实施例1：利用随机突变构建l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体文库
利用易错pcr试剂盒(该试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司)在体外向l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因pand(核苷酸序列为seqidno.2所示，氨基酸序列为seqidno.1所示)引入核苷酸突变。
易错pcr反应条件及引物(30μl体系)：
浓度1ng/μl的l-天冬氨酸-α-脱羧酶基因(seqidno.2)dna模板1μl，浓度10μm的引物1和引物2各1μl，10×的易错pcrmix3μl，10×的易错pcr专用dntp3μl，易错pcr专用mncl24μl，易错pcr专用dgtp2μl，5u/μl易错pcr专用taqdna聚合酶0.5μl，超纯水14.5μl。
引物1:taagaaggagatataccatgggcatgcccgctaccg
引物2：gtggtggtggtggtgctcgagtaagtccgagccaagacg
其中引物1酶切位点为ncoi(引物中下划线部分)，引物2的酶切位点为xhoi(引物中下划线部分)。
pcr反应条件为：预变性94℃，3min，然后进入温度循环94℃，1min；60℃，1min；72℃，1min；共30个循环，终止温度为4℃。
易错pcr扩增后产物经内切酶dpni37℃消化1h，去除模板dna。用ncoi和xhoi限制性内切酶对载体pet28a进行双酶切。消化后的pcr产物以及双酶切后的载体用纯化试剂盒纯化后，用一步克隆试剂盒37℃连接30min。转化bl21(de3)感受态细胞，转化产物均匀涂布在含有100μg/ml卡那霉素的琼脂平板上，经37℃过夜培养，构建突变体文库。所述琼脂平板组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂1％-2％，溶剂为去离子水，ph值自然。
实施例2：突变体文库筛选
对实施例1得到的转化子进行如下操作：
1、96孔板突变文库的建立：用灭菌的枪头挑选平板上的3000个转化子接种于加有500μl含100μg/ml卡那霉素lb培养基的96深孔板中，每孔对应一个转化子。同时以ecolibl21(de3)/pet28a、ecolibl21(de3)/pet28a-pand作为对照接种于96深孔板中。37℃，200r/min振荡培养24h。
2、文库的诱导表达：无菌条件下，从步骤1的96深孔板中取50μl种子液，转接到加有500μl含100μg/ml卡那霉素+0.2mm异丙基硫代半乳糖苷的lb培养基的另一96深孔板中，30℃，200r/min振荡培养24h进行表达。4000r/min离心10min，弃上清液，收集菌体。加入150μl细胞破碎液(内含ph7.4的pbs缓冲液，1mg/ml溶菌酶)，混匀，37℃，-80℃反复冻融三次破壁。4000r/min离心15min，取破壁上清液，即粗酶液。
3、突变文库酶活表征：往步骤2中96深孔板中所得的粗酶液中加入500μlph7.0，50g/l的底物l-天冬氨酸溶液(用naoh调ph至7.0)，混匀后37℃反应。利用排枪每孔取反应液2.5μl，加入150μlph9.5、0.2m的硼酸钠缓冲液，2.5μl邻二乙酰基苯的甲醇溶液，2.5μlβ-巯基乙醇的乙醇溶液。激发波长355nm，发射波长445nm，每4min测定一次荧光值，取2h内最高的荧光值即产物β-丙氨酸的值。
4、经过步骤3初筛出7株酶活较原始菌有提高的菌株，分别是ecolibl21(de3)/pet28a-pands469p(seqidno.1所示氨基酸第469位的丝氨酸突变为脯氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandp111s(seqidno.1所示氨基酸第111位的脯氨酸突变为丝氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandq139p(seqidno.1所示氨基酸第139位的谷氨酰胺突变为脯氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e(seqidno.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandv372e-c403l(seqidno.1所示氨基酸第372位的颉氨酸突变为谷氨酸、403位半胱氨酸突变为亮氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e-i451v(seqidno.1所示氨基酸第98位的精氨酸突变为组氨酸、第305位赖氨酸突变为谷氨酸、第451位的异亮氨酸突变为颉氨酸)、ecolibl21(de3)/pet28a-pandw325r(seqidno.1所示氨基酸第325位的色氨酸突变为精氨酸)。
5、突变体酶复筛：将步骤4中初筛得到的突变体进行摇瓶培养复筛。将孔板筛选得到的突变体接种到含100μg/ml卡那霉素的lb培养基过夜培养，以2％(v/v)接种量转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基，37℃，200r/min下培养至od600在0.6-0.8，加入终浓度0.2mm异丙基硫代半乳糖苷，30℃，200r/min诱导表达培养12h。然后在4℃下10000rpm离心10min，收集重组菌的菌体细胞。所得的湿菌体用50mm的ph8.0的tris-hcl缓冲液重悬，经超声波破碎(超声2s，间隔6s，有效超声时间10min)，离心去除细胞碎片，所得的上清液即为粗酶液。
取上一步得到的粗酶液进行催化。催化反应体系(1ml)：0.1m磷酸盐缓冲液920μl，50g/l的l-天冬氨酸(用naoh调ph至7.0)，粗酶液30μl。37℃，200rpm金属浴振荡20min，加入2m的naoh100μl溶液终止反应。
取上一步的反应液用2,4-二硝基氟苯衍生化后采用高效液相色谱(hplc)检测反应生成的β-丙氨酸的含量。
hplc检测方法：色谱柱为welchromc18(4.6mm×250mm)紫外检测波长为360nm，流速为1ml/min，进样量为10μl，柱温40℃，流动相为乙酸钠与甲醇1:1配比混合。
l-天冬氨酸-α-脱羧酶酶活的定义：1分钟内反应生成1μmβ-丙氨酸所需的酶量为一个酶活单位。
实验结果表明，相较于原始未突变菌株比酶活7.6u/mg，有4株突变菌株比酶活下降，具体的，pandp111s比酶活3.35u/mg、pandq139p比酶活4.97u/mg、pandv372e-c403l比酶活4.51u/mg、pandw325r比酶活5.63u/mg。有3株突变菌株比酶活提高，其中，pands469p比酶活12.24u/mg，较未突变菌株仅提高了5％，pandr98h-k305e比酶活为12.24u/mg，是未突变酶的1.61倍。pandr98h-k305e-i451v比酶活为10.87u/mg，是未突变酶的1.43倍。
实施例3：突变体酶pandr98h-k305e、pandr98h-k305e-i451v高效表达
分别将实施例2得到的突变菌株ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e、ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e-i451v与未突变酶的对照菌株ecolibl21(de3)/pet28a-pand进行如下操作：
1、将突变菌株ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e、ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e、ecolibl21(de3)/pet28a-pandr98h-k305e-i451v与未突变菌株ecolibl21(de3)/pet28a-pand分别接种于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200r/min振荡培养12h。
2、取步骤1得到的种子液，以2％接种量(v/v)转接于50ml含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中，在37℃，200r/min下培养至od600在0.6-0.8，加入终浓度0.2mm异丙基硫代半乳糖苷，然后30℃，200r/min诱导表达培养12h。在4℃下10000rpm离心10min，收集菌体细胞。
3、取步骤2得到的菌体细胞进行催化，催化反应体系(10ml)为：终浓度50g/l的l-天冬氨酸(用naoh调ph至7.0)，湿菌体0.1g，以ph7.0磷酸盐缓冲液为反应介质。37℃、200rpm反应12h，每两小时取一次样，经2,4-二硝基氟苯衍生化后进行hplc检测。
实验结果表明突变体酶pandr98h-k305e、pandr98h-k305e-i451v的β-丙氨酸产量分别是未突变酶的3.33倍、2.76倍，且突变体酶较未突变酶的性质稳定。
序列表
<110>浙江工业大学
<120>一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其应用
<160>2
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