本发明涉及用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和重组微生物。本发明的微生物经以下方式修饰：通过过表达磷酸转酮酶活性增加基于碳源的乙醇酸和/或乙醛酸产率。本发明的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物和一步的乙醇酸或乙醛酸的生物学或化学转化。
背景技术：
：羧酸是含有至少一个羧基的有机化合物。羧酸广泛存在，并且包括例如氨基酸(其组成蛋白质)和乙酸(其是醋的一部分并且出现在新陈代谢中)。羧酸用于产生聚合物、药物、溶剂和食物添加剂。工业上重要的羧酸包括乙酸(醋的组分，溶剂和涂料的前体)、丙烯酸和甲基丙烯酸(聚合物的前体、粘合剂)、乙二酸(聚合物)、柠檬酸(饮料)、乙二胺四乙酸(edta)(螯合剂)、脂肪酸(涂料)、马来酸(聚合物)、丙酸(食品防腐剂)、对苯二甲酸(聚合物)、丁酸(食品添加剂)、琥珀酸(食品添加剂、聚合物)。乙醇酸(hoch2cooh,cas号:79-14-1)或其共轭碱的乙醇酸盐是羧酸的α羟基酸家族的最简单成员。乙醇酸在非常小的分子上具有醇基和中度强酸官能团二者的双功能。其性质使得它称为广泛的消费者和工业应用的理想选择，包括用于水井复原、皮革工业、石油和天然气产业、洗衣及纺织工业、清洁产品以及作为个人护理用品的成分。其还可用于产生多种聚合物材料，包括具有优异的气体屏障特性的包含聚乙醇酸的热塑性树脂，因此其可用于制造具有相同特性的包装材料(例如饮料容器等)。这些聚酯聚合物在水性环境中以可控的速度逐渐水解。该特性使得它们可用于生物医学应用例如可溶解的缝合线，且可用于其中需要酸受控地释放以降低ph的应用。虽然乙醇酸作为痕量组分天然存在于甘蔗、甜菜、葡萄和水果中，但是它主要是通过合成产生的。在文献中或在专利应用中描述了产生乙醇酸的其它技术。例如，ep2025759和ep2025760专利申请描述了一种用于通过使用微生物从在末端具有羟基的脂肪多元醇产生所述羟基羧酸的方法。该方法是生物转化，正如michihikokataoka在关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的文献中所描述的那样(kataoka等,2001)。乙醇酸还通过生物转化使用具有改善的腈水解酶活性的突变的腈水解酶从乙醇腈产生，该技术公开在专利申请wo2006/069110、wo2009/059104和wo2009/059096中，或通过生物转化从乙二醇、乙醇醛或乙二醛产生，如在专利申请jp2007/228927或wo2005/106005中所公开的。wo2007/141316、wo2010/108909、wo2011/036213、wo2011/157728、wo2012/025780、cn105647844a、cn106011185a和wo2016/079440(关于使用大肠杆菌菌株的方法)以及wo2013/050659、wo2014/162063和wo2016/193540(使用酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)菌株)公开了用于通过发酵从可再生资源产生乙醇酸的方法和微生物，其中碳水化合物通过一个直接的发酵步骤被转化为乙醇酸。乙醇酸或氧乙酸(hcocooh,cas号:298-12-4)或其共轭碱的乙醛酸盐是c2羧酸。乙醛酸是乙醛酸循环的中间物，乙醛酸循环使得生物体(诸如细菌、真菌和植物)能够将脂肪酸转化为碳水化合物。乙醛酸盐是在若干酰胺化肽的生物合成中酰胺化过程的副产物。它是天然存在并在工业上有用的无色固体。其用作清洁剂用于多种工业应用，用作特种化学及可生物降解共聚物原料和用作化妆品中的成分。它是一种对于农业和药物化学有用的化合物。事实上，乙醛酸可用于药物工业，因为其与酚类缩合产生4-羟基苯基乙醇酸，4-羟基苯基乙醇酸与氨反应产生羟苯基甘氨酸，羟苯基甘氨酸是药物阿莫西林(amoxicillin)的前体，或4-羟基扁桃酸经还原产生4-羟基苯乙酸，4-羟基苯乙酸是药物阿替洛尔(atenolo)的前体。此外，乙醛酸与尿素的酸催化的反应导致产生在化妆品、油膏和在治疗一些癌症中使用的尿囊素(cativiela等,2003)。最后，用愈创木酚代替苯酚的缩合提供获得用作食品、饮料和药物中的调味剂的香草醛的途径。虽然乙醛酸在未成熟水果和幼嫩的绿叶中作为痕量组分天然存，但它主要是通过合成产生的。产生乙醛酸的其它技术描述于文献中或专利申请中。例如，乙醛酸可以通过用一些水加热二溴乙酸或通过电解还原草酸或通过氮氧化乙二醛而化学合成。一些专利申请描述了通过生物转化产生乙醛酸的方法，例如专利申请wo1993/14214、us5,439,813和wo1994/28155公开了使用由微生物产生的乙醇酸氧化酶从乙醇酸生物转化，以及isobe&nishise(1999)。专利申请us2007/0026510公开了使用醛氧化酶从乙二醛生物转化。乙醇酸和乙醛酸的工业利益，加上化学生产过程中形成的化学副产品引起的环境问题，使得微生物生产这种羧酸具有诱人的前景。发明人已经鉴定了用于从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的新的方法，该方法涉及至少一个发酵步骤以及其中磷酸转酮酶的活性被增强的经修饰的微生物。磷酸转酮酶活性和编码具有这样的活性的酶的基因是本领域已知的(papini等，2012)。已经报道了细菌中的两种不同的磷酸转酮酶活性。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶催化5-磷酸木酮糖消耗磷酸地转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸，伴随释放水。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶例如由来自戊糖乳杆菌(lactobacilluspentosus)的xpka基因编码(posthuma等，2002)。6-磷酸果糖磷酸转酮酶催化6-磷酸果糖磷酸消耗磷酸地转化为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸，伴随释放水。一些基因编码同时具有5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性的磷酸转酮酶，例如，由来自乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)(meile等,2001)或动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)(wo2006/016705和wo2016/044713)的基因xfp编码的蛋白质的情况。磷酸转酮酶用于产生感兴趣的代谢物的用途是已经知晓的，并且已经公开在专利申请wo2006/016705和wo2016/044713中。这种感兴趣的代谢物是谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、琥珀酸、聚羟基丁酸酯和1,4-丁二醇。磷酸转酮酶用于产生乙醇酸或乙醛酸的用途从未被公开。本发明的方法和微生物相对于现有技术是新的，因为磷酸转酮酶用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的用途以前从未被公开。发明人已经惊奇地发现，在本发明的微生物中磷酸转酮酶的过量产生改善了乙醇酸和/或乙醛酸的产生。发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物和一步的生物学或化学转化乙醇酸或乙醛酸。技术实现要素：本发明涉及重组微生物和用于改善从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸并且使用至少一步的发酵和经修饰的微生物的方法，在所述经修饰的微生物中，选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，并且编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的基因的表达被增强。优选地，该编码磷酸转酮酶的基因选自来自戊糖乳杆菌的xpka基因、来自动物双歧杆菌的xfp基因或来自乳酸双歧杆菌的xfp基因或它们的同源基因。发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生乙醇酸或乙醛酸，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生相应的中间物乙醇酸或乙醛酸和一步的分别将中间物乙醇酸或乙醛酸生物学或化学转化为乙醛酸或乙醇酸。本发明的另一方法涉及使用甘氨酸氧化酶和任选的过氧化氢酶从甘氨酸产生乙醛酸。本发明的微生物选自细菌，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)、梭菌科(clostridiaceae)、棒状杆菌科(corynebacteriaceae)、芽孢杆菌科(bacillaceae)、双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)、乳酸杆菌科(lactobacillaceae)，或酵母。更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌的物种。发明详述在详细描述本发明之前，应理解，本发明不受限于具体示例性描述的方法，并且当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅出于描述本发明的特定实施方案的目的，并不意图是限制性的，本发明仅通过所附权利要求进行限制。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文或下文，通过提述以其整体并入本文。此外，除非有另外说明，否则本发明的实践采用本领域技术范围内的常规微生物学和分子生物学技术。此类技术对于熟练的技术人员来说是熟知的，并且在文献中得到了充分说明。必须注意的是，如在本文中和所附权利要求中使用的，除非上下文明确指出，否则单数形式“一(a、an)”和“该(the)”包括复数提述。因此，例如，提及“微生物”包括多种此类微生物，提及“内源基因”是提及一种或多种内源基因，等等。除非另有定义，除非本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些材料和方法相似或等同的任何材料和方法可用于实施或测试本发明，但现在描述优选的材料和方法。在权利要求和本发明的连贯描述中，除非上下文由于明确的语言或必要的含义而另有要求，否则词语“包含”、“含有”、“涉及”或“包括”或变化诸如“包含(comprises、comprising)”“含有(containing)”、“涉及(includes、including)”以包含性含义使用，即指定所述特征的存在但不排除在本发明的各种实施例中存在或添加其他特征。本发明涉及重组微生物和用于改善乙醇酸和/或乙醛酸的产生的方法。发明人鉴定的方法涉及仅一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生乙醇酸或乙醛酸，或者一步的发酵本发明的经修饰的微生物用于产生相应的中间物乙醇酸或乙醛酸和一步的分别将所述中间物生物转化为乙醛酸或乙醇酸。术语“乙醇酸”是指化学式为hoch2cooh且cas号为79-14-1的羧酸。术语“乙醛酸”是指化学式为hcocooh和cas号为298-12-4的羧酸。如本文所使用的，术语“微生物”是指未被人工修饰的细菌、酵母或真菌。优选地，该微生物选自肠杆菌科、梭菌科、棒状杆菌科、芽孢杆菌科、双歧杆菌科、乳酸杆菌科，或酵母。更优选地，该微生物是埃希氏杆菌属(escherichia)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)、乳杆菌属(lactobacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)或酵母菌属(saccharomyces)。甚至更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌的物种。如本文所使用的，术语“重组微生物”或“经遗传修饰的微生物”是指未在自然界发现的并且与其在自然界中发现的等同物有遗传差异的细菌、酵母或真菌。其意指其通过引入或通过缺失或通过修饰遗传元件而被修饰。其还可通过在特定的选择压力下通过组合定向诱变和进化而迫使新的代谢途径的开发和进化而被转化(参见例如wo2004/076659或wo2007/011939)。微生物可经修饰以表达外源基因，如果这些基因被引入具有允许其在宿主微生物中表达的所有元件的微生物中。用外源dna修饰或“转化”微生物是本领域技术人员的常规工作。微生物可经修饰以调节内源基因的表达水平。术语“内源基因”意指该基因在任何遗传修饰之前存在于该微生物中。内源基因可以通过引入除了内源调控元件之外的异源序列或通过引入异源序列以替换内源调控元件，或通过将一个或多个补充拷贝的该基因引入到该染色体或质粒中而被过表达。内源基因还可经修饰以调节其相应编码的蛋白的表达和活性。例如，可以将突变引入编码序列以修饰基因的产物，或可以引入除了内源调控元件之外的异源序列，或引入异源序列以替代内源调控元件。内源基因的调节可以导致基因产物的活性的上调和/或增强，或者替代性地，该内源基因产物的活性的下调和/或降低。调节其表达的另一方式是用较强的或较弱的启动子交换基因的内源启动子(例如野生型启动子)，以上调或下调该内源基因的表达。这些启动子可以是同源的或异源的。选择合适的启动子在本领域技术人员的能力范围内。相反地，“外源基因”意指该基因通过本领域技术人员熟知的方法被引入微生物中，而该基因在该微生物中不是天然存在的。外源基因可以被整合到宿主染色体中，或通过质粒或载体在染色体外表达。在复制起点和其在细胞中的拷贝数方面有差异的多种质粒是本领域熟知的。这些基因可以是同源的。在本发明的上下文中，术语“同源基因”不被限制为表示具有理论上的常见遗传祖先的基因，但包括可以遗传上不相关依然已经进化为编码具有相似功能和/或具有相似结构的蛋白质的基因。因此，术语“功能上同源”出于本发明的目的涉及以下事实：某一酶学活性可以不仅由具有限定的氨基酸序列的特定蛋白质提供，还由来自其它相关或不相关的微生物的具有相似序列的蛋白质提供。使用genbank中给出的已知基因的参考，本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等效基因。使用共有序列并且设计简并探针以在另一个生物中克隆相应基因而有利地完成该常规工作，该共有序列通过用衍生自其它微生物的基因进行序列比对而确定。这些常规分子生物学方法对于本领域技术人员来说是熟知的。如本文所使用的，术语“改善的乙醇酸和/或乙醛酸产生”、“改善乙醇酸和/或乙醛酸产生”和其语法等同表述是指增加的乙醇酸和/或乙醛酸/碳源产量(可以表示为百分比的每克/mol消耗的碳源所产生的g/mol乙醇酸和/或乙醛酸的比率)。用于确定消耗的碳源的量和产生的乙醇酸和/或乙醛酸的量的方法是本领域技术人员熟知的。与相应的未经修饰的微生物相比，重组微生物中的产量更高。术语“经优化用于发酵产生乙醇酸和/或乙醛酸的微生物”是指经进化和/或经遗传修饰以呈现出与相应的野生型微生物的内源产生相比改善的乙醇酸和/或乙醛酸产生的微生物。此类经“优化”用于乙醇酸和/或乙醛酸产生的微生物是本领域公知的，并且已经具体在专利申请wo2007/141316、wo2010/108909、wo2011/036213、wo2011/157728和wo2012/025780中公开。根据本发明，术语“发酵产生”、“培养”、“发酵步骤”或“发酵”用于表示细菌生长。该生长通常在具有适当的培养基的发酵罐中进行，该培养基适合于正在使用的微生物且含有至少一种简单碳源，且如果需要的话含有共基质(co-substrate)。“适当的培养基”是指包含对于细胞的维持和/或生长必需或有利的营养素的培养基(例如无菌液体培养基)，该营养素诸如碳源或碳基质、氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和和磷酸铵；微量元素(例如金属盐，例如镁盐、钴盐和/或锰盐)；以及生长因子(诸如氨基酸和维生素)。根据本发明，术语“碳源”或“碳基质”或“碳的来源”是指可由本领域技术人员用于支持微生物正常生长的碳的任何来源。碳源选自碳水化合物，碳水化合物是指单糖(诸如葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖或乳糖)，寡糖，二糖(例如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖浆，淀粉或其衍生物，半纤维素，以及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。碳源可以衍生自可再生原料。可再生原料定义为对于某些工业过程所需的原材料，该原材料可以在短暂延迟内再生，并且其量足以允许其转化为所需产物。经处理的或未经处理的植物生物质是令人感兴趣的可再生碳源。根据本发明，术语“生物转化步骤”或“生物转化”或“生物转换”或“生物催化”或“生物学转化”是指通过由酶产生者微生物(不同于本发明的经修饰的微生物)产生的特定酶将有机材料转化为所需产物。生物转化的反应可以根据该酶、其机制和过程的约束而差异进行，并且它们可以由本领域技术人员知晓：1.可以通过向有机材料添加纯化的酶使有机材料与酶接触，或2.可以通过向有机材料添加含有清除了细菌的酶的酶产生者微生物的发酵肉汤，使有机材料与酶接触，或3.可以通过向有机材料添加酶产生者微生物的裂解的细胞的提取物，而使有机材料与酶接触，或4.可以通过向有机材料添加酶产生者微生物的活细胞，使有机材料与酶接触，该微生物是先前经处理的以允许酶反应和反应再生所需的所述酶产生者微生物的生存力(特定辅因子利用度)。该系统被称为全细胞生物催化剂系统。在本发明的一个优选实施方案中，有机材料来源于本发明的方法的发酵的第一步，也就是由本发明的经修饰的微生物产生的乙醇酸或乙醛酸。该来源于发酵的第一步的有机材料可以或多或少从培养肉汤中纯化得到。在本发明的另一个实施方案中，该有机材料是通过化学或生物学方法提供的甘氨酸。在本发明的第一方面中，本发明涉及使用至少一步的发酵和经修饰的微生物从作为唯一碳源的碳水化合物产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法，其中本发明的经修饰的微生物包含选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达的弱化以及编码5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶的至少一种基因的过表达。如专利申请wo2007/141316中所公开的，选自编码苹果酸合成酶的aceb、编码苹果酸合成酶的glcb、编码乙醛酸醛连接酶的gcl和编码6-磷酸2-酮-3-脱氧葡糖酸醛缩酶的eda中的至少一种基因的缺失导致乙醛酸的转化降低，这使得乙醛酸(乙醛酸可以从培养基中回收或可以被进一步转化为乙醇酸)的积累。优选地，在本发明的微生物中，基因aceb和glcb和gcl的表达被弱化。更优选地，如专利申请wo2010/108909、wo2011/036213、wo2011/157728、wo2012/025780中公开的，本发明的经修饰的微生物可以使用以下方式被进一步修饰：-弱化编码乙醇酸氧化酶的基因glcdefg和/或编码乙醇醛脱氢酶的基因alda，这导致不能大幅度代谢乙醇酸-增加乙醛酸途径流量，这具体地通过弱化编码异柠檬酸脱氢酶的基因icd、编码icd激酶-磷酸酶的基因acek、编码磷酸-转乙酰酶的基因pta、编码乙酸激酶的基因acka、编码丙酮酸氧化酶的基因poxb、编码乙醛酸途径抑制因子的基因iclr或fadr，和/或通过过表达编码异柠檬酸裂解酶的基因acea实现，降低异柠檬酸脱氢酶的水平可以通过引入驱动编码异柠檬酸脱氢酶的icd基因的表达的人工启动子，或通过将降低该蛋白的酶学活性的突变引入icd基因中而实现。由于蛋白icd的活性通过磷酸化作用而降低，所以其还可以通过引入具有与野生型acek酶相比增加的激酶活性或降低的磷酸酶活性的突变的acek基因而得到控制。-增加nadph的利用度，这具体地通过弱化基因pgi、udha、edd而实现。术语“弱化”或“弱化的表达”在本文上下文中是指与未经修饰的微生物相比，基因的表达和/或酶的产生被降低或抑制，导致与未经修饰的微生物相比核糖核酸、蛋白或酶的细胞内浓度降低。本领域技术人员知晓用于测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同方式和方法，其包括，例如，使用逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)以确定核糖核酸浓度以及使用特异性抗体以确定特定蛋白的浓度。降低或抑制酶的产生可以通过弱化编码所述酶的基因的表达来实现。基因的弱化可以通过本领域技术人员已知的方式和方法实现。一般地，基因表达的弱化可以通过以下方式实现：-突变编码区或启动子区或，或-缺失基因表达所必需的启动子区的全部或部分，或-通过同源重组缺失该基因的编码区的全部或部分，或-将外部元件插入编码区中或插入启动子区中，或-在弱启动子或诱导型启动子的控制下表达该基因。本领域技术人员知晓具有不同强度的多种启动子以及用于弱的或可诱导的基因表达的启动子。在本发明的上下文中，术语酶的“活性”可与术语“功能”互换使用，且是指由该酶催化的反应。本领域技术人员知晓如何测定所述酶的酶学活性。术语酶的“弱化的活性”或“降低的活性”意指通过氨基酸序列中的突变获得的蛋白的降低的比催化活度和/或通过突变核苷酸序列或通过缺失基因的编码区实现的细胞中蛋白的降低的浓度。术语酶的“增强的活性”或“增加的活性”是指该酶的增加的比催化活度和/或通过例如过表达编码该酶的基因实现的细胞中酶的增加的量/利用度。术语“增加的表达”、“增强的表达”或“过表达”及其语法等同术语在该文本中可以互换使用，并且具有相似的含义。这些术语意指与未经修饰的微生物相比，基因的表达或酶的产生增加，这导致与未经修饰的微生物相比，核糖核酸、蛋白或酶的细胞内浓度增加。本领域技术人员知晓测量细胞中核糖核酸浓度或蛋白浓度的不同方式和方法，其包括例如使用逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)以确定核糖核酸浓度以及使用特异性抗体以确定特定蛋白的浓度。增加的酶产生通过增加编码该酶的基因的表达来实现。为了增加基因的表达，本领域技术人员知晓不同的技术，诸如：-增加该基因在微生物中的拷贝数。该基因在染色体上或在染色体外编码。当该基因位于染色体上时，可以通过本领域技术人员知晓的重组方法(包括基因置换)将若干拷贝的该基因引入染色体上。当基因位于染色体外时，该基因可以由在复制起点方面有差异的不同类型的质粒携带，因此这些质粒在细胞中的拷贝数也不同。这些质粒以1至5个拷贝、或约20个拷贝或最高达500个拷贝存在于微生物中，这取决于该质粒的性质：具有紧密复制的低拷贝数质粒(psc101、rk2)、低拷贝数质粒(pacyc、prsf1010)或高拷贝数质粒(pskbluescriptii)。-使用导致该基因高水平表达的启动子。本领域技术人员知晓哪种启动子是最便利的。例如，启动子ptrc、ptac、plac或λ启动子pr和pl是广泛使用的。这些启动子可可通过特定化合物或通过特定外部条件例如温度或光“诱导”。这些启动子可以是同源的或异源的。-弱化该基因特异或非特异的转录抑制子的活性或表达。-使用稳定相应信使rna的元件(carrier和keasling,1999)或稳定该蛋白的元件(例如gst标签,gehealthcare).术语“磷酸转酮酶”通常是指具有5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶活性(ec4.1.2.9)和/或6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性(ec4.1.2.22)的酶。5-磷酸木酮糖磷酸转酮酶活性意指消耗磷酸地将5-磷酸木酮糖转化为3-磷酸甘油醛和乙酰磷酸同时释放水的活性。6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性意指消耗磷酸地将6-磷酸果糖转化为4-磷酸赤藓糖和乙酰磷酸同时释放水的活性。这两种活性可以使用meile等(2001)描述的方法测量。5-磷酸d-木酮糖磷酸转酮酶或其编码基因可以来源于具有5-磷酸d-木酮糖磷酸转酮酶的活性的细菌，包括乳酸细菌、同化甲醇的细菌、同化甲烷的细菌、链球菌属(streptococcus)细菌，且更具体地，属于醋菌属(acetobacter)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)、硫杆菌属(thiobacillus)、链球菌属(streptococcus)、methylococus、丁酸弧菌属(butyrivibrio)、纤维杆菌属(fibrobacter)的细菌和/或属于假丝酵母属(candida)、红酵母属(rhodotorula)、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、毕赤酵母属(pichia)、耶氏酵母属(yarrowia)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、酵母菌属(saccharomyces)、毛孢子菌属(trichosporon)、温酵母属(wingea)的酵母等等。6-磷酸果糖磷酸转酮酶或其编码基因可以来源于具有6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性的属于属醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属(chlorobium)、布鲁氏菌属(brucella)、methylococus、加德纳菌属(gardnerella)的细菌和/或属于红酵母属、假丝酵母属、酵母菌属的酵母等等。此外，已经报道了一些酶催化5-磷酸d-木酮糖磷酸转酮酶和6-磷酸果糖磷酸转酮酶的活性，诸如来自动物双歧杆菌的xfp(wo2006/016705和wo2016/044713)或来自乳酸双歧杆菌的xfp(meile等,2001)。在本发明的上下文中，经修饰的微生物过表达编码磷酸转酮酶的基因以便增强乙醇酸和/或乙醛酸的产生。如果本发明的微生物天然产生磷酸转酮酶，则编码一种或多种磷酸转酮酶的一种或多种基因使用上文详述的过表达方法而被过表达。与之相反，如果本发明的微生物不天然表达磷酸转酮酶，外源的编码磷酸转酮酶的基因被引入该微生物中。在这种情况下，该基因的引入导致该编码磷酸转酮酶的基因过表达。编码磷酸转酮酶的基因选自：来自动物双歧杆菌的xfp基因(wo2006/016705和wo2016/044713)、来自乳酸双歧杆菌的xfp基因(meile等，2001)、来自戊糖乳杆菌的xpka(posthumaetal.,2002)或它们的同源基因：来自植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)的xpk1基因、来自植物乳杆菌的xpk2基因、来自无乳链球菌(streptococcusagalactiae)nem316的xpk基因、来自乳酸乳球菌亚种lactis(lactococcuslactissubsp.lactis)的ptk基因、来自约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)的xpk基因、来自嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)的xpk基因、来自长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)的xpf基因、来自绿硫菌(chlorobiumtepidum)的xfp基因、来自猪布鲁氏杆菌(brucellasuis)的xfp基因、来自流产布鲁氏菌(brucellaabortus)的xfp基因。优选地，该微生物过表达来自乳酸双歧杆菌的xfp基因(meile等,2001)、来自动物双歧杆菌的xfp基因(wo2006/016705和wo2016/044713)或来自戊糖乳杆菌的xpka(posthuma等,2002)。甚至更优选地，该微生物过表达来自动物双歧杆菌的xfp基因(wo2006/016705和wo2016/044713)或来自戊糖乳杆菌的xpka(posthuma等,2002)。在本发明的一个优选的实施方案中，经修饰的微生物还过表达ycdw或其同源基因，以便增加乙醛酸到乙醇酸的转化，如专利申请wo2007/141316中所公开的。本发明的一个目的是提供一种使用经修饰的微生物产生乙醇酸的方法，在该微生物中，选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自乳酸双歧杆菌的xfp基因、来自动物双歧杆菌的xfp基因、或来自戊糖乳杆菌的xpka的表达以及ycdw基因和/或yiae基因的表达均被过表达。优选地，在使用经修饰的微生物产生乙醇酸的方法中，选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自动物双歧杆菌的xfp基因、或来自戊糖乳杆菌的xpka的表达被过表达，且ycdw基因和/或yiae基因的表达被过表达。该产生乙醇酸的方法允许通过生物学或化学转化从乙醇酸产生乙醛酸。本发明的该第二种方法包括以下步骤：任选地从发酵肉汤中分离乙醇酸，通过生物转化使用由来自大肠杆菌的基因glddefg编码的乙醇酸氧化酶和由来自大肠杆菌的基因kate或katg编码的过氧化氢酶(loewen&switala,1986)或通过化学转化例如使用氮氧自由基催化剂诸如azado(furukawa等,2016)将乙醇酸转化为乙醛酸，且从转化介质中回收乙醛酸。任选的乙醇酸的分离可至少在于从发酵肉汤中回收微生物细胞。乙醇酸可以进一步通过连续蒸馏从发酵肉汤中的其它有机物中纯化，如专利申请wo2012/153041、wo2012/153042和wo2012/153043中公开的。可替换地，乙醇酸可以通过如专利us7439391中公开的重复结晶步骤或通过使用适当的溶剂的液-液萃取来纯化。可用的溶剂是本领域技术人员熟知的，本领域技术人员能够选择最便利的溶剂。从发酵肉汤中纯化乙醇酸的另一方式是使用发酵提取工艺，其也被称为反应提取工艺或提取发酵工艺。提取发酵可以被认为是一个整合过程，其中反应过程即发酵与纯化操作即液体提取结合，如专利申请wo2009/042950或wo1999/54856中公开的。该工艺表现出允许在乙醇酸产生时就将乙醇酸移出的优势，这降低了由于乙醇酸的毒性作用而导致的细胞生长的抑制作用，并因此在一个连续步骤中产生并回收乙醇酸，从而减少下游的处理和回收成本。溶剂选自含有键合碳的氧的溶剂或含有磷键合的氧的溶剂或高分子量脂肪族胺。优选的溶剂是三正辛基氧化膦、磷酸三正丁酯、十二烷基-三烷基甲胺、三正辛胺、三异辛胺、三正(辛基-癸基)-胺、烷基季铵盐、聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。更优选地，所用的溶剂为三正辛基氧化膦。有利地，提取发酵可以通过随后的结晶或蒸馏步骤完成。将乙醇酸生物转化为乙醛酸的步骤通过也被称为(s)-2-羟基酸氧化酶(ec编号:1.1.3.15)的乙醇酸氧化酶介导，该酶催化以下反应：该酶属于氧化还原酶家族，具体是那些以氧气作为受体作用于ch-oh基团的酶。本发明中使用的乙醇酸氧化酶可以对应于该酶的任何天然存在的形式或表现出更好的稳定性或催化功效的天然存在的酶的任何变体。使用的天然存在的乙醇酸氧化酶可以从菠菜或甜菜叶子中提取或纯化，或者替代性地，编码这些酶的基因可以被插入在产生者微生物中，如专利申请wo1994/20631和wo1995/01444中公开的。替代性地，编码乙醇酸氧化酶的来自大肠杆菌的glddefg基因在产生者生物中过表达。产生者生物选自毕赤酵母、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)或大肠杆菌。最优选地，使用大肠杆菌。由于乙醇酸氧化酶生成h2o2，所以将由毕赤酵母、多形汉逊酵母、构巢曲霉或大肠杆菌内源性表达的过氧化氢酶(ec编号:1.11.1.6)与乙醇酸氧化酶结合使用是有利的。在大肠杆菌中，过氧化氢酶由kate或katg基因编码。优选地，乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶在同一微生物中过表达。乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的使用在专利申请wo1996/00793、wo1994/20631或在wo1995/01444中公开。为了进行生物转化，通过直接添加纯化的酶至乙醇酸的溶液或添加乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的发酵肉汤或乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的裂解的细胞的提取物，来使乙醇酸氧化酶和/或过氧化氢酶与乙醇酸接触。为了提高转化效率，可以如专利us5,439,813中所公开的，在酶纯化后使用固定化的酶。然后使用本领域技术人员熟知的方式纯化所形成的乙醛酸，例如结晶或使用氢氧化钙进行沉淀或液-液萃取。在本发明的另一个优选的实施方案中，经修饰的微生物被进一步工程化，以便弱化至少ycdw基因的表达，以避免乙醛酸转化为乙醇酸。本发明的又一个目的是提供使用经修饰的微生物产生乙醛酸的方法，在该微生物中选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自乳酸双歧杆菌的xfp基因的表达、来自动物双歧杆菌的xfp基因的表达或来自戊糖乳酸菌的xpka基因的表达被过表达，并且ycdw基因和yiae基因的表达被弱化或完全消除。优选地，在使用经修饰的微生物产生乙醛酸的方法中，选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化，来自动物双歧杆菌的xfp基因的表达或来自戊糖乳酸菌的xpka基因的表达被过表达，并且ycdw基因和yiae基因的表达被弱化或完全消除。该用于产生乙醛酸的方法允许通过生物学或化学转化从乙醛酸产生乙醇酸。本发明的该第四个方法包括以下步骤：任选地从发酵肉汤中分离乙醛酸、通过生物转化使用乙醛酸还原酶或通过化学转化使用例如硼氢化钠将乙醛酸转化为乙醇酸、且从转化介质中回收乙醇酸。所述乙醛酸还原酶可以由来自大肠杆菌的基因ycdw或由来自菜豆根瘤菌(rhizobiumetli)的基因grxa编码。任选地分离乙醛酸可以至少在于从发酵肉汤中回收微生物细胞。乙醛酸可以进一步通过离子交换或通过沉淀/结晶方法或通过液-液萃取从发酵肉汤中的其它有机物中纯化。从发酵肉汤中纯化乙醛酸的另一方式是使用提取发酵工艺。提取发酵可以被认为是一个整合过程，其中反应过程即发酵与纯化操作即液体提取结合，如专利申请wo2009/042950或wo1999/54856中公开的。该工艺表现出允许在乙醛酸产生时就将乙醛酸移出的优势，这降低了由于乙醛酸的毒性作用而导致的细胞生长的抑制作用，并因此在一个连续步骤中产生并回收乙醛酸，从而减少下游的处理和回收成本。溶剂选自含有键合碳的氧的溶剂或含有键合磷的氧的溶剂或高分子量脂肪族胺。优选的溶剂是三正辛基氧化膦、磷酸三正丁酯、十二烷基-三烷基甲胺、三正辛胺、三异辛胺、三正(辛基-癸基)-胺、烷基季铵盐、聚乙二醇、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺。更优选地，所用的溶剂为三正辛基氧化膦。有利地，提取发酵可以通过随后的结晶或蒸馏步骤完成。替代性地，对于提取发酵，为了降低在发酵过程中产生的乙醛酸的毒性，可以在发酵肉汤中添加已知与醛形成络合物的分子诸如氨基脲或碳酰肼或2,4-二硝基苯基肼，以便与乙醛酸络合，并因此降低该醛对于细胞的毒性。这可以产生提高的乙醛酸产率(sardari等,2014)。乙醛酸生物转化为乙醇酸的步骤由乙醛酸还原酶介导。乙醛酸还原酶是首次从菠菜叶子中分离的，且是使用辅因子nadh或nadph催化乙醛酸还原为乙醇酸的酶。乙醛酸还原酶可以是nadh依赖性的(ec号:1.1.1.26)或nadph依赖性的(ec号:1.1.1.79)。可以使用的nadh依赖性乙醛酸还原酶的实例是：由来自菜豆根瘤菌的gxra基因编码的gxra、由来自酿酒酵母的gor1基因编码的gor1、由来自扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)的hpra基因编码的hpra或由来自极端嗜热菌(pyrococcusfuriosus)的gyar基因编码的gyar。nadph依赖性乙醛酸还原酶的实例是：由来自大肠杆菌的ycdw基因编码的ycdw、由来自大肠杆菌yiae基因编码的yiae、由来自大肠杆菌的yjgb基因编码的yjbg、由来自大肠杆菌的yafb基因编码的yafb、由来自大肠杆菌的yqhd基因编码的yqhd或由来自拟南芥(arabidopsisthaliana)的glyr1和glyr2基因编码的glyr1和glyr2……。有利的是，乙醛酸还原酶产生者微生物是大肠杆菌。为了将乙醛酸生物转化为乙醇酸，乙醛酸还原酶需要nadh或nadph辅因子。在这样的情况下，生物转化需要在特定地酶和能够在反应期间产生和再生辅因子的活细胞的存在下完成。这被称为全细胞生物催化剂系统。因此部分纯化的或未纯化的乙醛酸溶液与乙醛酸还原酶产生者微生物的发酵肉汤接触，该微生物已经过量产生乙醛酸还原酶并且仍有生存力以便产生和再生辅因子。为了提高生物转化效率，可以使用固定的酶，但仍存在预先处理的活的微生物，以帮助反应。然后使用本领域技术人员熟知的方式诸如蒸馏、结晶、用氢氧化钙沉淀或液-液萃取来纯化形成的乙醇酸。在本发明的另一个实施方案中，乙醛酸可以通过使用甘氨酸氧化酶通过生物转化甘氨酸(cas号:56-40-6)来产生。甘氨酸氧化酶(ec号:1.4.3.19)催化以下反应：本发明中使用的甘氨酸氧化酶可以对应于该酶的任何天然存在的形式或显示出更好的稳定性或催化效率的天然酶的任何变体，如专利申请us2016/0002610所公开的。已经在枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中鉴定了甘氨酸氧化酶(nishiya&imanaka,1998；job等,2002)。可以从枯草芽孢杆菌中提取并纯化该酶或者，替代性地，可以将编码该酶的基因插入产生者微生物中。产生者生物优选为大肠杆菌。由于甘氨酸氧化酶生成h2o2,，所以将大肠杆菌的kate和katg基因内源表达的过氧化氢酶(ecnumber:1.11.1.6)与甘氨酸氧化酶结合使用是有利的。优选地，甘氨酸氧化酶与过氧化氢酶在同一微生物中过表达。为了进行生物转化，通过向甘氨酸溶液中直接添加纯化的酶或通过添加甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的发酵肉汤或甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶产生者微生物的裂解细胞的提取物，使甘氨酸氧化酶和/或过氧化氢酶与甘氨酸接触。为了提高生物转化效率，可以如专利us5,439,813中所公开的，在酶纯化后使用固定的酶。最后，本发明涉及经修饰用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的微生物，在所述微生物中选自aceb、glcb、gcl和eda中的至少一种基因的表达被弱化并且编码磷酸转酮酶的至少一种基因的表达被增强。磷酸转酮酶由来自动物双歧杆菌的xfp基因、来自乳酸双歧杆菌的xfp基因或来自戊糖乳杆菌的xpka基因编码。为了产生乙醇酸，本发明的微生物经进一步修饰以过表达来自大肠杆菌的ycdw基因或其同源基因中的至少一种。为了产生乙醛酸，本发明的微生物经进一步修饰以弱化或完全消除至少基因ycdw的表达。本发明的微生物选自肠杆菌科、梭菌科、棒状杆菌科、芽孢杆菌科、双歧杆菌科、乳酸杆菌科，或酵母。更优选地，本发明的微生物来自大肠杆菌物种。实施例以下实验证明了如何使用经修饰的乙醇酸产生者大肠杆菌重组菌株作为背景产生乙醇酸或乙醛酸。在以下给出的实施例中，使用了本领域熟知的方法来构建大肠杆菌菌株，该菌株含有复制载体和/或使用同源重组的多种染色体插入、缺失和置换，如datsenko&wanner,(2000)详细描述的。方案已经使用了一些方案用于构建以下实施例中所述的产生乙醛酸的菌株。本发明中使用的方案1(通过同源重组的染色体修饰、选择重组子和侧接有frt序列的抗生素盒切除)和方案2(噬菌体p1的转导)已经在专利申请wo2013/001055中充分描述。方案3：侧接有loxp序列的抗生素盒切除由loxp序列侧接的抗性基因通过使用携带编码cre重组酶的基因的质粒pjw168(palmeros等,2000)去除。简言之，在37℃或42℃在lb上培养携带pjw168质粒的克隆，然后在30℃测试抗生素抗性的丢失。然后通过pcr使用适当的引物验证对抗生素敏感的克隆。实施例1：在大肠杆菌乙醇酸过量产生重组菌株中过表达ycdw基因的抑制——菌株1的描述和菌株2至3的构建。菌株1的描述在专利申请wo2011/157728的实施例2第2部分中描述的菌株，其对应于ag1413的亲本菌株，即不具有pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒的ag1413菌株，在本专利申请中被命名为菌株1。菌株2的构建在使用菌株1之前，分别使用flp重组酶(根据方案1)和cre重组酶(根据方案3)从基因座icd(seqidn°01，其编码具有seqidn°02的序列的蛋白质)和acek(seqidn°03，其编码具有seqidn°04的序列的蛋白质)中去除抗生素抗性盒。然后选择对卡那霉素和氯霉素敏感的转化子，通过pcr分析使用恰当的寡核苷酸验证抗生素标记不存在。将保留的菌株命名为菌株2。菌株3的构建通过限制酶和连接酶将由专利申请wo2010/108909中所述的pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒携带的编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的ycdw基因(seqidn°05，其编码具有seqidn°06的序列的蛋白质)连同其启动子和laci基因一起从该质粒中去除，得到pag0094质粒。将质粒pag0094导入菌株2中，产生菌株3。实施例2：通过完全去除大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中的ycdw基因提高乙醛酸产生。缺失大肠杆菌重组乙醇酸产生者菌株2中ycdw基因的内源拷贝。为了实现ycdw基因的缺失，使用datsenko&wanner,2000中描述的同源重组策略(根据方案1)。为了进行ycdw缺失，通过重叠pcr技术(重叠寡核苷酸)pcr扩增由与ycdw基因的上游区域和下游区域同源的dna序列侧接的携带抗性标记的片段。用于重组到ycdw基因的上游区域和下游区域中的序列被称为seqidn°09和10。然后通过电穿孔将获得的pcr产物“δycdw::km”导入菌株mg1655(pkd46)中。选择抗生素抗性转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证具有相关抗性盒的ycdw基因缺失。留下的菌株被指定为mg1655δycdw::km。最后，通过p1噬菌体转导(根据方案2)将δycdw::km缺失从mg1655δycdw::km转移到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证δycdw::km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株4。然后在菌株4中缺失acea基因(seqidn°11，其编码具有seqidn°12的序列的蛋白质)的内源拷贝。为了实现acea基因的缺失，使用由datsenko&wanner,2000描述的同源重组策略(根据方案1)。由于aceb(seqidn°13，其编码具有seqidn°14的序列的蛋白质)和acek(seqidn°03，其编码具有seqidn°04的序列的蛋白质)基因之前已经在菌株4中缺失，所以同源重组策略等同于用于缺失acebak操纵子的策略。对于acebak缺失，通过重叠pcr技术(重叠寡核苷酸)pcr扩增由与acebak操纵子的上游区域和下游区域同源的dna序列侧接的携带抗性标记的片段。用于重组到acebak操纵子的上游区域和下游区域中的序列被称为seqidn°15和16。然后通过电穿孔将获得的pcr产物“δacebak::cm”导入菌株mg1655(pkd46)中。选择抗生素抗性转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证具有相关抗性盒的acebak操纵子缺失。保留的菌株被指定为mg1655δacebak::cm。最后，通过p1噬菌体转导(根据方案2)将δacebak::cm缺失从mg1655δacebak::cm转移到菌株4中。选择氯霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证δacebak::cm缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株5。通过限制酶和连接酶将由pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒携带的编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的ycdw基因(seqidn°05和n°06)在不缺失其启动子和laci基因的情况下(不同于实施例1中描述的pag0094)从该质粒中去除，得到pag0303质粒。因此，在该质粒上，acea基因表达的一部分由其天然启动子驱动，但也可能通过添加iptg由ycdw和laci基因的留下的启动子增加acea表达水平。将质粒pag0303导入菌株5中，产生菌株6。实施例3：通过用菌株3和菌株6发酵产生乙醇酸和乙醛酸。评估锥形带挡板烧瓶中的产生菌株。在37℃在混合培养基(具有2.5g.l-1葡萄糖和90％基本培养基m1的10％lb培养基(sigma25％))中培养5ml预培养物持续16小时。将其用于在培养基m1中接种50ml培养物至od600为0.2。培养基m1的组成在表1中描述。需要时，在培养基中添加抗生素(终浓度为50mg.l-1的壮观霉素)，并且iptg终浓度为100μm。培养物的温度为30℃。当培养物已经达到od600高达5时，使用hplc使用折射计检测(有机酸和葡萄糖)分析细胞外代谢产物。对于每种菌株，进行若干重复。表1：m1培养基的组成表2：乙醇酸(ga)和乙醛酸(gxa)滴度和摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的ga或gxa的产量(y)。对于ga或gxa/葡萄糖产量的精确定义参见下文。菌株3菌株6[ga](g.l-1)1.10.4[gxa](g.l-1)0.20.8yga(g.g-1)0.110.03ygxa(g.g-1)0.020.10从上表2中可见，缺失ycdw拷贝和受控地诱导acea基因后，菌株6产生比菌株3高得多的量的乙醛酸。如所预期的，该乙醛酸的产生与菌株6中乙醇酸合成的降低有关联。ga和gxa产量表示如下：实施例4：通过在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中过表达编码磷酸转酮酶的异源基因来改善乙醇酸产生——菌株7至12的构建。菌株7至9的构建：在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中重新构建编码磷酸乙酰转移酶的大肠杆菌pta基因在菌株ag1413和其亲本菌株菌株1中，安排在操纵子中的acka(seqidn°17，其编码具有seqidn°18的序列的蛋白质)和pta(seqidn°19，其编码具有seqidn°20的序列的蛋白质)基因二者先前已经被缺失。为了再次将乙酰磷酸(其由以下菌株中的磷酸转酮酶产生)转化为乙酰-coa，将pta基因重新构建到菌株1背景中，同时保留acka基因的缺失。为了实现pta基因的重新构建，使用来自keiocollection的仅缺失acka基因并携带野生型pta基因的δacka::km突变体。通过p1噬菌体转导(根据方案2)将与pta野生型基因相关联的δacka::km缺失从δacka::kmkeio突变体转移到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证δacka::km缺失和pta野生型基因二者的存在。保留的菌株被命名为菌株7。然后使用flp重组酶(根据方案1)从菌株7中的δacka缺失中去除抗生素盒。选择对卡那霉素敏感的转化子，并且使用适当的寡核苷酸通过pcr分析验证抗生素标记的不存在。保留的菌株被命名为菌株8。为了磷酸乙酰转移酶活性测定，使用埃尔曼氏硫醇试剂5,5′-二巯基双(2-对硝基苯甲酸)(dtnb)通过在412nm在30℃测量苯硫酚盐的形成，来监测来自乙酰-coa的coa的磷酸依赖性释放(ε412＝13.6mm-1cm-1)。测定混合物(1ml)含有100mmkh2po4(ph8)、0.5mmdtnb和1mm乙酰-coa。减去测定中不存在乙酰-coa的情况下测定的活性值。比活度表示为毫单位(mui)每毫克蛋白质。菌株7的磷酸乙酰转移酶活性是菌株8的10倍(菌株7为1100mui/mg；菌株8为110mui/mg)。然后将专利申请wo2010/108909中描述的质粒pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01引入菌株8中，得到菌株9。菌株10至12的构建：在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中过表达编码磷酸转酮酶的异源基因为了增加乙酰-coa库并因此增加乙醇酸产生，在大肠杆菌乙醇酸过量产生者菌株中过量产生不同的磷酸转酮酶。编码磷酸转酮酶的三种不同的基因在菌株9中单独过表达：-来自动物双歧杆菌的xfp(seqidn°21，其编码具有seqidn°22的序列的蛋白质)，-来自青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)的fxpk(seqidn°23，其编码具有seqidn°24的序列的蛋白质)，-来自戊糖乳杆菌的xpk(seqidn°25，其编码具有seqidn°26的序列的蛋白质)。对于每种基因(由“o1ec”后缀确定)，由来自thermofisherscientific的geneart基因合成服务合成性地合成经优化以用于在大肠杆菌中产生的密码子协调形式。使用适当的寡核苷酸将每种基因连同人工ptrc启动子(该人工启动子是在专利申请wo2009/043803；brosius等,1985中描述的用于过表达cyspuwam操纵子的启动子)一起亚克隆到pbbr1mcs5载体上(kovach等,1995)，分别得到下表3中详细描述的质粒。表3：用于过表达磷酸转酮酶基因的质粒每种质粒单独引入菌株9中，得到下表4中描述的菌株。表4：包含用于过表达磷酸转酮酶基因的质粒的菌株：pbbr1质粒以中等拷贝数稳定复制。为了使磷酸转酮酶基因具有若干水平的过表达，还将这些基因克隆到在细胞中具有已知不同拷贝数的以下质粒中：-低拷贝数pcl1920载体(lerner&inouye,1990)pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒，-和一个拷贝数的细菌人工染色体pbac质粒还将磷酸转酮酶过表达质粒连同pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒一起引入菌株7和菌株8中。在摇瓶和反应器中的性能首先，如实施例3中所述的在摇瓶中评估菌株。表5：在摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的乙醇酸(ga)的ga产量。对于ga/葡萄糖产量的精确定义参见实施例3。如表5所示，过表达所有测试的磷酸转酮酶基因后，乙醇酸产生产量增加。在过表达来自动物双歧杆菌和来自戊糖乳杆菌的磷酸转酮酶基因的情况下，产量更高。在2l发酵罐(pierreguerin)中使用分批补料策略评估这些菌株。在37℃在混合培养基(具有2.5g.l-1葡萄糖和90％基本培养基m1的10％lb培养基(sigma25％))中进行在管中的首次预培养持续10小时。将其用于在培养基m1中接种50ml第二接种物至od600为0.2。该步骤的预培养在37℃在500ml锥形瓶中进行，该三角培养瓶装有补充有40g.l-1mops和10g.l-1葡萄糖的50ml合成培养基(m1)。在od600nm接近9后，该第二预培养物用于接种发酵罐。以约0.5的初始光密度接种装有补充有20g.l-1葡萄糖的700ml合成培养基(m2)的反应器。m2培养基的组成在表6中描述。在30℃伴随搅拌进行培养，通过增加搅拌和充气，将溶解氧的浓度值保持在20％饱和与40％饱和之间，优选30％饱和。通过自动添加nh4oh/naoh溶液(15/5w/w)将ph调整至6.8。以分批方式进行培养直到葡萄糖耗尽。此时，添加补充有硫酸镁、微量元素和硫胺素的700g.l-1葡萄糖溶液，以在反应器中恢复20g.l-1葡萄糖浓度。一旦葡萄糖再次耗尽进行进一次添加。第五次脉冲后，由于三小时的爬升，ph值增加到7.4。40至45小时后终止培养。使用hplc使用折射计检测(有机酸和葡萄糖)分析细胞外代谢产物。对于每种菌株，进行若干重复。最终性能呈现在表7中。表6：m2培养基的组成。表7：菌株9、10和12在2l反应器中的最终性能。符号～表示与参考菌株相比该参数的变化在-5％和5％之间。符号+表示在5％和10％之间的增加，并且符号++表示在10％和20％之间的增加。过表达磷酸转酮酶基因后，菌株10和12的生产产量显示出依据被测试的异源基因的性质在5％和20％之间的增加。我们没有见到对滴度或对生产率的任何影响。根据这些结果，证实了磷酸转酮酶活性对ga产生的益处。磷酸转酮酶的表达水平并不改变结果的趋势。在pcl1920或pbac上携带的3个基因xfpo1ec、fxpko1ec、xpko1e的不同表达水平提高了乙醇酸的产生(结果未显示)。产量计算如下：通过初始体积+用于调节ph的和为培养物进料而添加的溶液的量-用于取样的体积-通过蒸发而失去的体积来计算发酵罐体积。通过称重进料原料连续跟踪分批进料体积。然后基于注射的体积、溶液密度和通过brix方法([葡萄糖])控制的葡萄糖浓度，计算注射的葡萄糖的量。ga产量表示如下：ga0和gaf分别对应初始ga浓度和最终ga浓度，并且v0和vf分别对应初始体积和最终体积。消耗的葡萄糖以g表示。粗提取物的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶测定(x5ppk和f6ppk)根据racker等,1962和meile等,2001，采用分光光度法作为乙酰异羟肟酸铁测量磷酸转酮酶活性，乙酰异羟肟酸铁是从酶催化生成的乙酰磷酸产生的。0.075ml的标准反应混合物由33.3mm磷酸钾(ph6.5)、l-半胱氨酸盐酸盐(1.9mm)、氟化钠(23mm)、碘乙酸钠(8mm)、作为底物的6-磷酸d-果糖(f6p)(100mm)或5-磷酸d-木酮糖(x5p)(27mm)和用于开始反应的粗提取物组成。在37℃温育10分钟或30分钟后，通过添加0.0075ml的盐酸羟胺(2m,ph6.5)终止酶反应。室温下10分钟后，添加0.05ml的15％(wt/vol)三氯乙酸、0.05ml的4mhcl和0.05ml的fecl3x6h2o(5％[wt/vol]在0.1mhcl中)用于乙酰异羟肟酸铁的最终显色。在搅拌下在25℃温育5分钟后，将混合物以2250xg离心5分钟，将200μl的上清液转移至一个新的微量板，以测量吸光度。然后在505nm处使用分光光度计法测量，通过与在1.5mm与150mm之间的一系列乙酰磷酸标准品比较，来定量乙酰异羟肟酸铁的形成。一个单位的磷酸转酮酶活性被定义为每分钟从f6p或x5p形成1mmol的乙酰磷酸的提取物的量。减去了在无底物的情况下测定的活性值。比活度表示为毫单位每毫克蛋白。菌株10至12的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性在表8中提供。表8：测量的粗提取物的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性nd：未检测到在大肠杆菌中表达的由来自动物双歧杆菌的xfp和来自青春双歧杆菌的fxpk编码的磷酸转酮酶催化对5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖底物的活性。不过，如表8中可见，这些酶对5-磷酸d-木酮糖比对6-磷酸果糖活性更高。与之相反，在大肠杆菌中表达的由来自戊糖乳杆菌的xpk编码的磷酸转酮酶仅仅对底物5-磷酸木酮糖有活性。显示与不具有任何pk的参考菌株9相比，携带不同磷酸转酮酶(pk)酶的菌株10、11和12的乙醇酸产生的该实施例的结果，证明了磷酸转酮酶活性改善每消耗的葡萄糖的乙醇酸的产量，不管该酶(x5ppk或f6ppk)的底物专一性。实施例5：通过在大肠杆菌乙醇酸过量产生者重组菌株中抑制ycdw表达和过表达编码磷酸转酮酶的异源基因来改善乙醛酸产生-菌株13至17的构建。菌株13和14的构建：在δacka+ptaag1413菌株中抑制编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的大肠杆菌ycdw基因的表达菌株ag1413具有两个拷贝的ycdw基因，一个在染色体上，一个在pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒上。为了缺失菌株ag1413背景中的ycdw的染色体拷贝，通过p1噬菌体转导(根据方案2)将在实施例2中描述的δycdw::km缺失从mg1655δycdw::km转到菌株2中。选择卡那霉素抗性转导子，通过pcr分析使用适当的寡核苷酸验证δycdw::km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株13。然后，将实施例2中描述的过表达acea基因无ycdw基因的质粒pag0303引入菌株13中，得到菌株14。菌株15至16的构建：在pta野生型菌株9中抑制编码乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶的大肠杆菌ycdw基因的表达菌株9具有两个拷贝的ycdw基因，一个在染色体上，一个在pme101-ycdw-tt07-pacea-acea-tt01质粒上。为了缺失菌株9背景中的ycdw的染色体拷贝，通过p1噬菌体转导(根据方案2)将在实施例2中描述的δycdw::km缺失从mg1655δycdw::km转到菌株8中。选择卡那霉素抗性转导子，通过pcr分析使用适当的寡核苷酸验证δycdw::km缺失的存在。保留的菌株被命名为菌株15。然后，将在实施例2中描述的过表达acea基因无ycdw基因的质粒pag0303引入菌株15中，得到菌株16。菌株17的构建：在大肠杆菌乙醛酸过量表达者重组菌株中过表达编码磷酸转酮酶的动物双歧杆菌基因将编码磷酸转酮酶的动物双歧杆菌xfpo1ec基因的密码子协调形式在菌株16中过表达。为了将该基因在菌株16中过表达，将实施例4中描述的质粒pbbr1mcs5-ptrc01-xfpo1ec引入菌株16中，得到菌株17。为了测试磷酸转酮酶基因的过表达的不同水平，还将xfpo1ec基因克隆进具有比pbbr1更少的拷贝数的质粒：低拷贝数pcl1920载体(lerner&inouye,1990)，实施例2中描述的pag303。以上所述的所有修饰都是在菌株7背景中进行的。对于其它两个磷酸转酮酶基因fxpko1ec和xpko1ec也进行相同工作。在摇瓶中的性能如实施例3中所述的，在摇瓶中评估菌株。表9：摇瓶中产生菌株消耗每克糖产生的以克计的乙醛酸(gxa)的gxa产量。对于gxa/葡萄糖产量的精确定义参见实施例3。菌株gxa产量(g.g-1)菌株140.02菌株160.02菌株170.03在上表9中可见，来自动物双歧杆菌的磷酸转酮酶基因的过表达轻微增加乙醛酸的产生(菌株17对比菌株14)。用其他测试的磷酸转酮酶也获得了相同的结果，即乙醛酸产量的增加(未显示数据)。粗提取物的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶测定(x5ppk和f6ppk)根据在上文中实施例4中所述的方案测量磷酸转酮酶活性。菌株16和菌株17的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性在表10中提供。表10：测量的粗提取物的5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖磷酸转酮酶活性nd：未检测到在大肠杆菌中表达的由来自动物双歧杆菌的xfp编码的磷酸转酮酶催化对5-磷酸d-木酮糖和6-磷酸果糖底物的活性。该酶对底物5-磷酸d-木酮糖的活性更高。参考文献-brosiusj,erflem,storellaj,(1985),jbiolchem.,260(6):3539-41-datsenkoka&wannerbl,(2000),procnatlacadsciusa.,97:6640-6645-cativielac,frailejm,garciaji,lazarob,mayoralja,pallaresa,(2003),greenchemistry,5:275-277-furukawak,inadah,shibuyam,yamamotoy,(2016),org.lett.,18(17):4230-4233-isobek&nishiseh,(1999),j.biotechnol.,75:265-271-jobv,marconegl,pilonems,pollegionil,(2002),j.biol.chem.,277(9):6985-6993-kataokam,sasakim,hidalgoar,nakanom,shimizus,(2001),biosci.biotechnol.biochem,65(10):2265-2270-kovachme,elzerph,hillds,robertsongt,farrisma,rooprm2nd,petersonkm,(1995),gene.,166(1):175-6-lernercg,inouyem,(1990),nucleicacidsres.,18(15):4631-loewen&switala,(1986),biochemcellbiol.,64(7):638-46.-meilel,rohrlm,geissmannta,herenspergerm,teuberm,(2001),jbacteriol.,183(9),2929-2936-nishiyay&imanakat,(1998),febsletters,438:263-266-palmerosb,wildj,szybalskiw,leborgnes,hernández-chávezg,gossetg,vallef,bolivarf.,(2000),gene,247(1-2):255-64-papinim,nookaewi,siewerv,nielsenj,(2012),appl.microbiol.biotechnol.,95:1001-1010-posthumacc,baderr,engelmannr,postmapw,hengstenbergw,pouwelsph,(2002),appl.environ.microbiol.,68(9):831-837-rackere,(1962),methodsenzymol.,5,276-280-sardarirrr,dishishat,pyosh,hatti-kaulr,(2014),j.biotechnol.,192:223-230序列表<110>metabolicexplorer<120>用于产生乙醇酸和/或乙醛酸的方法和微生物<130>d36902<150>17305084.0<151>2017-01-26<160>29<170>patentinversion3.5<210>1<211>1251<212>dna<213>大肠杆菌<400>1atggaaagtaaagtagttgttccggcacaaggcaagaagatc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