用于提高植物产量的磷酸盐转运蛋白的表达的制作方法

发明领域

本发明涉及增加植物产量的方法，包含增加编码磷酸盐转运蛋白(pt7)多肽的核酸的表达。本发明还涉及制备此类植物和展示增加的产量的遗传改变的植物的方法。

发明背景

可持续地增加作物产量且具有较低的环境成本以养活世界上不断增长的人口是一个非常紧迫的问题。然而，目前产量的增加主要地取决于肥料的广泛应用，特别是氮(n)和磷(p)肥料^1,2。另一方面，豆科植物通过生物固n2(bnf)提供必需的氮源，从而充当农业生态系统中的核心参与者³。在n2固定过程中产生巨大能量成本，并且小瘤的快速发育对豆科植物来说都需要足够的p供应⁴。有研究报道，磷酸盐(pi)饥饿严重抑制结瘤和bnf⁵，伴随着大豆小瘤数量、小瘤尺寸和固氮酶活性降低^6,7。因此，将pi转运到小瘤中是豆科植物中对于有效的bnf和小瘤器官发生的关键过程。

植物中p运输和/或转运的过程依赖于各种pi转运蛋白(pht)⁸。植物pi转运蛋白已被分为五个家族：pht1、pht2、pht3、pht4和ppt^9-13。在这些pi转运蛋白中，pht1家族的成员被广泛研究并且被充分表征。已经从几种植物物种中分离出许多低亲和力和高亲和力的pht1家族成员，包括拟南芥(arabidopsis)¹⁴、水稻¹⁵、玉米¹⁶和大豆¹⁷。通常，低亲和力的pi转运蛋白参与器官内的pi转运¹⁸，而高亲和力的pi转运蛋白主要参与从根际的pi吸收，并且在pi饥饿的根的表皮和中柱¹⁹，以及菌根定植后的皮质细胞²⁰中表达最强烈。然而，较少的pi转运蛋白被报道参与豆科植物-根瘤菌共生系统中的pi运输和/或转运。

小瘤中有两条pi进入通路，包括来自根际的直接通路，和自宿主根到小瘤的间接通路²¹。先前的报道已经描述了高亲和力的pi转运蛋白gmpt5，其控制在大豆中从宿主根到小瘤的pi运输⁶。同时，尚未发现允许小瘤从根际直接获得pi的机制。此外，一旦pi被运输和/或被吸收进小瘤中，为了bnf和细菌需求，其中一些pi需要转运到类菌体中。作为这种共生的一部分，受感染的小瘤细胞中的类菌体被来源于植物的共生体膜(sm)包围，所述共生体膜是共生体之间的营养交换界面²²。已经使用一些生物化学和分子方法研究了大豆²³、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)²⁴、百脉根(lotusjaponicas)^25,26和其他豆科植物²⁷中的sm运输蛋白。已经在分离的共生体中证实了钙的运输²⁸，并且还鉴定了编码用于跨越sm移动铁(gmdmt1)²⁹、硝酸盐(n70)³⁰、铵(gmamf3)³¹、硫酸盐(sst1)³²和锌(gmzip1)³³的转运蛋白的基因。最近，详细介绍大豆中sm蛋白质组的工作为鉴定转运蛋白候选物提供了宝贵的资源²³。然而，在sm中起作用的pi转运蛋白并没有在功能上表征。

因此，存在增加豆类植物的产量，特别是谷粒(grain)产量的需求。还存在增加这些植物的氮含量，从而增加它们作为农业生态系统中绿肥来源的价值的需求。本发明解决这两种需求。

技术实现要素：

发明人已经鉴定了在植物根瘤中高度表达的双亲和性磷酸盐(pi)转运蛋白pt7(特别是gmpt7)。有趣的是，发明人发现这种蛋白质在共生体膜和小瘤皮质的皮质细胞中均有表达，因此，gmpt7的过表达显著增加了pi从根际的吸收和pi跨越共生体膜进入类菌体的转运。发明人进一步表明，gmpt7的过表达增加了结瘤(特别是小瘤数目、大小和固氮酶活性)，并且更重要的是增加了植物产量。因此，发明人的发现证明了该转运蛋白在生物固氮中的重要性，并表明该转运蛋白的调节可用于正向影响植物产量。

在本发明的一个方面，提供了一种增加植物产量的方法，所述方法包含增加编码磷酸盐转运蛋白(pt7)多肽的核酸序列的表达。

在一个实施方案中，pt7的表达在至少一个根瘤中增加。

在一个实施方案中，所述产量的增加是种子产量的增加，优选种子数量的增加。优选地，所述产量的增加是相对于对照或野生型植物。

在本发明的另一个方面，提供了增加植物中结瘤、固氮酶活性、生物固氮速率、氮含量和磷含量中的至少一种的方法，该方法包含增加编码磷酸盐转运蛋白(pt7)多肽的核酸序列的表达。

在一个实施方案中，结瘤的增加包含小瘤数量和小瘤尺寸中的至少一个的增加。

在一个实施方案中，所述方法包含在所述植物中引入和表达核酸构建体，所述核酸构建体包含seqidno:1或2中所定义的核酸或其同源物或功能变体。优选地，所述核酸与调控序列可操作地连接，并且其中所述调控序列选自组成型活性启动子和小瘤特异性启动子。

在另一实施方案中，所述核酸构建体进一步包含编码pt5多肽的核酸序列。

在备选的实施方案中，所述方法包含将突变引入植物基因组，其中所述突变是编码pt7多肽的核酸或其同源物或变体的至少一个或更多个另外拷贝的插入，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。优选地，使用zfn、talen或crispr/cas9引入所述突变。

在一个实施方案中，编码所述pt7多肽的所述核酸包含seqidno或1或2或其功能变体或同源物，或由其组成。优选地，所述同源物或变体与seqidno:1或2所代表的序列具有至少80％的序列同一性。

优选地，相对于对照或野生型植物，编码pt7多肽的核酸的表达增加。

在本发明的另一个方面，提供了植物，其中，与对照或野生型植物中的表达水平相比，编码pt7多肽的核酸的表达在至少一个根瘤中增加。优选地，所述植物表达包含如seqidno:1或2中所定义的核酸或其同源物或功能变体的核酸构建体，其中优选所述构建体与调控序列可操作地连接。

在一个实施方案中，所述植物在其基因组中携带突变，其中所述突变是编码pt7多肽的核酸或其同源物或变体的至少一个或更多个另外拷贝的插入，使得所述序列与调控序列可操作地连接。

在一个实施方案中，所述调控序列选自组成型活性启动子、小瘤特异性启动子和内源pt7启动子。

在一个实施方案中，使用靶向基因组工程引入所述突变。优选地，使用zfn、talen或crispr/cas9引入所述突变。

在一个实施方案中，所述编码pt7多肽的核酸由seqidno:1或2或其功能变体或同源物组成。

在本发明的另一个方面，提供了制备具有增加的产量的转基因植物的方法，所述方法包含在植物或植物细胞中引入和表达包含如seqidno:1或2中所定义的核酸或其同源物或功能变体的核酸构建体。

在一个实施方案中，所述方法包含在至少一个根瘤中引入和表达所述核酸构建体。优选地，所述核酸进一步包含调控序列，并且其中优选地，所述调控序列选自组成型活性启动子和小瘤特异性启动子。

在本发明的备选方面，提供了一种制备具有增加的产量的遗传改变的植物的方法，该方法包含将突变引入植物基因组中以增加在至少一个根瘤中编码pt7多肽的核酸序列的表达，其中所述突变是编码pt7多肽的核酸或其同源物或变体的至少一个或更多个另外拷贝的插入，使得所述序列与启动子可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。优选地，使用zfn、talen或crispr/cas9引入所述突变。

在一个实施方案中，所述植物是豆科植物。优选地，所述豆科植物是大豆。

在本发明的另一个方面，提供了通过本文描述的方法获得或可获得的植物。还提供了来源于如本文所述的植物的种子。

在本发明的另一方面，提供了包含如seqidno:1或2中所定义的核酸或其同源物或变体的核酸序列用于增加植物产量的用途。

在本发明的另一个方面，提供了包含pt7核酸序列和调控序列的核酸构建体，其中所述调控序列是enod40启动子。优选地，所述pt7核酸序列编码如seqidno:3中所所定义的pt7多肽或其功能变体或同源物，并且其中所述enod40核酸序列包含seqidno:8或其功能变体。

还提供了包含本文所述的核酸序列的载体，和包含本文所述的核酸构建体或载体的宿主细胞。

在本发明的另一个方面，提供了增加磷酸盐从根际吸收和/或增加跨越共生体膜的磷酸盐转运的方法，所述方法包含增加编码磷酸盐转运蛋白(pt7)多肽的核酸序列的表达。优选地，所述编码pt7多肽的核酸由seqidno:1或2或其功能变体或同源物组成。

在本发明的另一个方面，提供了用于鉴定和/或选择具有增加产量、结瘤、固氮酶活性、生物固氮速率、氮含量和磷含量中的至少一种的植物的方法，该方法包含筛选植物群体并鉴定和/或选择具有比对照植物或来自相同或不同植物群体的植物更高水平的pt7表达的植物。

在本发明的另一方面，提供了如本文所述的植物或其任何部分作为绿肥。

在本发明的最后一个方面，提供了一种增加田地氮含量的方法，该方法包含：

(a)在田间种植至少一种如本文所述的植物；

(b)将所述植物或其部分连根拔起；和

(c)将所述植物或其部分重新耕种到田地。

附图说明

在以下非限制性附图中进一步描述本发明：

图1示出gmpt7蛋白(红色)在野生型(wt)小瘤(a，j)，gmpt7敲减(ri)小瘤(b，k)和gmpt7过表达(ox)小瘤(c，1)的小瘤中的免疫染色。d、e示出a中黄色框的放大图像；f、g示出b中黄色框的放大图像；h、i示出c中黄色框的放大图像；m、n示出j中黄色框的放大图像；o、p示出k中黄色框的放大图像；q、r示出l中黄色框的放大图像。大豆转基因植物在低p(lp，a-c)，足够的p(hp，j-1)中生长。蓝色示出细胞壁和细胞核被dapi染色(黄色箭头)。co，皮质；fz，固氮区。比例尺，200μm。

图2示出了用于转基因小瘤中放射性[³³p]pi吸收和转运的体外试验。a，[³³p]pi在整个小瘤中。b，[³³p]pi在共生体中。ck，空载体小瘤；ox，gmpt7过表达小瘤；ri，gmpt7敲减小瘤；lp，低p；hp，足够的p。数据代表平均值±s.e(n＝3)。星号表示ck和转基因株系之间的显著性差异(学生t检验，p<0.05)。ns，在0.05水平不显著。(c)小瘤中³³pi的吸收。(d)³³pi在类菌体中的转运。将大豆转基因复合植物在低p(5μmkh2po4)营养液中预生长50天，然后收获小瘤并转移到含有0.25μci的h3³³po4的1ml³³p标记营养液中2小时。ev，空载体小瘤；ri，gmpt7敲减小瘤。通过实时定量(qrt)-pcr检测ri小瘤中gmpt7的相应转录物。cpm表示由液体闪烁分析仪测定的每分钟放射性计数。数据是来自独立转基因复合系的三个生物学重复的平均值±se，并且每个株系含有20-30个独立的转基因小瘤。p<0.01，**显著；p<0.01，***显著(学生t检验)。

图3示出gmpt7过表达或敲减对大豆结瘤的影响。a，小瘤生长表现；b，小瘤数目；c，小瘤鲜重；d，不同株系的固氮酶活性。wt，野生型；ox，过表达株系，ri，敲减株系；lp，低p；hp，足够的p。rep，重复。比例尺，3cm。数据代表平均值±s.e(n＝3)。星号表示wt和转基因株系之间的显著性差异(学生t-检验，p<0.05)。ns，在0.05水平不显著。整个实验独立重复两次，且结果显示相似的趋势。

图4示出gmpt7表达水平影响转基因大豆小瘤的发育。(a，b)小瘤截面的固定区用甲苯胺蓝染色。比例尺，100μm。(c，d)100个感染细胞的表面积。大豆全转基因植物在低p(lp，5μmkh2po4)和足够的p条件(hp，250μmkh2po4)下水培生长。数据代表来自十次独立生物学重复的平均值±se。p<0.01，***显著(学生t检验)。

图5示出gmpt7的过表达或敲减对田间大豆产量的影响。a，大豆生长表现。b，种子数量。c，产量。wt，野生型；ox，过表达株系；ri，敲减株系。比例尺，20cm。数据代表平均值±s.e(n＝30)。星号表示wt和转基因株系之间的显著性差异(学生t-检验，p<0.05)。ns，在0.05水平不显著。

图6示出在低p条件下gmpt5和gmpt7的双抑制对转基因复合大豆的结瘤的影响。a-c，小瘤生长表现。c，在转基因小瘤的感染细胞中类菌体携带的gfp。d，小瘤数目；e，小瘤鲜重；f，植物鲜重；g，不同株系的植物氮含量。ck，空载体；ri，gmpt5和gmpt7双抑制株系。rep，重复。比例尺，a、b为2cm；c为20μm。数据代表平均值±s.e(n＝3)。星号表示ck和ri株系之间的显著性差异(学生t-检验，p<0.05)。

图7示出在足够的p条件下大豆小瘤中gmpt基因的表达模式。b，gmpt7在不同大豆组织中的表达模式。lp，低p；hp，足够的p。数据代表平均值±s.e(n＝4)。

图8大豆gmpt7在酵母突变体中的磷酸盐运输活性。(a)通过溴甲酚紫对用gmpt7转化的酵母mb192突变体染色。(b)mb192-gmpt7在不同pi浓度下的³³p运输率。mb192，pi吸收缺陷的酵母突变体，其含有空载体yp112作为阴性对照；mb192(gmpt7)，在mb192中gmpt7与载体yp112融合；mb192(pho84)，在mb192中pho84(pi转运蛋白)与载体yp112融合作为阳性对照。在米氏动力学方程之后用空载体减去pi运输后，gmpt7介导³³pi吸收速度。

图9示出gmpt7的亚细胞定位。a-h，gfp-gmpt7融合蛋白(a-d)和gfp(e-h)的定位，在从拟南芥叶片制备的原生质体中瞬时表达。a、e，gfp图像；b、f，叶绿素荧光；c、g，明视野图像；和d、h，三个通道的组合图像。比例尺，40μm。i，与gfp融合的gmpt7在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。在共聚焦观察之前，通过添加30％蔗糖溶液诱导洋葱表皮细胞中的质壁分离。图像中的gfp、pi、ol和bf代表绿色荧光、红色碘化丙啶(pi)荧光、由前三张图片覆盖和明视野。比例尺，100μm。

图10示出在足够的p条件下gmpt7在小瘤中定位的组织和细胞特异性。a为progmpt7::gus转基因大豆小瘤中的gus染色。b、c为大豆小瘤中gmpt7蛋白质(红色)的免疫染色。c为b中黄色框的放大图像。co，皮质，fz，固氮区。比例尺，200μm。

图11示出gmpt7在大豆全转基因植物中的相对表达。植物在低p(a)(lp，5μmkh2po4)和足够的p条件(b)(hp，250μmkh2po4)下水培生长。wt，野生型；ox，gmpt7过表达株系；ri，gmpt7敲减株系。从小瘤中提取总rna。数据代表来自三个独立生物学重复的平均值±se。p<0.05，*显著；p<0.01，**显著；p<0.01，***显著(学生t检验)。(c)gmpt5和gmpt7在大豆转基因复合植物中的相对表达。ev，空载体；dri，gmpt5和gmpt7双抑制株系。将植物接种根瘤菌，然后将植物移植到具有5μmp和500μmn供应的营养液中持续30天。数据为来自独立转基因复合株系三个生物学重复的平均值±se。p<0.05，*显著；p<0.01，**显著(学生t检验)。

图12示出gmpt7的过表达(ox)或敲减(ri)对大豆生长的影响。a，植物鲜重；b，植物氮含量；c，植物磷含量；d，不同株系gmpt7的相对表达。wt，野生型。lp，低p；hp，足够的p。数据代表平均值±s.e(n＝3)。星号表示wt和转基因株系之间的显著性差异(学生t-检验，p<0.05)。ns，在0.05水平不显著。

图13示出在大豆小瘤中由两种pi转运蛋白gmpt5和gmpt7协同控制的pi吸收和转运的拟建模型。pi通过两条通路进入小瘤，包括间接通路①和直接通路②。对于间接通路，pi通过维管组织从宿主根运输至小瘤，并由gmpt5控制。对于直接通路，pi通过gmpt7直接从根际吸收到小瘤中。gmpt7还负责穿过感染细胞的sm的共生体之间的pi转运③。

图14示出gmpt7过量表达或敲减对田间大豆豆荚数量和谷粒重量的影响。wt，野生型；ox，过表达株系；ri，敲减株系。数据代表平均值±s.e(n＝30)。星号表示wt和转基因株系之间的显著性差异(学生t-检验，p<0.05)。ns，在0.05水平不显著。

图15示出gmpt7的过表达增加大豆产量高达36％。将接种根瘤菌的植物播种在酸性土壤上，在成熟期收获豆荚用于产量评估。wt，野生型；ox，gmpt7过表达株系；ri，gmpt7敲减株系。数据代表来自30个转基因植物的平均值±se。p<0.05，*显著性；p<0.01，**显著性；p<0.01，***显著(学生t检验)。

图16示出小瘤中gmpt7表达与田间大豆的小瘤数量、豆荚数量和种子重量之间的相关性。显示了两个群体；具有194个种质的核心种质和具有103个子代的重组自交系(ril)群体。除了与ril中小瘤数量的相关性外，所有相关性是显著的。(a)核心种质中gmpt7表达与小瘤数量之间的相关性。相关系数为0.305，p值为0.000130，且样本数为153。(b)核心种质中gmpt7表达与豆荚数量之间的相关性。相关系数为0.303，p值为0.000131，且样本数为154。(c)核心种质中gmpt7表达与大豆产量之间的相关性。相关系数为0.308，p值为0.0000566，且样本数为165。(d)ril中gmpt7表达与小瘤数量之间的相关性。相关系数为0.135，p值为0.228，且样本数为81。(e)ril中gmpt7表达与豆荚数量之间的相关性。相关系数为0.322，p值为0.00381，且样本数为79。(f)ril中gmpt7表达与大豆产量之间的相关性。相关系数为0.313，p值为0.00582，且样本数为76。

具体实施方式

现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确地相反指出，否则如此定义的每个方面可以与任何其他方面组合。特别地，任何被表明为优选或有利的特征可以与被表明为优选或有利的任何其他特征组合。

除非另有说明，本发明的实践将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、重组dna技术和生物信息学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分说明。

本文所用的术语“种子”、“谷粒”和“豆”可互换使用。

如本文所用，词语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”可互换使用，并且旨在包括dna分子(例如，cdna或基因组dna)、rna分子(例如，mrna)、天然存在的、突变的、合成的dna或rna分子，以及使用核苷酸类似物产生的dna或rna的类似物。它可以是单链或双链的。此类核酸或多核苷酸包括但不限于结构基因的编码序列、反义序列和不编码mrna或蛋白质产物的非编码调控序列。这些术语也包括基因。术语“基因”或“基因序列”广泛用于指与生物学功能相关的dna核酸。因此，基因可以包括基因组序列中的内含子和外显子，或者可以仅包含cdna中的编码序列，和/或可以包括与调控序列组合的cdna。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，且是指通过肽键连接在一起的任何长度的聚合形式的氨基酸。

出于本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”意指关于例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体或利用根据本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物体，通过重组方法产生的所有那些构建体，其中，

(a)编码可用于本发明方法的蛋白质的核酸序列，或

(b)与根据本发明的核酸序列可操作地连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)和b)

均没有位于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，对于修饰可以采取例如一个或更多个核苷酸残基的取代、添加、缺失、倒位或插入的形式。天然遗传环境被理解为意指原始植物中的天然基因组或染色体基因座或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，优选至少部分地保留核酸序列的天然遗传环境。环境至少在一侧位于核酸序列的侧翼，并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然存在的表达盒(例如核酸序列的天然启动子与编码可用于本发明方法的多肽的相应核酸序列的天然存在的组合，如上所定义)变成转基因表达盒，当通过非天然的、合成的(“人工”)方法(例如诱变处理)修饰该表达盒时。合适的方法描述于例如在us5,565,350或wo00/15815中，两者均以引用的方式并入。

因此，用于本发明目的的转基因植物应理解为意指，如上所述，本发明方法中使用的核酸不在所述植物的基因组中的其天然基因座，核酸可能是同源或异源表达。然而，如上所述，转基因还意味着，虽然根据本发明的不同实施方案的核酸处于植物基因组中的其天然位置，但关于天然序列已经对该序列进行了修饰，和/或已经对天然序列的调控序列进行了修饰。转基因优选理解为意指根据本发明的核酸在基因组中的非天然基因座处的表达，即发生核酸的同源或优选异源表达。

本发明的方面涉及重组dna技术，并且排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。

如本文所用，术语“增加表达”意指pt7的核苷酸和/或蛋白质水平的增加。

出于本发明的目的，“突变体”植物是与天然存在的野生型(wt)植物相比已经遗传改变的植物。在一个实施方案中，突变植物是使用诱变方法(例如本文所述的诱变方法)与天然存在的野生型(wt)植物相比已经改变的植物。在一个实施方案中，诱变方法是靶向基因组修饰或基因组编辑。在一个实施方案中，与野生型序列相比，使用诱变方法改变了植物基因组。在一个实例中，与野生型植物相比，突变可用于插入pt7基因序列以增强pt7核酸的表达水平。在一个实例中，pt7序列与内源启动子可操作地连接。此类植物具有如本文所述的改变的表型，例如增加的种子产量。因此，在该实例中，增加的种子产量是通过改变的植物基因组的存在而赋予，并且不通过植物中表达的转基因的存在而赋予。

在本发明的一个方面，提供了一种增加植物产量的方法，该方法包含增加编码磷酸盐转运蛋白(pt7)多肽的核酸序列的表达。

术语“产量”通常是指经济价值的可测量产品，通常与指定的作物、区域和时间段相关。单株植物部分基于其数量、大小和/或重量直接有助于产量。实际产量是作物和年度的每平方米产量，这是通过将总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米来确定的。

因此，根据本发明，产量包含以下一种或更多种，并且可以通过评估以下一种或更多种来测量：每株植物增加的种子产量、增加的种子填充率、增加的饱满种子数量、增加的收获指数、增加的活力/发芽效率、增加的种子或豆荚或豆或谷粒的数量或大小或重量、增加的生长或增加的分枝(例如具有更多分枝的花序)、增加的生物量、增加的鲜重或谷粒填充。优选地，增加的产量包含每株植物增加的种子、豆或豆荚的数量或重量、增加的千粒重(tkw)、增加的生物量、增加的鲜重和增加的生长中的至少一种。相对于对照或野生型植物，产量增加。例如，与对照植物相比，产量增加2％、3％、4％、5％-50％或更多，例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在一个实施方案中，该方法包含至少或仅在植物的根瘤中增加编码pt7多肽的核酸序列的表达。在进一步优选的实施方案中，pt7的表达在至少一个根瘤和在根瘤的皮质细胞和共生体膜中的至少一个，优选两个中增加。因此，在一个实施方案中，该方法包含在至少一个根瘤中增加pt7的表达，且在所述根瘤内，更优选在皮质细胞和共生体膜中至少一个，优选两个中增加pt7的表达。在一个实施方案中，pt7的表达仅在根瘤中，优选皮质细胞和/或共生体膜中增加。因此，在一个实施方案中，该方法可以进一步包含测量至少一个根瘤中pt7表达水平的步骤，并且优选地将所述水平与野生型或对照植物中的表达水平进行比较。测定根瘤中pt7水平的技术是本领域技术人员公知的。

在本发明的另一个实施方案或方面，提供了增加植物的结瘤、固氮酶活性、生物固氮速率(bnf)、总氮含量和磷含量中的至少一种的方法。在一个实施方案中，与对照或野生型植物相比，所述增加为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。在一个实施方案中，除增加产量之外，该方法包含在植物中增加结瘤、固氮酶活性、生物固氮速率(bnf)、总氮含量和磷含量中的至少一种。

“结瘤”是指小瘤发育，并且结瘤的增加可以反映在每株植物的小瘤数量和/或重量的增加。在一个实施方案中，与对照或野生型植物相比，结瘤增加至少30％、40％、50％、55％、60％、65％或70％。

“固氮酶活性”是指根瘤菌固氮酶的活性，所述根瘤菌固氮酶将氮转化为氨和h2。测定固氮酶活性的方法是本领域技术人员公知的。例如，通过小瘤产生最终产物h2的速率可用作测定固氮酶活性的手段。或者，固氮酶能够将乙炔还原成乙烯的速率可用作固氮酶活性的量度(“乙炔还原方法”，如david等人1980年所述，其通过引用并入本文³⁴)。“生物固氮”或bnf是指氮转化为氨并并入植物组织中的速率。在一个实施方案中，与对照或野生型植物相比，固氮酶活性增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

在本发明的另一方面，提供了一种增加从根际吸收磷酸盐到根部和/或增加跨越共生体膜的磷酸盐转运的方法，其中所述方法包含增加编码pt7多肽的核酸序列的表达。优选地，所述方法包含增加从根际的磷酸盐的吸收并增加跨共生体膜的磷酸盐的转运。在该实施方案中，增加是从根际吸收磷酸盐导致至小瘤中的磷酸盐吸收增加。类似地，磷酸盐转运的增加可以通过测定至共生体中的总磷酸盐吸收来测定。在一个实施方案中，与对照或野生型植物相比，所述增加为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

根据本发明的各个方面，术语“增加”、“提高”或“增强”可以互换使用。

在一个实施方案中，观察上述表型，不管植物是否在磷酸盐充足或缺乏条件下生长。通常，对于大多数植物，可交换的土壤p浓度低于10mg/kg(ppm)被认为是p缺乏的。在这种情况下，超过40％的耕地土壤将是p缺乏的，特别是在热带和亚热带地区(kochian等，2004)。

在一个实施方案中，该方法包含在植物中引入和表达包含pt7核酸的核酸构建体。在一个实施方案中，pt7核酸序列编码如seqidno:3中所定义的pt7多肽。在进一步优选的实施方案中，pt7核酸序列包含seqidno:1或2或其同源物或变体，或由其组成。在一个实施方案中，pt7是大豆pt7或gmpt7。

在一个实施方案中，可以使用驱动过表达的启动子表达核酸序列。根据本发明的过表达意指以高于内源pt7基因的表达的水平使转基因表达，所述内源pt7基因的表达由其内源对应物驱动。在一个实施方案中，过表达可以由组成型启动子驱动。“组成型启动子”是指在大多数但不一定是所有生长和发育阶段以及在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒启动子(camv35s或19s)、水稻肌动蛋白启动子、玉米泛素启动子、rubisco小亚基、玉米或苜蓿h3组蛋白、ocs、sad1或2、gos2或任何赋予增强表达的启动子。

在备选实施方案中，调控序列是组织特异性启动子。组织特异性启动子是转录控制元件，其在植物发育期间的特定时间仅在特定细胞或组织中有活性。在优选的实施方案中，启动子是小瘤特异性启动子。例如，启动子可以是内源性pt7启动子或gmpt7(seqidno:4)。或者，启动子可以是小瘤特异性启动子，例如内源enod40(早期结瘤素40)启动子。因此，在一个实施方案中，小瘤特异性启动子是enod40，其包含seqidno:8定义的序列或其功能变体，或由其组成。功能变体如本文所定义。

在一个实施方案中，核酸和调控序列来自相同的科。在另一个实施方案中，核酸和调控序列来自不同的植物科、属或种。

根据本发明的所有方面，包括上述方法并包括如下所述的植物、方法和用途，术语“调控序列”在本文中可与“启动子”互换使用，并且所有术语在广义上下文中是指能够影响与它们连接的序列的表达的调控核酸序列。术语“调控序列”还包括在细胞、组织或器官中赋予、活化或增强核酸分子表达的合成融合分子或衍生物。

术语“启动子”通常是指位于基因转录起始上游的核酸控制序列，所述核酸控制序列参与rna聚合酶和其他蛋白质的结合，从而指导可操作连接的核酸的转录。上述术语包括衍生自经典真核基因组基因的转录调控序列(包括准确的转录起始所需的tata盒，具有或不具有ccaat盒序列)和另外的调控元件(即上游激活序列，增强子和沉默子)，所述另外的调控元件响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达。该术语还包括经典原核基因的转录调控序列，在这种情况下，它可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。

“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列区段表达的调控元件。用于本文所述核酸构建体中的核苷酸序列上游的启动子也可通过一个或更多个核苷酸取代、插入和/或缺失进行修饰，不会干扰任一启动子、开放阅读框(orf)或3'-调控区(如终止子)或位于远离orf的其他3'调控区的功能或活性。此外，可能通过修饰它们的序列来增加启动子的活性，或者它们被更活跃的启动子，甚至来自异源生物的启动子完全替换。为了在植物中表达，如上所述，pt7核酸序列优选可操作地连接或包含合适的启动子，所述启动子在正确的时间点并以所需的空间表达模式表达基因。

为了鉴定功能等同的启动子，可以分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式，例如通过将启动子与报告基因可操作地连接并测定报告基因在植物各种组织中的表达水平和模式。合适的熟知的报告基因是本领域技术人员已知的，包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。

如本文所用的术语“可操作地连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，使得启动子序列能够启动目的基因的转录。

在进一步的实施方案中，核酸构建体可以进一步包含编码第二磷酸盐转运蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，第二磷酸盐转运蛋白是pt5，更优选地大豆pt5或gmpt5。优选地，pt5的核酸序列包含seqidno:5或6，或由其组成，并且编码如seqidno:7所定义的多肽。或者，所述方法可包含引入和表达包含第二磷酸盐转运蛋白的第二核酸构建体，其中优选地第二磷酸盐转运蛋白是如本文所定义的pt5。在该实施方案中，可以在第一核酸构建体之前、之后或同时在植物中引入和表达第二核酸构建体。

在一个实施方案中，用本文所述的核酸构建体稳定转化后代植物，并且所述后代植物包含可遗传地维持在植物细胞中的外源多核苷酸。所述方法可包括验证构建体稳定整合的步骤。所述方法还可包含从选择的后代植物收集种子的另外的步骤。

在本发明的备选实施方案中，所述方法包含将突变引入植物基因组，其中所述突变是插入编码pt7多肽的核酸或其同源物或变体的至少一个或更多个另外的拷贝，并且如本文所定义的，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。在一个实施方案中，调控序列是内源pt7启动子。优选地，所述突变导致相对于对照或野生型植物pt7核酸的表达增加。优选地，所述突变导致pt7在至少一个根瘤中的表达增加，更优选在小瘤皮质的皮质细胞和根瘤内的共生体膜中的至少一个或两个中的表达增加。

在进一步的实施方案中，所述方法可以进一步包含将第二突变引入植物基因组，其中突变是插入编码pt5多肽的核酸或其同源物或其变体的至少一个或更多个另外拷贝，并且如本文所定义的，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。

在一个实施方案中，使用zfn、talen或crispr/cas9引入所述突变。

在进一步的实施方案中，所述方法可进一步包含以下步骤中的至少一个或更多个：评估转基因或遗传改变的植物的表型，测量至少一个产量特征，优选为种子数量、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、磷含量和/或氮含量，并比较所述表型以确定野生型或对照植物中至少一个产量的增加，优选为种子数量、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、磷含量和/或氮含量的增加。换句话说，所述方法可以包括筛选植物以获得所需表型的步骤。在另一实施方案中，所述方法可以进一步包含筛选植物以获得增加的pt7表达水平，其中所述增加是相对于对照或野生型植物。

在一个实施方案中，相对于对照或野生型植物，编码pt7多肽的核酸的表达增加。优选地，所述增加为对照或野生型植物中表达水平的至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或至少150倍高。如已经讨论的，用于测量所需核酸或蛋白质表达水平的技术是本领域熟知的。

本发明还涉及植物，优选转基因的或突变的或遗传改变的植物，其特征在于与对照或野生型植物中的表达水平相比，pt7的表达增加。

在一个实施方案中，与对照或野生型植物中的表达水平相比，pt7的表达在至少一个根瘤中增加。优选地，在所有根瘤中所述表达增加。特别地，在至少一个根瘤内，pt7的表达在小瘤皮质的皮质细胞和共生体膜中的至少一个，优选两个中增加。在一个具体实施方案中，pt7的表达可以在至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的根瘤中增加。

在进一步的实施方案中，所述增加为对照或野生型植物中表达水平的至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或至少150倍高。如已经讨论的，用于测量所需核酸或蛋白质表达水平的技术是本领域熟知的。

所述植物的特征还在于其显示产量、种子数量、生物量、鲜重结瘤、生物固氮速率、小瘤数量、小瘤尺寸、固氮酶活性、磷含量和氮含量中的至少一种的增加。与对照或野生型植物相比，这种增加为至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％或130％。

在一个实施方案中，植物表达对所述植物“外源”的多核苷酸，即通过除有性杂交之外的任何方式引入植物中的多核苷酸。下面描述可以实现这一点的方式的实例。在所述方法的一个实施方案中，外源核酸在转基因植物中表达，其是包含对于所述植物不是内源的而是来自另一种植物的如seqidno:1或2中定义的核酸或其同源物或功能变体的核酸构建体。例如，gmpt7构建体可以在不是大豆的另一种植物或豆科植物中表达。

在备选的实施方案中，内源核酸构建体在转基因植物中表达。例如，gmpt7构建体可以在大豆中表达。因此，在一个实施方案中，植物表达包含seqidno:1或2中定义的核酸或其同源物或功能变体的核酸。

在另一个实施方案中，植物表达编码第二磷酸盐转运蛋白的外源或内源核酸序列。在一个实施方案中，第二磷酸盐转运蛋白是pt5，更优选大豆pt5或gmpt5。优选地，pt5的核酸序列包含seqidno:5或6或由seqidno:5或6组成，并编码如seqidno:7中所定义的多肽。

在备选的实施方案中，植物在其基因组中携带突变，其中所述突变是插入编码pt7多肽的核酸或其同源物或变体的至少一个或更多个另外拷贝，使得所述序列与调控序列可操作地连接。优选地，使用靶向基因组修饰引入所述突变，更优选地，使用zfn、talen或crispr/cas9引入所述突变。在进一步的实施方案中，植物可在植物基因组中进一步包含第二突变，其中突变是插入编码pt5多肽的核酸或其同源物或其变体的至少一个或更多个另外拷贝，并且如本文所定义，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。

优选地，核酸序列与调控序列可操作地连接。调控序列可以如上所定义的。

在本发明的另一个方面，提供了一种制备转基因植物的方法，其特征在于所述植物显示产量增加，所述方法包含在植物或植物细胞中引入和表达包含seqidno:1或2中定义的核酸或其同源物或功能变体的核酸构建体。

在进一步的实施方案中，核酸构建体可以进一步包含编码第二磷酸盐转运蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，第二磷酸盐转运蛋白是pt5，更优选大豆pt5或gmpt5。优选地，pt5的核酸序列包含seqidno:5或6或由seqidno:5或6组成，并编码如seqidno:7中所定义的多肽。或者，所述方法可包含引入和表达包含第二磷酸盐转运蛋白的第二核酸构建体，其中优选地第二磷酸盐转运蛋白是如本文所定义的pt5。在该实施方案中，可以在第一核酸构建体之前、之后或同时在植物中引入和表达第二核酸构建体。

所述方法可进一步包含从植物或植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含选自seqidno:1或2的核酸序列或编码如seqidno:3中所定义的pt7蛋白质的核酸，并获得来源于转基因植物的后代植物，其中所述后代表现出产量、种子数、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、小瘤数量、小瘤尺寸、固氮酶活性、磷含量和氮含量中的至少一种的增加。

在进一步的实施方案中，所述方法可进一步包含以下至少一个或更多个步骤：评估转基因或遗传改变的植物的表型，测量至少一个产量，优选为种子数量、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、磷含量和/或氮含量，并比较所述表型以确定野生型或对照植物中至少一个产量的增加，优选为种子数量、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、磷含量和/或氮含量的增加。换句话说，所述方法可以包括筛选植物以获得所需表型的步骤。

用于产生本发明的转基因植物的转化方法是本领域已知的。因此，根据本发明的各个方面，将如本文所定义的核酸构建体引入植物中并表达为转基因。通过被称为转化的过程将核酸构建体引入所述植物中。本文提及的术语“引入”或“转化”包括将外源多核苷酸转移到宿主细胞中，不论用于转移的方法如何。能够随后克隆繁殖的植物组织，无论是通过器官发生还是胚胎发生，可以用本发明的遗传构建体和从其再生的整株植物进行转化。选择的特定组织将根据可用于并且最适合于被转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。示例性组织靶标包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、现有的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞中，并且可以保持非整合，例如，作为质粒。或者，它可以整合到宿主基因组中。然后可以以本领域技术人员已知的方式将得到的转化植物细胞用于再生转化植物。

将外源基因转移到植物的基因组中称为转化。植物转化现在在许多物种中是常规技术。有利地，可以使用几种转化方法中的任何一种将目的基因引入合适的祖细胞中。用于从植物组织或植物细胞转化和再生植物的所述方法可用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离dna摄取的化学物质、将dna直接注入植物中、基因枪射击法、使用病毒或花粉进行转化和显微注射法。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法、原生质体的电穿孔法、显微注射到植物材料中、dna或rna包被的粒子轰击、用(非整合的)病毒感染等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选通过根癌土壤杆菌(agrobacteriumtumefaciens)介导的转化产生。

为了选择转化的植物，将转化中获得的植物材料置于选择条件下，以便可以将转化的植物与未转化的植物区分开。例如，可以种植以上述方式获得的种子，并且在初始生长期后，通过喷雾进行适当的选择。另一种可能性是，如果合适，在灭菌后，使用合适的选择剂在琼脂平板上使种子生长，使得仅转化的种子能够生长成植物。或者，筛选转化的植物以获得存在选择标记的植物。在dna转移和再生之后，还可以例如使用southern分析，对于目的基因的存在、拷贝数和/或基因组组织，评估推定转化的植物。可选地或另外地，可以使用northern和/或western分析监测新引入的dna的rna和蛋白质表达水平，这两种技术对于本领域普通技术人员来说是公知的。

产生的转化植物可以通过多种方式繁殖，例如通过克隆繁殖或经典育种技术。例如，第一代(或t1)转化植物可以是自交的并且选择纯合的第二代(或t2)转化体，然后可以通过经典育种技术进一步繁殖t2植物。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如，转化为含有表达盒的所有细胞)；转化的和未转化的组织的移植物(例如，在植物中，移植到未转化的接穗上的转化的砧木)。

在本发明的另一个方面，提供了产生突变的或遗传改变的植物的方法，所述方法包含将突变引入植物基因组中，其中所述突变是插入编码pt7多肽的核酸或其同源物或其变体的至少一个或更多个另外的拷贝，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。优选地，所述植物特征在于所述植物显示出本文所述的所需表型之一的增加。例如，所述植物显示出产量增加。或者，该植物特征在于所述植物显示在至少一个根瘤中，如本文所述，并且在小瘤中，在小瘤皮质的皮质细胞和共生体膜中的至少一个，优选两个中pt7表达增加。

在进一步的实施方案中，所述方法可进一步包含将第二突变引入植物基因组，其中突变是插入编码pt5多肽的核酸或其同源物或其变体的至少一个或多个另外拷贝，并且如本文所定义的，使得所述序列与调控序列可操作地连接，并且其中使用靶向基因组编辑引入这种突变。

在优选的实施方案中，通过诱变或靶向基因组编辑引入突变。

调控序列可以是内源pt7启动子。在上述实施方案中，“内源”核酸可以指植物基因组中的天然的或自然的序列。

靶向基因组修饰或靶向基因组编辑是基因组工程技术，其通过同源重组(hr)介导的重组事件使用靶向dna双链断裂(dsb)来刺激基因组编辑。为了通过引入位点特异性dnadsb实现有效的基因组编辑，可以使用四种主要类别的可定制(customisable)dna结合蛋白：来源于微生物移动遗传元件的大范围核酸酶、基于真核转录因子的zf核酸酶、来自黄单胞菌属(xanthomonas)细菌的转录激活因子样效应子(tale)和来自ii型细菌适应性免疫系统crispr(成簇规则间隔的短回文重复序列)的rna引导的dna核酸内切酶cas9。大范围核酸酶、zf和tale蛋白质都通过蛋白质-dna相互作用识别特定的dna序列。尽管大范围核酸酶整合了核酸酶和dna结合结构域，但zf和tale蛋白质分别由靶向dna的3个或1个核苷酸(nt)的单独模块组成。zf和tale可以以所需的组合组装并连接到foki的核酸酶结构域，以指导对特定的基因组基因座的核酸溶解活性。

在通过细菌iii型分泌系统递送到宿主细胞中后，tal效应子进入细胞核，与宿主基因启动子中的效应子特异性序列结合并激活转录。它们的靶向特异性由串联的33-35个氨基酸重复的中心结构域决定。随后是20个氨基酸的单个截短重复序列。所检查的大多数天然存在的tal效应子具有12至27个完整重复序列。

这些重复仅通过两个相邻的氨基酸(它们的重复可变二残基(rvd))彼此不同。确定tal效应子将识别哪个单核苷酸的rvd：一个rvd对应于一个核苷酸，四个最常见的rvd各自优先与四个碱基之一相关联。天然存在的识别位点均匀地在tal效应子活性所需的t之后。tal效应子可以与foki核酸酶的催化结构域融合以产生tal效应子核酸酶(talen)，所述tal效应子核酸酶在体内进行靶向dna双链断裂(dsb)以用于基因组编辑。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在us8,440,431、us8,440,432和us8,450,471中。cermakt等人描述了一组定制的质粒，可与金门(goldengate)克隆方法使用以组装多个dna片段。如其中所述，金门方法使用iis型限制性内切核酸酶，其在其识别位点外切割以产生独特的4bp突出端。通过在相同的反应混合物中消化和连接加快克隆，因为正确的组装消除了酶识别位点。组装定制talen或tal效应子构建体并且涉及两个步骤：(i)将重复模块组装成1-10个重复序列的中间阵列和(ii)将中间阵列连接到骨架中以制备最终构建体。

可根据本发明的各个方面使用的另一种基因组编辑方法是crispr。该技术在基因组编辑中的使用在本领域中有充分的描述，例如在us8，697，359和本文引用的参考文献中。简而言之，crispr是一种参与针对入侵噬菌体和质粒的防御的微生物核酸酶系统。微生物宿主中的crispr基因座含有crispr相关(cas)基因以及能够编程crispr介导的核酸切割的特异性的非编码rna元件(sgrna)的组合。已经在多种细菌宿主中鉴定了三种类型(i-iii)的crispr系统。每个crispr基因座的一个关键特征是存在一系列重复序列(直接重复)，这些重复序列间由短的非重复序列段(间隔区)间隔。非编码crispr阵列在直接重复内被转录和切割成含有单独间隔序列的短crrna，其将cas核酸酶引导至靶位点(原间隔区)。ii型crispr是最充分表征的系统之一，并在四个连续步骤中执行靶向dna双链断裂。首先，从crispr基因座转录两种非编码rna，pre-crrna阵列和tracrrna。其次，tracrrna与pre-crrna的重复区杂交，并介导pre-crrna加工成含有单独间隔序列的成熟crrna。第三，成熟的crrna:tracrrna复合物通过crrna上的间隔区和原间隔区相邻基序(pam)旁边的靶dna上的原间隔区之间的沃森-克里克碱基配对将cas9引导至靶dna，这是靶识别的另一要求。最后，cas9介导靶dna的切割以便在原间隔区内产生双链断裂。

因此，cas9是ii型crispr-cas系统的标志性蛋白质，并且是通过两种非编码rna：crisprrna(crrna)和反式激活crrna(tracrrna)的复合物引导至与pam(原间隔区相邻基序)序列基序相邻的dna靶序列的大单体dna核酸酶。cas9蛋白含有与ruvc和hnh核酸酶同源的两个核酸酶结构域。hnh核酸酶结构域切割互补dna链，而ruvc样结构域切割非互补链，结果在靶dna中引入钝切口。cas9与sgrna的异源表达能够将位点特异性双链断裂(dsb)引入来自各种生物体的活细胞的基因组dna中。对于真核生物中的应用，已经使用了最初来自细菌化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)的密码子优化版本的cas9。

单指导rna(sgrna)是与cas9核酸酶形成复合物的crispr/cas系统的第二个组分。sgrna是通过将crrna与tracrrna融合而产生的合成rna嵌合体。位于其5'末端的sgrna指导序列赋予dna靶特异性。因此，通过修饰指导序列，可以产生具有不同靶特异性的sgrna。指导序列的规范长度为20bp。在植物中，已经使用植物rna聚合酶iii启动子(例如u6和u3)表达sgrna。

用于本发明方法中的cas9表达质粒可以如本领域所述构建。

因此，本发明的方面涉及定向诱变方法，特别是基因组编辑，并且在一个优选实施方案中，排除仅基于通过传统育种方法产生植物的实施方案。

本发明还涉及通过本文描述的任何方法获得或可获得的植物。

在另一个实施方案中，编码pt7多肽的核酸包含如seqidno:1或2中所定义的序列或其功能变体或同源物，或由其组成，并编码如seqidno:3所定义的pt7蛋白或其功能变体或同源物。在一个实施方案中，pt7是gmpt7(即glycinemaxpt7)。

如本文中关于seqidno:1、2或3中任一个所使用的术语“核酸序列的功能变体”是指保留完整非变体的生物学功能，例如，当在植物中表达时，赋予增加的产量、种子数、生物量、鲜重、结瘤、生物固氮速率、磷含量和/或氮含量中的至少一种的变体基因序列或部分基因序列。功能变体还包含具有不影响功能的序列改变(例如在非保守残基中)的目的基因的变体。还涵盖与本文所示的野生型序列相比基本一致的变体，即仅具有一些序列变异(例如在非保守残基中)，并且具有生物学活性。

因此，如本领域技术人员将理解的那样，应理解的是，本发明的方面(包括方法和用途)不仅涵盖包含选自seqidno.1-3的序列或由seqidno.1-3的序列组成的核酸序列或氨基酸序列，还涵盖不影响所得蛋白质的生物学活性和功能的这些seqidno的功能变体或部分。导致在给定位点产生不影响编码多肽的功能特性的不同氨基酸的核酸序列中的改变是本领域众所周知的。例如，用于氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一种疏水性较弱的残基(如甘氨酸)或疏水性更强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替代另一个(例如天冬氨酸替代谷氨酸)或一个带正电的残基替代另一个(例如赖氨酸替代精氨酸)的变化也可以预期产生功能等同的产物。导致多肽分子的n端和c端部分发生改变的核苷酸改变也不会预期改变多肽的活性。所提出的各种修饰都在本领域的常规技术范围内，正如编码产物的生物活性的保留所确定的。

在一个实施方案中，功能变体具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的与非变体核酸或氨基酸序列的整体序列同一性。

如本文所用的术语同源物还指来自另一植物物种的gmpt7同源物。按递增的优先顺序，gmpt7多肽或gmpt7核酸序列的同源物与由seqidno:1，2或3所示的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的整体序列同一性。在一个实施方案中，整体序列同一性至少为37％。在一个实施方案中，整体序列同一性为至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％、最优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。

术语“pt7”是指质膜定位的磷酸盐转运蛋白，磷酸盐转运蛋白7，其中发明人惊奇地证明磷酸盐转运蛋白7是双亲和力(或广亲和力，这些术语在本文中等同)磷酸盐转运蛋白，所述磷酸盐转运蛋白7在共生体膜和小瘤皮质的皮质细胞中均有表达。

gmpt7同源物的功能变体也在本发明的范围内。

如果两个序列中核苷酸或氨基酸残基的序列分别在如下所述进行最大对应比对时相同，则称两个核酸序列或多肽为“一致的”。在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“一致的”或百分比“一致性”是指在比较窗口中进行比较和比对以获得最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的，相同的或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。当关于蛋白质或肽使用序列一致性的百分比时，认识到不一致的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中用氨基酸残基取代具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列一致性百分比以校正取代的保守性。进行这种调整的手段是本领域技术人员所熟知的。对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定备选参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。适用于确定百分比序列一致性和序列相似性的算法的非限制性实例是blast和blast2.0算法。

因此，本发明和本文所述的gmpt7核苷酸和/或氨基酸序列也可以用于从其它生物体，特别是其它植物，例如作物植物中分离相应的序列。以此方式，如pcr、杂交等的方法可用于基于它们与本文所述序列的序列同源性来鉴定这类序列。鉴定和分离同源物时，也可考虑序列拓扑和特征结构域结构。序列可以基于其与整个序列或其片段的序列一致性来分离。在杂交技术中，全部或部分已知核苷酸序列被用作探针，其选择性地与存在于来自所选植物的克隆基因组dna片段或cdna片段群体(即基因组或cdna文库)中的其它相应核苷酸序列杂交。杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团或任何其它可检测标记进行标记。用于制备用于杂交和用于cdna和基因组文库构建的探针的方法通常是本领域已知的，并且公开于sambrook等人，(1989)molecularcloning:alibrarymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress，plainview，纽约)中。

这些序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是探针与其靶序列杂交，相比与其它序列杂交，可检测的程度更高(例如背景的至少2倍高)的预期条件。严格条件是依赖于序列的，并且在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件将是其中盐浓度小于约1.5mna离子，典型地约0.01至1.0mna离子浓度(或其它盐)，在ph7.0至8.3下，以及温度为对于短探针(例如10至50个核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的那些条件。杂交的持续时间通常小于约24小时，通常约4至12小时。严格条件也可以通过加入去稳定剂(如甲酰胺)来实现。

在一个实施方案中，提供了一种增加植物中产量、结瘤、固氮酶活性、生物固氮速率、氮含量和磷含量的方法，如本文所述，该方法包含增加pt7的表达，其中pt7基因包含或由以下组成：

a.编码如seqidno:3中定义的多肽的核酸序列；或

b.seqidno:1或2中定义的核酸序列；或

c.与(a)或(b)具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的整体序列同一性的核酸序列；或

d.编码如本文所定义的pt7多肽的核酸序列，其能够在如本文定义的严格条件下与(a)至(d)中任一项的核酸序列杂交。

在本发明的另一个方面，提供了包含pt7核酸和调控序列的核酸构建体。在一个实施方案中，pt7核酸编码如seqidno:3中所定义的pt7多肽。在另一个实施方案中，pt7核酸序列包含seqidno:1或2中定义的核酸序列或其同源物或功能变体，或由其组成。在优选的实施方案中，调控序列是enod40启动子。在进一步优选的实施方案中，enod40序列包含seqidno:8中定义的核酸序列，或由其组成。功能变体或同源物如上所述。在一个实施方案中，核酸和调控序列来自相同的植物科。在另一个实施方案中，核酸和调控序列来自不同的植物科、属或种。在本发明的另一方面，提供了包含如本文定义的核酸构建体的载体。

在另一方面，本发明涉及用如上所述的核酸构建体或载体转化的分离的宿主细胞。宿主细胞可以是细菌细胞，例如根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)或分离的植物细胞。本发明还涉及包含如本文所述的培养基和分离的宿主细胞的培养基或试剂盒。

上文描述的核酸构建体或载体可用于使用本领域已知的和本文描述的转化方法产生转基因植物。

因此，在另一方面，本发明涉及表达如本文所述的核酸构建体的转基因植物。

在本发明的另一个方面，提供了如本文所述的核酸或核酸构建体在植物中增加产量的用途。或者，提供核酸或核酸构建体用于增加产量、种子数量、生物量、结瘤(例如小瘤数量，小瘤大小)、生物固氮速率、固氮酶活性、磷含量和氮含量中的至少一种的用途。

在本发明的进一步的方面，提供了如本文所定义的植物作为绿肥的用途。几个世纪以来，人们就知道，当豆科植物轮作生长时，它们可以提高其他作物的产量。本发明的植物，其特征在于增加的氮含量(与野生型或对照植物相比)，通过将本发明的连根拔起的植物或播种的植物部分留在田地上枯萎以作为覆盖物和/或土壤改良剂来充当绿肥。通常，用作绿肥的植物在绿色时或在开花后不久在土壤中耕种并掺入土壤中。

因此，在本发明的相关方面，提供了一种增加田地(即田地的土壤)的氮含量(即总氮含量)的方法，该方法包含(a)在田地种植至少30株如本文所定义的植物，(b)将植物或其部分连根拔除，优选在绿色时或开花后，和(c)将植物或其部分重新翻耕到田地中。在一个实施方案中，与其中本发明的植物或其部分未在田地生长并如上所述重新耕种的田地相比，田地的氮含量增加。

发明人进一步鉴定，在相同物种的植物群体中存在pt7蛋白质水平的天然变异，此外，如图16所示，pt7表达水平的增加与小瘤数量、豆荚数量和产量的增加有关。

因此，在本发明的另一个方面，提供了一种用于筛选植物群体并鉴定和/或选择和/或育种具有如下pt7表达水平的植物的方法，其中优选在其种质中，所述pt7表达水平高于在相同或不同植物群体中的至少一种其他植物中的pt7表达水平。所述方法可进一步包含选择所述植物用于进一步繁殖。在一个实施方案中，rt-pcr可用于测量表达水平，尽管技术人员已知其他技术。在另一个实施方案中，该方法可包含将表达水平与对照植物进行比较。优选地，与植物群体或对照植物中的至少一种其他植物中的表达水平相比，所述增加为至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍或至少150倍高。优选地，所述选择的植物在植物群体中具有最高水平的pt7表达。结果，如本文所述，此类植物将展示增加的产量和/或增加的结瘤和/或增加的固氮酶活性和/或增加的磷和/或氮含量。该方法可以进一步包含从所选植物收集种子。

在本发明的另一方面，提供了一种在植物中增加和/或增加的结瘤和/或增加的固氮酶活性和/或增加的磷和/或氮含量的方法，该方法包括：

a.筛选植物群体，以获得至少一种与对照植物相比具有增加的或减少的pt7表达水平的植物；

b.如本文所述，进一步增加pt7多肽的表达。

根据本发明的各个方面(包括本文所述的转基因植物、方法和用途)的植物，可以是双子叶植物。优选地，所述植物是作物植物。作物植物是指以商业规模生长用于人类或动物消费或使用的任何植物。在优选的实施方案中，所述植物是谷类。最优选的植物是豆科植物，例如但不限于大豆、豌豆、花生和普通豆(菜豆(phaseolusvulgaris))。最优选的植物是大豆。

如本文所用的术语“植物”涵盖整株植物、植物的祖先和子代以及植物部分，包括种子、果实、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、组织和器官，其中前述中的每种包含如本文所述的核酸构建体。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，再次，其中前述中的每种包含如本文所述的核酸构建体。

本发明还延伸到如本文所述的本发明植物的可收获部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。本发明的方面还延伸到来源于优选直接来源于这种植物的可收获部分的产品，例如干燥小丸或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及包含本发明的植物或其部分的食品和食品补充剂。在本发明的另一个方面，提供了来源于如本文所述的植物或其部分的产品。在优选的实施方案中，可收获部分是种子、豆或豆荚。

根据本发明的所有方面，如本文所用的对照植物是未根据本发明的方法进行修饰的植物。因此，在一个实施方案中，对照植物不具有pt7核酸的改变的表达特征。在备选实施方案中，如上所述，对照植物不表达本文所述的核酸构建体，植物也没有被遗传修饰。在一个实施方案中，对照植物是野生型植物。对照植物通常属于与修饰植物相同的植物物种，优选具有与修饰植物相同的遗传背景。

虽然前述公开内容提供了涵盖在本发明的范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳模式，但是提供以下实例以进一步使得本领域技术人员能够实施本发明并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应被理解为对本发明的限制，其范围应该从本公开所附的权利要求书及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其它方面和实施方案对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

“和/或”在本文中使用时被认为是两个指定特征或组分中的每一个具有或不具有另一特定特征或组分的具体公开。例如，“a和/或b”将被视为(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就像每个在本文中单独列出一样。

除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。

上述申请以及其中引用或在其审批期间引用的所有文献和序列登记号(“申请引用文献”)以及申请引用文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用文献”)以及本文引用文献中引用或参考的所有文献，以及用于本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规范和产品说明书，在此均通过引用并入本文，并且可以是用于实施本发明。更具体地说，所有参考文献均以相同程度通过引用并入，就好像每个单独文献具体和单独地指示通过引用并入。

实施例

大豆[glycinemax(l.)merr.]是世界上最广泛种植的豆科作物之一，且其具有优异的bnf能力³⁵。在该研究中，鉴定了大豆sm定位的pi转运蛋白gmpt7，并且发现其关键参与从根际的pi吸收和从宿主植物细胞到类菌体的pi转运。gmpt5和gmpt7的双重抑制严重抑制大豆结瘤。相比之下，gmpt7的过表达改善了小瘤发育和固氮酶活性，并随后改变了田间的大豆产量。据我们所知，这些结果构成了以下发现：pi转运蛋白在直接吸收pi至小瘤和在共生体中跨越sm的pi转运中起作用，同时也证明了gmpt5和gmpt7共同控制了小瘤中主要的pi吸收和转运，并从而影响n2固定和大豆的产率。

小瘤表达的pi转运蛋白基因gmpt7的鉴定。如前所述，在大豆基因组中鉴定了pht1家族的14个成员(gmpt1-gmpt14)¹⁷。将gmpt与来自藻类、拟南芥、水稻、豆科植物和其他物种的pi转运蛋白序列结合，我们使用mega5.05程序中的邻接分析构建了一个系统发育树，并发现了4个gmpt(gmpt1、gmpt4、gmpt7和gmpt13)聚集在豆科植物特异性亚组中，表明这些成员可能在豆科植物中发挥特殊作用。然而，尚未对它们中的一个进行功能表征。其中，gmpt7(glyma10g33030.1)在小瘤中显示出最高的转录本丰度(图7a)。此外，通过低p，gmpt7的表达显著上调，尤其是在小瘤中(图7b)。

含有gmpt7的酵母pi吸收缺陷型突变体mb192³⁶细胞(yp112-gmpt7)在0.1mmpi中部分恢复其生长，并且比空载体p112a1ne生长得更好(图8a)。这证实gmpt7是高亲和力pi转运蛋白，其平均km值为103μmpi(图8b)¹⁷。有趣的是，当在³³pi标记实验中以高达30mm的高浓度提供pi时，gmpt7以1.13mmpi的表观平均km值对pi运输表现出低亲和力(图8b)。总之，这些结果表明gmpt7可能在植物中起双重亲和性pi转运蛋白的作用。

与大多数植物pht1成员相似，预测gmpt7定位于质膜。为了证实它的亚细胞定位，构建了由camv35s启动子驱动的gmpt7-gfp融合，并将其在表达载体内转染到拟南芥原生质体和洋葱表皮细胞中。结果，融合蛋白被限制在质膜上(图9)，表明gmpt7是质膜定位蛋白。

gmpt7的组织定位。为了观察gmpt7的组织特异性，在携带与β-葡糖醛酸酶(gus)报告基因融合的推定的gmpt7启动子区(progmpt7::gus)的转基因植物中进行gus染色。结果显示gmpt7定位于共生体和小瘤皮质(图10a)。此外，在大豆小瘤中使用gmpt7抗体进行免疫染色证实了结果(图1，图10b、c)。这些结果表明gmpt7参与小瘤的pi吸收和共生体之间的pi转运。

gmpt7的改变的表达改变了pi吸收和共生体中的转运。使用由大豆复合转基因植物产生的gmpt7过表达(ox)和敲减(ri)小瘤，研究gmpt7在小瘤中的生理作用。通过实时定量(qrt)-pcr，检测在低p和高p水平的ox和ri小瘤中gmpt7的相应转录物(图11)。为了确定gmpt7对小瘤pi吸收和转运的作用，使用体外试验来评估小瘤的直接[³³p]pi吸收。基于整个小瘤的[³³p]pi活性的结果，我们发现小瘤能够从生长培养基中直接吸收pi，并且当提供0.25μci的h3³³po4时，与在高p中预生长的小瘤相比，在低p中预生长的小瘤吸收超过10倍的更多的[³³p]pi(图2a)。与对照株系(ck)相比，gmpt7-ox小瘤分别在低p和高p水平下吸收55％和46％多的[³³p]pi，gmpt7-ri小瘤分别在低p和高p水平下吸收22％和21％少的[³³p]pi(图2a)。

我们还检测了从小瘤中分离的共生体的[³³p]pi活性。在低p和高p条件下，gmpt7-ox转基因小瘤的共生体中的[³³p]pi活性分别比ck株系大129％和66％。然而，与对照相比，gmpt7-ri小瘤的共生体中的[³³p]pi活性没有显著改变(图2b)。上述结果均表明gmpt7在通过小瘤的直接的pi吸收和共生体之间的pi转运中起关键作用。

gmpt7表达显著影响大豆的结瘤、生长和产量。在整个植物转化株系中，通过实时定量(qrt)-pcr，检测ox和ri小瘤中gmpt7的相应转录物(图12)，并使用gmpt7抗体通过免疫染色测定所得蛋白质(图1)。gmpt7-ox小瘤中的信号强于wt小瘤中，而gmpt7-ri小瘤中的信号更弱。此外，小瘤中的gmpt7信号在低p条件下更强，这与在低p小瘤中gmpt7表达上调的观察结果一致(图7b)。gmpt7表达的改变导致蛋白质变化，其显著影响大豆结瘤，并且随后影响植物生长以及n和p营养(图3、图12)。这些影响也部分依赖于pi供应。gmpt7的敲减抑制小瘤生长42％至46％，低磷条件下小瘤固氮酶活性降低61％至73％。然而，与wt相比，gmpt7的过表达显著增加了高p条件下小瘤的数量、鲜重和固氮酶活性，分别为54％至65％、32％至38％和31％至119％。

切片时，低p条件下，在wt小瘤中，感染细胞较小，表明pi饥饿严重抑制小瘤器官发生(图4a、d)。ox小瘤显示出比wt植物中更大和更多的感染细胞，而rnai小瘤在低的和充足的p条件下均显示更小和更少的感染细胞(图4)，表明gmpt7密切参与大豆小瘤发育，特别是类菌体发育。随后，与wt植物观察的相比，在低p条件中，gmpt7的抑制抑制了大豆生长以及n和p含量，而在高p条件中，gmpt7的过表达显著增强了大豆鲜重和n和p含量(图12)。因此，在两年的田间试验中，gmpt7表达的改变显著影响大豆产量，相对于wt，对于ox的种子数量增加2％-28％和产量增加13％至36％，并且对于ri株系可观的降低16％-25％和18％至24％(图5)。

gmpt5和gmpt7的双重抑制。

在大豆中，已知先前表征的高亲和力pi转运蛋白gmpt5控制从宿主根到小瘤的pi运输⁶。在本研究中，双亲和性pi转运蛋白gmpt7在通过小瘤的直接pi吸收和共生体之间的pi转运中发挥了关键作用。为了评估gmpt5和gmpt7的组合对小瘤中的pi营养的贡献程度，产生了具有gmpt5和gmpt7双重抑制的复合转基因株系(图6)。正如预期的，在低p条件下，gmpt5和gmpt7转录物水平的组合显著影响大豆结瘤。gmpt5和gmpt7的双重抑制导致几乎完全消除结瘤，结果表明，与ck相比，小瘤数量和鲜重分别减少了94％和97％，随后大豆生物量和n含量分别减少了47％和57％(图6)。在双重抑制株系中形成的小瘤也具有由gfp标记的根瘤菌所示的很少的感染细胞(图6b)，显示在双重抑制株系中小瘤器官发生期间的发育不足。这些结果表明gmpt5和gmpt7的组合控制大豆小瘤中的大部分pi吸收和转运。

讨论

氮(n)和磷(p)是用于植物生长的最重要的两种矿质营养素，但通常是作物生产的限制因素。在植物有效性低的地理区域，向作物提供大量的n和p化学肥料以提高产量²。然而，农业中过量使用化肥会造成严重的环境污染，并对农业可持续性产生负面影响³⁷。作为一种环境友好的氮源，豆科植物的bnf在可持续农业系统中起着至关重要的作用³。豆科植物中bnf的过程是通过与小瘤中的类菌体的共生的关系²²。对于蛋白质合成和能量消耗，小瘤生长和bnf需要大量的p³⁸。另一方面，通过bnf过程释放游离pi，其可以形成反馈回路以抑制bnf过程，尤其是在过量pi供应条件下³⁹。因此，对于豆科植物，控制小瘤中的pi稳态用于有效的bnf是关键的。

如图13所概述，pi运输至小瘤中和在小瘤中转运涉及三个过程。前两个过程是pi进入小瘤的途径，包括直接和间接途径，如之前在普通大豆中通过³²p试验所证实的²¹。接下来的步骤是pi跨越sm转运到类菌体中用于bnf和细菌需求。由于pi转运蛋白负责pi运输至植物内和在植物内转运⁴⁰，因此可以合理地预期某些pi转运蛋白可能参与小瘤中的pi吸收和转运。gmpt5介导的间接途径已在大豆小瘤中阐明⁶。然而，尚未探索直接pi吸收和转运到豆科植物类菌体中的潜在机制。在本研究中，我们鉴定了双亲和性pi转运蛋白gmpt7，其似乎在通过小瘤直接吸收pi和转运到大豆类菌体中起关键作用，证据讨论如下。

首先，gmpt7在皮质细胞中的位置(图1，图10)将其置于可以控制从根际吸收pi的位置，其中一个值得注意的实例是皮质定位的ospt6，所述ospt6控制水稻根中的pi吸收¹⁸。其次，土壤中的pi浓度通常很低(<10μm)⁴⁰。由于80％以上的pi肥料可以通过土壤颗粒固定，即使在pi施肥之后，在土壤溶液中，土壤pi浓度仍可能低于100μm⁴¹。因此，来自根际的pi吸收过程通常需要高亲和力pi转运蛋白的参与⁴⁰。最近一项关于大豆共生体的蛋白质组学研究鉴定了许多新的共生的蛋白质，其中两种是pi转运蛋白，gmpt5和gmpt7²³。已经证明gmpt5在通过小瘤的直接pi吸收中不起作用⁶。我们已经证明gmpt7是一种候选的高亲和力pi转运蛋白，其可能在通过小瘤的直接pi吸收中起作用。通过gmpt7小瘤的过表达或敲减，通过观察[³³p]pi的直接吸收的增加或减少，进一步证实了这一点(图2a)。因此，gmpt7和gmpt5分别参与直接和间接的pi进入大豆小瘤(图13)。此外，gmpt5和gmpt7的双重抑制显著抑制小瘤生长，正如小瘤数和鲜重减少超过90％所证实的(图6)，这表明gmpt7和gmpt5的组合控制大部分pi进入大豆小瘤。最重要的是，我们的研究结果表明，大豆小瘤不仅可以在低p条件下通过gmpt5从宿主植物中异养获得pi，而且在充足的p条件下也可以通过gmpt7从根际自养获得pi。

sm在类菌体和宿主植物之间的能量和营养交换中起着重要作用³。在先前的研究中，gmpt5在感染的小瘤细胞中弱定位，但gmpt5的过表达或敲减对共生体中[³³p]pi的积累没有显著影响。在这项研究中，我们发现gmpt7强烈定位于在受感染的细胞中(图10)。由于植物细胞中pi的浓度是土壤中pi浓度的1000倍高^41,42，gmpt7可能作为参与pi转运到类菌体中的低亲和力的pi转运蛋白发挥作用。这得到以下发现的支持：gmpt7的过表达导致共生体中[³³p]pi的积累增加(图2b)。同时，改变gmpt7表达也显著影响小瘤发育，特别是感染细胞发育(图4)，并随后影响bnf，如固氮酶活性的变化所表明的(图3)。总的来说，本文的结果表明gmpt7还在跨越sm从宿主细胞到类菌体的pi转运中起作用(图13)。据我们所知，这是鉴定功能性pi转运蛋白在豆科植物小瘤共生体中起重要作用的第一次报道。

有文献记载，p营养状态是小瘤器官发生和功能的重要决定因素⁴³。在足够的磷供应下，豆科植物通常成功结瘤并表现出优异的bnf，正如对于大豆^6,44、普通豆⁴⁵、苜蓿⁴⁶和豌豆⁴⁷所提到的那样。有趣的是，p缺乏增强了gmpt5和gmpt7的表达¹⁷。在14个gmpt中，在p缺乏条件下小瘤中gmpt5转录本丰度最高⁶，而p-充足条件下小瘤中gmpt7转录本丰度最高(图7a)。具有改变的gmpt5或gmpt7转录水平的转基因大豆植物中的结瘤和生长的变化部分地依赖于p供应。在低p条件下，gmpt5或gmpt7的过表达对结瘤没有显著影响，可能是由于外部环境中缺乏可利用的pi。另一方面，敲除gmpt5或gmpt7显著抑制小瘤器官发生⁶(图3)。更重要的是，gmpt5和gmpt7的双重抑制导致几乎完全消除小瘤形成和小瘤中较少的感染细胞(图6)。这显示了由gmpt5和gmpt7控制的pi进入小瘤的重要性。相反的，在充足的p条件下，过表达但不敲除gmpt7显著改变了结瘤并随后促进了植物生长和产量(图3-5)，这表明gmpt7可以被认为是通过优化结瘤来提高大豆产量的候选物。

总之，在大豆中，我们鉴定了共生体膜(sm)-定位的双亲和性pi转运蛋白gmpt7，其在大豆中在通过小瘤的直接pi吸收和从宿主细胞向类菌体的pi转运中起关键作用。gmpt5和gmpt7的组合控制大部分pi进入来自宿主植物根或来自根际的大豆小瘤中。据我们所知，之前的报道没有描述pi进入豆科植物的共生体。此外，我们证明通过控制pi进入共生体和调控共生的n2固定，改变gmpt7表达影响了谷粒产量。由于pi对于所有豆科植物结瘤是高度需要的，我们的研究结果表明，工程改造的pi转运蛋白可能不仅可以用于增加大豆的谷粒产量，也可以增加其他豆类作物的谷粒产量。

方法

植物材料和生长条件

使用大豆基因型hn66和根瘤菌株bxyd3用于gmpt的表达分析。将种子在3％(v/v)过氧化氢中消毒1min，然后在无菌水中漂洗5次。然后，将消毒后的种子在提供有1/2强度营养液的硅砂中发芽7天。将幼苗用根瘤菌接种1小时，并移植到具有两种p处理[组成(以μm计)：50nh4no3、1200cacl2、1000k2so4、500mgso4·7h2o、25mgcl2、2.5nab4o7·10h2o、1.5mnso4·h2o、1.5znso4·7h2o、0.5cuso4·5h2o、0.15(nh4)6mo7o24·4h2o、40fe-na-edta、250(高p)或5(低p)kh2po4]的ph5.8的低-n(100μm)营养液中。营养液每周更换一次。接种后30天，分别收获叶、根和小瘤。植物在21-30℃的温室中在自然日光下水培生长。

定量rt-pcr分析。在rotor-gene3000(corbettresearch，澳大利亚)实时pcr仪上，使用promegasybrqpcr混合物(promega)，通过实时定量rt-pcr，确定大豆植物中在不同处理下不同组织中gmpt7的表达。在该研究中使用了pht1家族的gmpt基因和大豆管家基因tefs1(编码延伸因子ef-1a，登录号x56856)的特异性引物，其已在之前公开⁶。相对表达值是目的基因的表达值与tefs1的表达值的比率。

全长gmpt7cdna的克隆。按照制造商的实验方案(omegabio-tek)，使用trizol试剂从大豆(glycinemax，基因型hn66)小瘤中提取总rna，并在用dnasei(takara)处理后使用primescript^tmrt试剂盒(takara)中的逆转录酶转变成cdna。使用引物5'-atggcgggaggacaactagga-3'(seqidno:9)和5'-ttaaactggaaccgtcctagcag-3'(seqidno:10)扩增全长gmpt7cdna，根据gmpt7的序列信息，所述引物被设计为靶向5'起始密码子和3'终止密码子，所述gmpt7对应于genbank登录号：fj814695.1。将pcr片段克隆到pmd18-teasy载体(takala)中，并通过augct方法(http://www.augct.com/classid＝2)测序。

酵母试验。使用酵母pi吸收缺陷型突变体mb192³⁵，以及mb192中的表达载体p112a1ne(缩写为yp112)。使用引物5'-atcggcggccgcatggcgggaggacaactagga-3'(seqidno:11)和5'-atcgggatccttaaactggaaccgtcctagcag-3'(seqidno:12)从pmd18-t-gmpt7扩增gmpt7cdna，并克隆到yp112的noti和bamhi位点(yp112-gmpt7)。酵母菌株yp112-gmpt7和yp112在ynb培养基中(酵母n碱基，6.7g/l；氨基酸混合物，1.98g/l；葡萄糖一水合物，20g/l；腺嘌呤硫酸氢盐(genisulfate)，20mg/l)生长至对数期并收获，并在无pi的ynb培养基中洗涤。然后，使用含有100μmpi的ynb液体培养基在30℃下接种酵母菌株10小时。使用溴甲酚紫作为ph指示剂，其具有反映液体培养基酸性的紫色至黄色的转变，酸性与酵母细胞的生长相关。对于酵母中的³³p吸收实验，按照先前描述的方法使用约1mg的新鲜酵母细胞样品¹⁸。

gmpt7-gfp融合蛋白的瞬时表达。使用引物5'-atcgtctagagatggcgggggacaactagga-3'(seqidno:13)和5'-atcgggatcccgaactggaaccgtcctagcagac-3'(seqidno:14)从pmd18-t-gmpt7中扩增gmpt7cdna，并克隆到具有花椰菜花叶病毒camv35s启动子的pbegfp载体的xbai和bamhi位点。构建体和空载体通过聚乙二醇介导的转化在拟南芥原生质体中表达。详细地，使用纤维素r10和离析酶r10从4周龄哥伦比亚生态型拟南芥植物的叶中分离原生质体。通过聚乙二醇4000用20mg质粒dna转化大约2×10⁵个原生质体，并在弱光下在平板中温育12-16小时，然后用zeisslscm7duo(780&7live)激光扫描共聚焦显微镜(zeiss，german)观察。

通过氦驱动的加速器(pds/1000；bio-rad)将构建体和空载体瞬时转化到琼脂平板上的洋葱(alliumcepa)表皮细胞中。为了消除细胞壁定位的可能性，通过添加30％蔗糖溶液20分钟对轰击的表皮细胞进行质壁分离，然后用红色碘化丙啶(pi)荧光作为细胞壁的指示物进行共聚焦扫描。培养一天后，使用共聚焦扫描显微镜(tcssp2；leica)观察轰击的表皮细胞中靶蛋白的gfp表达，使用488nm激光用于gfp的荧光激发，并使用515至554nm滤光片(绿色；gfp荧光)和610nm滤光片(红色；碘化丙锭荧光)进行检测。

gus表达的组织化学定位。使用引物5'-atcgctgcagccttgtctcatgttactgctgc-3'(seqidno:15)和5'-atcgccatggccatcactcactaactcagctac-3'(seqidno:16)从pmd18-t-gmpt7启动子构建体扩增gmpt7启动子，然后克隆到pcambia3301载体的xbai和ncoi位点，以取代camv35s启动子驱动gus报告基因表达。将构建体和空载体导入发根土壤杆菌(agrobacteriumrhizogenes)菌株k599中，然后通过发根转化方法转化到如前所述的大豆栽培品种hn66中⁴⁸。转基因复合大豆在生长室中以16h:8h，光照(26℃):暗(22℃)的光周期水培生长。用切片机(lecicavt1200s)将水培生长的转基因根和小瘤切成50mm的厚度用于gus染色。将小瘤切片在磷酸钠缓冲液(ph7.0)中与x-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸)在37℃下温育过夜。然后，在使用光学显微镜(leicadm5000b)观察之前，将样品用70％乙醇脱色⁶。

gmpt7的免疫染色。合成肽edklqhmvesenqky(gmpt7的269-283位)用于免疫兔子以产生针对gmpt7的多克隆抗体。使用如前所述的具有1:300稀释度的gmpt7抗体，将25天龄的溶液培养生长的小瘤用于免疫染色⁴⁹。使用共聚焦激光扫描显微镜(lsm700；carlzeiss)观察二抗(alexafluor555山羊抗兔igg；分子探针)的荧光。

放射性[³³p]pi吸收试验。对于大豆复合植物转化，使用引物5'-atcgggatcctatggcgggaggacaactagga-3'(seqidno:18)和5'-atcgacgcgtttaaactggaaccgtcctagcag-3'(seqidno:19)扩增gmpt7的编码区并克隆到具有camv35s启动子的pylrnai载体的bamhi和mlui位点，以产生过表达构建体。另外，使用有义方向引物5'-catgggatccggctgctcttacctactattgg-3'(seqidno:20)和5'-catgaagcttaaggccaccgtaaaccagtac-3'(seqidno:21)和反义方向使用的引物5'-catgctgcagaaggccaccgtaaaccagtac-3'(seqidno:23)和5'-catgacgcgtggctgctcttacctactattgg-3'(seqidno:24)扩增gmpt7编码序列的423-bp片段，并插入pylrnai载体以产生rnai构建体。将重组质粒导入发根土壤杆菌菌株k599中，然后如前所述通过发根转化方法转化到大豆栽培品种hn66中⁴⁸。去除主根后，携带空载体(ck)或gmpt7的过表达(ox)或敲减(ri)构建体的转基因发根用根瘤菌接种1小时，然后移植到具有两种p处理(低p：5μmp；高p：250μmp)和500μmn供应的营养液中。种植后50天，来自gmpt7-ox和gmpt7-ri株系的小瘤用于吸收体外放射性[³³p]pi。在测量来自不同株系的一致的小瘤的鲜重后，将小瘤转移到含有0.25μci的h3³³po4的1ml³³p标记的营养液中持续2小时，然后用营养液洗涤，直到液体中检测不到[³³p]pi。通过闪烁计数(ls6500multi-purposescintillationcounterbeckmancoulter，美国)测量与4ml闪烁混合物混合的每个样品⁶。

大豆结瘤试验。对于大豆全植物转化，使用引物5'-gagctgagctcatggcgggaggacaactaggag-3'(seqidno:24)和5'-ctagatctagattaaactggaaccgcctagcaga-3'(seqidno:25)扩增gmpt7的编码区，并将其克隆到具有camv35s启动子的ptf101的saci和xbai位点，以产生过表达构建体，并在克隆到具有camv35s启动子的pfgc5941载体的有义和反义方向的asci和swai位点，或xbai和bamhi位点之前，使用引物5'-tcaatctagaggcgcgccggctgctcttacctactattgg-3'(seqidno:26)和5'-tgccggatccatttaaataaggccaccgtaaaccagtac-3'(seqidno:27)扩增gmpt7编码序列的400bp片段，以产生rnai构建体。将重组质粒导入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)菌株eha101和eha105中，然后如前所述将其转化到大豆栽培品种hn66中⁵⁰。通过叶子喷施除草剂试验对转基因植物进行初筛。将wt和转基因大豆植物的7日龄幼苗用根瘤菌接种1小时，然后在具有两种p处理(低p：5μmp；高p：250μmp)和500μmn供应的营养液中生长。使植物在生长室中以12h:12h，光照(26℃):黑暗(22℃)光周期生长30天。分别收获小瘤和植物以确定小瘤数量、鲜重和固氮酶活性，以及植物鲜重、n和p含量。将小瘤分别包埋在石蜡中，用于膜封闭的类菌体观察，然后在脱蜡后用甲苯胺蓝染色并通过光学显微镜检查。

大豆产量评估。两年的田间试验分别在2015年和2016年进行，结果显示出相同的趋势。在这里，我们刚刚介绍了自2016年的结果。对于田间试验中，从2016年3月至6月在华南农业大学宁西实验农场(23°13′n，113°81′e)，将用根瘤菌接种的wt和转基因大豆植物的种子播种在酸性土壤上。对于每个株系，进行了4次重复，每个重复15棵大豆植株。15天后，通过叶子喷施除草剂试验对植物进行初筛。在成熟阶段，收获豆荚用于产量评估。

gmpt5和gmpt7的双重抑制。对于大豆复合植物转化，使用有义方向引物5'-atcgagatctgaacatggagattcaagccgag-3'(seqidno:28)和5'-atcggaattcccagtgatcatagggaatggcaa-3'(seqidno:29)以及反义方向引物5'-atcgctgcagccagtgatcatagggaatggcaa-3'(seqidno:30)和5'-atcgtctagagaacatggagattcaagccgag-3'(seqidno:31)扩增gmpt5编码序列的400-bp片段，并将其插入psat4-35s-rnai载体，然后将含有35s和gmpt5的400-bp有义和反义方向的长片段克隆到prcs2-ocs-nptii载体的i-scei位点。使用有义方向引物5'-atcgccatggggctgctcttacctactattgg-3'(seqidno:32)和5'-atcgagatctaaggccaccgtaaaccagtac-3'(seqidno:33)以及反义方向引物5'-atcgctgcagaaggccaccgtaaaccagtac-3'(seqidno:34)和5'-atcgtctagaggctgctcttacctactattgg-3'(seqidno:35)扩增gmpt7编码序列的423-bp片段并插入psat6-supp-rnai载体，然后将含有supp和gmpt7的423bp有义和反义方向的长片段也克隆到含有gmpt5片段的正义和反义的prcs2-ocs-nptii载体的pi-pspi位点。将重组质粒导入发根农杆菌菌株k599中，如先前所述，通过发根转化方法将其转化到大豆栽培品种hn66中⁴⁸。去除主根后，携带空载体(ck)或gmpt5和gmpt7(ri)构建体的双重抑制的转基因发根用带有gfp的根瘤菌usda110接种1小时，然后在低p(5μmp)处理下移植到具有500μmn供应的营养液中30天。分别收获小瘤和植物以确定小瘤数量和小瘤鲜重，以及植物鲜重，植物的n和p含量。

植株n和p含量的测量。为了测量植物的n和p含量，消化约0.1g干燥样品，然后使用连续流动分析仪(skalarsan++，荷兰)测定总n含量和总p含量⁷。

统计分析

使用microsoftexcel2013计算所有平均值和se值。组之间的比较使用microsoftexcel2013中的学生t检验进行。

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序列表

seqidno:1gmpt7核酸序列(基因组)

seqidno:2gmpt7核酸序列(cdna)

seqidno:3gmpt7氨基酸序列

seqidno:4gmpt7启动子序列

seqidno:5gmpt5核酸序列(基因组)

seqidno:6gmpt5核酸序列(cdna)

seqidno:7gmpt5氨基酸序列

seqidno:8:enod40启动子核酸序列