一种高效的多重荧光定量PCR试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于分子和细胞生物学领域，特别涉及高效多重荧光定量pcr检测。
背景技术：
：荧光定量pcr(realtimefluores-cencequantitativepcr)是1996年由美国appliedbiosystems公司推出的一种新型定量试验技术，其运用非常广泛，不仅可以用于mrna表达的研究、单核苷酸多态性(snps)的测定、病原体的测定、肿瘤研究以及免疫组分分析等医疗方面，还可以用于新药开发、药物疗效研究以及新型诊断及检验试剂的开发等药物研究领域。染料法荧光定量pcr最常用sybrgreeni作为dna的结合染料，这是一种dna小沟非饱和性结合染料，与dna结合时可产生荧光，而游离时不产生荧光，每形成一条dna双链，就会有一定数量的染料结合上去，从信号的累积来对产物进行定量。虽然这种方法具有价格便宜，适用性广的优点，但是其特异性差，不能区分扩增产物与非特异性扩增，更不能对不同目标产物进行分别定量，这些不足使得染料法荧光定量pcr的运用受到一定的限制。而探针法的荧光定量pcr则完全弥补了这些不足，多重荧光定量pcr更是实现同时对多个目标产物进行定量。由于多重扩增具有偏好性，且各产物间相互干扰性较强，故普通探针法的荧光定量pcr试剂并不能用于多重荧光定量pcr，所以对多重荧光定量试剂的优化就显得很必要。技术实现要素：为了解决上述现有各种方法的不足，本发明其中一方面开发了一种高效的多重荧光定量pcr反应液及试剂盒、制备方法和荧光定量pcr方法。通过对试剂灵敏度及扩增性能的检测，发现本研究提供的多重荧光定量pcr试剂具有比传统试剂更高的灵敏度及扩增性能。本发明优化了多重荧光定量pcr反应液，特别是通过加入一些特定的添加剂，如一定比例的甘油、bsa和dtt等，提高了反应的灵敏度、特异性及稳定性。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,该高效的多重荧光定量pcr反应液包含基础缓冲液和蛋白质保护液。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,上述蛋白质保护液包含甘油、bsa和dtt。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,所述基础缓冲液的成分包含tris-hcl、dntps、kcl、(nh4)2so4、mgcl2。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,上述多重荧光定量pcr反应液由tris-hcl溶液、dntps溶液、kcl溶液、(nh4)2so4溶液、mgcl2溶液、bsa溶液、甘油溶液和dtt溶液组成。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,该多重荧光定量pcr反应液包含200～700mmph8.3tris-hcl、0.3～1.5mmdntps、25～75mmkcl、75～200mm(nh4)2so4、12～20mmmgcl2溶液和8％～25％的甘油。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr反应液,该多重荧光定量pcr反应液还可以由50～150μl2mtris-hclph8.3溶液，5～20μl25mmdntps溶液，5～15μl2mkcl溶液，15～40μl2m(nh4)2so4溶液，10～20μl0.5mmgcl2溶液，10～30μl质量分数为5％的bsa溶液，70～200μl质量分数为50％的甘油溶液和3～10μl1mdtt溶液组成。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒,该多重荧光定量pcr试剂盒包上述的任意一种多重荧光定量pcr反应液。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒,上述多重荧光定量pcr试剂盒还包含引物对、探针、热启动dna聚合酶。本发明的其中一方面提供了质粒构建信息，载体为pet30(a)，插入目的序列如seqidno.1。5’-tcagtggtggtggtggtggtgctcgagctggttcttgacaaagcttttgaggtcctcaagaaaggtgatatattcctggtgctccagggctgtgctgagctccaccaactcatccgcaaaagtgttatccacccctcggtccgcaaggaaatccattaggtggtcatacaaggcccagtccagggaatctgtgttgagtgtatagtttgtatccctccactcagagtcaccagtggcctgaaagctaacttccttgatagagaaaatatcactctcggcctcatcttcgtgtccaatctcatcctcaggatagtgacagtccagtacaagggtcttcttgccatcagtctttgtaacttcaaccacaaagttgggagttgatgtcagttctggctcctgttcttcagccttctgcccctgtgagggctcctcctcaccatcaaatgttggagggatgctgttgttgatgttgaaagtgaccgtgatcttttctccggcaactttgcgcaataatttagcctccgtgccgttcacctccagctcccaatctccagacatcttgggaagggacttgtgtttctggatcttcttttcttccttaatttcatcagtcaagaattcaacgaaggccttgtctccttccgtgtgcagcat-3’。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒,引物对为引物f和引物r，引物f序列如seqidno.2,引物r序列如seqidno.3，探针序列如seqidno.4。引物f:5’-ccagtccagggaatctgtgt-3’引物r:5’-gaagatgaggccgagagtga-3’探针：5’-ccctccactcagagtcaccagtggcc-3’本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒的制备方法,混合200～700mmph8.3tris-hcl、0.3～1.5mmdntps、25～75mmkcl、75～200mm(nh4)2so4、12～20mmmgcl2溶液和8％～25％甘油等成分制备多重荧光定量pcr反应液，本发明的高效的多重荧光定量pcr试剂盒包含多重荧光定量pcr反应液。本发明的其中一方面提供了一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒的制备方法,制备方法为混合50～150μl2mtris-hclph8.3溶液、5～20μl25mmdntps溶液、5～15μl2mkcl溶液、15～40μl2m(nh4)2so4溶液、10～20μl0.5mmgcl2溶液、10～30μl质量分数为5％的bsa溶液、70～200μl质量分数为50％的甘油溶液和3～10μl1mdtt溶液组成多重荧光定量pcr反应液，再准备剩余组分备用。本发明还提供了一种高效的多重荧光定量pcr方法，使用上述任意一种所述的多重荧光定量pcr反应液或多重荧光定量pcr试剂盒进行多重荧光定量pcr检测。通过对试剂灵敏度及扩增性能的检测，发现发明提供的多重荧光定量pcr试剂具有比传统试剂更高的灵敏度及扩增性能。附图说明图1、为本发明其一个实施例中实验组扩增曲线；图2、为本发明其中一个实施例中验组荧光定量标准曲线；图3、为本发明其中一个实施例中对照组扩增曲线；图4、为本发明其中一个实施例中对照组荧光定量标准曲线；图5、为本发明其中一个实施例中实验组多重荧光pcr扩增曲线；图6、为本发明其中一个实施例中对照组多重荧光pcr扩增曲线。具体实施方式下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。实施例1：高效的5×多重荧光定量pcr反应液的配置一种高效的5×多重荧光定量pcr反应液，主要由基础缓冲液和蛋白质保护液组成，具体成分包括：50～150μl2mtris-hclph8.3溶液，5～20μl25mmdntps溶液，5～15μl2mkcl溶液，15～40μl2m(nh4)2so4溶液，10～20μl0.5mmgcl2溶液，10～30μl质量分数为5％的bsa溶液，70～200μl质量分数为50％的甘油溶液和3～10μl1mdtt溶液。实施例2：高效的5×多重荧光定量反应液的灵敏度检测1.模板的稀释方式2.pcr扩增程序3.引物和探针序列f:ccagtccagggaatctgtgtr:gaagatgaggccgagagtga探针：ccctccactcagagtcaccagtggcc4.反应体系pcr反应体系20μl5×多重荧光定量反应液4μl引物f/r(10μm)0.8μl/0.8μl探针(10μm)0.4μl热启动dna聚合酶(5u/μl)0.25μl模板1μldepc水12.75μl5.建立标准曲线对实验结果进行分析并制作标准曲线，标准曲线的y轴为各个标准品的ct值，标准曲线的x轴为各个标准品对应的log10(拷贝数)，依次对应为log10(标准品1)＝7.51,log10(标准品2)＝6.51,log10(标准品3)＝5.51,log10(标准品4)＝4.51,log10(标准品5)＝3.51,log10(标准品6)＝2.51。6.实验组和对照组灵敏度结果检测本实验对照品为菲鹏产品(md026)。图1为实验组扩增曲线，图2为实验组荧光定量标准曲线，图3为对照组扩增曲线，图4为对照组荧光定量标准曲线，表一为实验组在不同模板下的ct值，表二为对照组在不同模板下的ct值。从扩增曲线图可看出本试剂盒比对照具有更高的灵敏度，从标准曲线图可看出本试剂盒具有良好的扩增性能。表一表二模板ct值标准品115.56标准品219.02标准品322.35标准品425.62标准品529.11标准品632.15阴性32.85实施例3：高效的5×多重荧光定量反应液的使用1.反应体系2.反应条件3.多重扩增实验结果图5为实验组扩增曲线，图6为对照组扩增曲线，表三为实验组的ct值，表四为对照组的ct值。从扩增曲线图可看出本试剂盒比对照具有更高的灵敏度。表三通道ct值fam19.18hex20.67rox16.70cy513.98表四上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。序列表<110>吴江近岸蛋白质科技有限公司<120>一种高效的多重荧光定量pcr试剂盒及其制备方法<130>2018<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>654<212>dna<213>artificialsequence<220><221><223>人工设计<400>1tcagtggtggtggtggtggtgctcgagctggttcttgacaaagcttttgaggtcctcaag60aaaggtgatatattcctggtgctccagggctgtgctgagctccaccaactcatccgcaaa120agtgttatccacccctcggtccgcaaggaaatccattaggtggtcatacaaggcccagtc180cagggaatctgtgttgagtgtatagtttgtatccctccactcagagtcaccagtggcctg240aaagctaacttccttgatagagaaaatatcactctcggcctcatcttcgtgtccaatctc300atcctcaggatagtgacagtccagtacaagggtcttcttgccatcagtctttgtaacttc360aaccacaaagttgggagttgatgtcagttctggctcctgttcttcagccttctgcccctg420tgagggctcctcctcaccatcaaatgttggagggatgctgttgttgatgttgaaagtgac480cgtgatcttttctccggcaactttgcgcaataatttagcctccgtgccgttcacctccag540ctcccaatctccagacatcttgggaagggacttgtgtttctggatcttcttttcttcctt600aatttcatcagtcaagaattcaacgaaggccttgtctccttccgtgtgcagcat654<210>2<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><221><223>人工设计<400>2ccagtccagggaatctgtgt20<210>3<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><221><223>人工设计<400>3gaagatgaggccgagagtga20<210>4<211>26<212>dna<213>artificialsequence<220><221><223>人工设计<400>4ccctccactcagagtcaccagtggcc26当前第1页12