强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用的制作方法

本发明涉及一种强毒性的手足口病致病病毒的稳定生产以及使用强毒性的手足口病致病病毒的疫苗或者抗病毒药物的筛选。
背景技术：
：手足口病是一种病毒性疾病，是由小核糖核酸病毒科肠道病毒属内的主要被归类为人类肠道病毒a组(hev-a)的病毒引起的。手足口病以出现在口腔粘膜及四肢末端的水疱性的皮疹为主要症状，在主要在幼儿中流行于夏季，但通常症状较轻，即使不进行特别治疗也会在几天之内自然治愈。但是，有报道称肠道病毒71(ev71)会罕见地引起无菌性脑膜炎及脑炎等严重的中枢神经系统的并发症，在东亚从1990年代末期开始报告了很多因ev71的大规模流行而导致的死亡病例。一般认为，导致该情况的一个原因在于，以ev71为主的肠道病毒为rna病毒，与其它rna病毒(例如，流感病毒等)一样，它的突变率非常高，在病毒的大规模流行期间产生了强毒性突变株。因此，一般认为，肠道病毒在公共卫生方面是一种很危险的病毒，需要开发疫苗或抗病毒药物。为了开发针对肠道病毒的疫苗或抗病毒药物，需要肠道病毒的感染动物模型。本发明人等已经证明，作为细胞表面受体的清道夫受体b类成员2(scarb2)是感染ev71所必需的分子，并制作了表达人scarb2的转基因小鼠以作为ev71感染模型小鼠(非专利文献1)。另一方面，作为用于使上述模型小鼠受到感染的ev71通过使用rd细胞等病毒敏感细胞使其增殖来制备。但是，经常确认到，使用病毒敏感细胞使其增殖后的ev71的致病性显著降低，这成为开发ev71的疫苗或抗病毒药物方面的主要障碍。现有技术文献非专利文献非专利文献1：fujii,k.等人，《美国科学院院刊》(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)，第110卷，第36期，第14753-14758页(2013)。技术实现要素：发明想要解决的课题目前已知，在以ev71为主的被归类为hev-a的肠道病毒所结合的细胞膜表面受体上，除scarb2以外，还存在硫酸乙酰肝素、psgl-1等多个分子。但是，这些细胞膜表面受体的功能性差异以及与肠道病毒的致病性的关联性、对于变异肠道病毒的选择压力等尚不明确。本发明是为了探明以ev71为主的被归类为hev-a的肠道病毒的感染机理并稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒而完成的。用于解决课题的手段本发明人等进行了潜心研究，结果探明通过使经由硫酸乙酰肝素而获取的弱毒性ev71超过经由scarb2感染的强毒性ev71从而增殖，由此发生ev71的减毒。本发明人等基于这些新发现而建立了用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞及方法。即，根据一种实施方式，本发明提供一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞，所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素，并且过表达灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)。优选地，所述强毒性的手足口病致病病毒是被归类为人类肠道病毒a组的病毒。优选地，所述强毒性的手足口病致病病毒是肠道病毒71、柯萨奇病毒a16、柯萨奇病毒a14或柯萨奇病毒a7。优选地，所述宿主细胞不表达ext1基因和/或ext2基因。优选地，所述scarb2是人scarb2。优选地，所述细胞是rd细胞。另外，根据一种实施方式，本发明提供一种稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒的方法，其包括下列步骤：(1)向上述记载的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna，以获得产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞；(2)培养通过所述步骤(1)得到的细胞，以使强毒性的手足口病致病病毒增殖；以及(3)回收通过所述步骤(2)增殖的强毒性的手足口病致病病毒。优选地，所述强毒性的手足口病致病病毒是被归类为人类肠道病毒a组的病毒。优选地，所述强毒性的手足口病致病病毒是肠道病毒71、柯萨奇病毒a16、柯萨奇病毒a14或柯萨奇病毒a7。另外，根据一种实施方式，本发明提供一种采用上述方法所制备的强毒性的手足口病致病病毒株。另外，根据一种实施方式，本发明提供一种抗手足口病致病病毒疫苗的筛选方法，其包括下列步骤：(1)准备表达了灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)的转基因小鼠；(2)向所述转基因小鼠接种候选疫苗；(3)利用上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株攻击所述步骤(2)中的转基因小鼠；以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。另外，根据一种实施方式，本发明提供一种抗手足口病致病病毒药物的筛选方法，其包括下列步骤：(1)准备表达了灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)的转基因小鼠；(2)使所述转基因小鼠感染上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株；(3)向所述步骤(2)中的转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物；以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。优选地，所述scarb2是人scarb2。优选地，所述转基因小鼠为4周龄以上。发明效果本发明的用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞及方法能够使手足口病致病病毒增殖而不减毒，因此，能够稳定且有效地提供强毒性的手足口病致病病毒株。另外，本发明的强毒性的手足口病致病病毒株及使用其抗手足口病致病病毒疫苗或抗手足口病致病病毒药物的筛选方法具有稳定且较高的重复性。因此，能够用于疫苗及抗病毒药物的开发以及质量管理。附图说明图1为确认了敲除ext1基因或ext2基因的rd细胞的硫酸乙酰肝素表达量的图；图2为表示经由硫酸乙酰肝素或scarb2而感染ev71的机理的示意图；图3为表示被强毒性ev71(n772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的体重变化的图表；图4为表示被强毒性ev71(n772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的中和抗体滴度及生死的图；图5为表示被强毒性ev71(n772株)攻击后的小鼠(疫苗接种(-)或(+))的脊髓中的病毒滴度(tcid50)的图表。具体实施方式下面，详细地说明本发明，但本发明并不限定于本说明书中所描述的实施方式。根据第一实施方式，本发明提供了一种用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞，所述宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素，并且过表达灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)。“手足口病致病病毒”表示肠道病毒中会感染人而引起手足口病的病毒。另外，本实施方式中的“强毒性的手足口病致病病毒”是指手足口病致病病毒中具有神经致病性并引起致命性感染的病毒。肠道病毒是被归类为小核糖核酸病毒科(familypicornaviridae)肠道病毒属(genusenterovirus)的病毒，它没有包膜，在由vp1～vp4四种蛋白构成的正十二面体的衣壳中包含单链正链rna。肠道病毒属中包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇a组病毒(cav)、柯萨奇b组病毒(cbv)、埃可病毒、肠道病毒。其中，感染人的肠道病毒基于分子系统发育分析而被归类为四个种(species)：人类肠道病毒a组(hev-a)、人类肠道病毒b组(hev-b)、人类肠道病毒c组(hev-c)、以及人类肠道病毒d组(hev-d)，而且，根据由抗体所产生的中和反应性的差异而被归类为很多血清型。作为本实施方式中的手足口病致病病毒，只要是强毒性的病毒即可，能够使用任意的血清型的肠道病毒。目前，尚未充分确定用以决定手足口病致病病毒的毒性严重性的基因变异。但是，本发明的一部分基于下述发现：在从ev71感染患者所分离的ev71中，大多数情况下，vp1衣壳蛋白的第145个氨基酸为谷氨酸(e)(vp1-145e)，而在通过培养细胞重复传代而得到的ev71中，该氨基酸为甘氨酸(g)(vp1-145g)或谷氨酰胺(q)(vp1-145q)，这些ev71为弱毒性。虽然不限定于特定的理论，但推测vp1衣壳蛋白的第145个氨基酸的上述变异改变病毒粒子表面的电荷分布，其结果，ev71对于硫酸乙酰肝素的结合亲和性产生变化而导致ev71的毒性变化。因此，如果为与vp1-145e相同地不显示对于硫酸乙酰肝素的结合亲和性且经由scarb2而感染的手足口病致病病毒，则与vp1-145e相同地成为强毒性的可能性高。在此，“感染”表示病毒粒子结合于宿主细胞的表面并被吸收入宿主细胞内而脱壳至后代病毒增殖为止的一系列过程。即，本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒优选被分离为hev-a的病毒，特别优选为肠道病毒71(ev71)、柯萨奇病毒a16(cva16)、柯萨奇病毒a14(cva14)或柯萨奇病毒a7(cva7)，最优选为ev71。肠道病毒71(ev71)基于vp1基因的分子系统发育分析而被进一步归类为a、b1～b5以及c1～c5这些基因型(subgenogroup)。本实施方式中的ev71可以是任意基因型的ev71，例如，可列举：y90-3896株(c1型)、isehara株(c2型)、n772-sendai.h-06株(c4型)、2716-yamagata-03株(b5型)等，但不限定于此，需要指出的是，从ev71感染患者中所分离的上述株均为vp1-145e。各基因型的ev71的碱基序列信息能够从规定的数据库中获得。另外，本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒能够通过表达人scarb2的肠道病毒感染模型小鼠(《美国科学院院刊》,第110卷，第36期，第14753-14758页)中的半数致死量(ld50)来定义。作为本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒，上述ld50优选为106tcid50以下，特别优选为105tcid50以下。本实施方式中的“宿主细胞”是指手足口病致病病毒所感染的靶细胞。“感染”如上面所定义那样。本实施方式中的宿主细胞能够使用通常用于病毒增殖的任意的哺乳动物细胞来制备。作为能够用于制备本实施方式中的宿主细胞的细胞，例如，可列举：rd细胞、vero细胞、hela细胞、mdck细胞、cos-7细胞、hek293t细胞、bhk细胞等，但不限定于这些。能够用于制备本实施方式中的宿主细胞的细胞优选为rd细胞。本实施方式中的宿主细胞不表达硫酸乙酰肝素。“硫酸乙酰肝素”是以葡糖胺及糖醛酸为构成成分的糖链，以结合于核心蛋白的蛋白聚糖的形式而广泛存在于细胞表面或细胞外基质。另外，“不表达”表示硫酸乙酰肝素的产生量缺失、或者降低至凭借通常所用检测手段(例如免疫化学的手法等)无法检测到的程度。本实施方式中的宿主细胞通过使参与硫酸乙酰肝素的生物合成的酶因变异而灭活或者不表达该酶的编码基因从而不表达硫酸乙酰肝素。优选地，本实施方式中的宿主细胞通过不表达参与硫酸乙酰肝素生物合成的酶的编码基因而不表达硫酸乙酰肝素。目前已知，ext基因家族参与硫酸乙酰肝素的生物合成，该家族中包括ext1、ext2、extl1、extl2及extl3。ext1及ext2分别编码具有α1、4-glcnac转移酶及β1、4-glca转移酶的双活性的酶，extl1、extl2及extl3还分别编码glcnac转移酶。即，本实施方式中的宿主细胞优选不表达ext1、ext2、extl1、extl2和/或extl3，特别优选不表达ext1及ext2中任意一者或两者。对于参与硫酸乙酰肝素的生物合成的基因的表达而言，能够通过该领域中众所知周的方法进行消除。例如，可以通过利用crispr/cas9等的基因组编辑技术来破坏(敲除)基因自身，也可以通过利用sirna等的基因沉默来抑制(敲减)基因表达。另外，参与硫酸乙酰肝素的生物合成的上述基因已经被克隆，其碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。例如，作为人ext1，能够利用genbank登录号nm_000127，作为人ext2，能够利用genbank登录号nm_000401、nm_207122、nm_1178083。本实施方式中的宿主细胞进一步过表达灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)。“清道夫受体b类成员2(scarb2)”(下面简称为“scarb2”)为具有两个跨膜区的细胞表面受体蛋白，它是被归类为hev-a的一部分病毒的感染所必需的分子。另外，“过表达”scarb2是指未导入编码scarb2的外源基因的宿主细胞表达了scarb2且超过了原本所表达的量的状态。在本实施方式中，能够通过将编码scarb2的外源基因导入宿主细胞而使scarb2过表达。能够在本实施方式中使用的编码scarb2的基因可以来自任意的灵长类，但优选为来自人。编码scarb2的基因已经被克隆，其碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。例如，作为人scarb2，能够利用genbank登录号bc021892.1。通过本领域中众所知周的方法，能够将编码scarb2的外源基因导入宿主细胞。例如，能够通过利用整合有编码scarb2的外源基因的表达载体来转化宿主细胞，将编码scarb2的外源基因导入宿主细胞。作为表达载体，例如，能够使用pcdna3.1(invitrogen公司制造)等质粒及逆转病毒载体等。转化能够通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、显微注射法、脂质转染法等众所周知的方法来进行。本实施方式的宿主细胞能够用于使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖。在此，“稳定(地)”表示在增殖而得到的病毒株中，保持了增殖前的种子病毒所具有的毒性。与其它rna病毒相同，手足口病致病病毒在增殖期间的突变率极高。因此，在使本领域中常用的宿主细胞感染了手足口病致病病毒的情况下，随着培养天数或传代数的增加，通过变异而产生弱毒性的手足口病致病病毒，该病毒优先重复感染宿主细胞，从而使手足口病致病病毒株减毒。而在本实施方式中的宿主细胞中，通过突变而引起的弱毒性的手足口病致病病毒的选择性感染被抑制为最小限度，因此，能够获得保持与增殖前相同的毒性的强毒性的手足口病致病病毒株。根据第二实施方式，本发明提供一种稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒的方法，其包括下列步骤：(1)向上述记载的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna，以获得产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞；(2)培养通过所述步骤(1)得到的细胞，以使强毒性的手足口病致病病毒增殖；以及(3)回收通过所述步骤(2)增殖的强毒性的手足口病致病病毒。本实施方式中的“宿主细胞”、“强毒性的手足口病致病病毒”及“稳定(地)”与第一实施方式中的定义相同。在本实施方式的方法中，向第一实施方式中的宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna，从而制备产生强毒性的手足口病致病病毒的细胞(下面简称“产病毒细胞”)。可以通过感染强毒性的手足口病致病病毒来向宿主细胞中导入强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna，也可以通过制备强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna并进行转染而导入。能够根据现有公知的条件使宿主细胞感染强毒性的手足口病致病病毒。例如，能够以104～105/cm2的浓度接种宿主细胞之后，以moi＝0.01～10添加强毒性的手足口病致病病毒，从而感染病毒。用于使宿主细胞感染的强毒性的手足口病致病病毒能够从中枢神经疾病发病后的手足口病致病病毒感染动物或手足口病患者的咽喉拭子、直肠拭子、粪便等中分离，或者从日本国立传染病研究所或日本国内地方卫生研究所来获得。强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna能够通过克隆强毒性的手足口病致病病毒的cdna并对其进行体外转录来制备。另外，能够通过脂质转染法、电穿孔法、显微注射法等众所周知的方法来向宿主细胞转染强毒性的手足口病致病病毒的基因组rna。强毒性的手足口病致病病毒的cdna能够通过公知的方法从如上所述那样分离或获取的强毒性的手足口病致病病毒中来制备。接着，培养由上述得到的产病毒细胞，从而使强毒性的手足口病致病病毒增殖。作为产病毒细胞的培养条件，能够根据现有公知的条件来进行。例如，能够培养产病毒细胞3～7天左右，直至观察到细胞病变效应(cpe)。cpe是指由于增殖后的病毒在细胞内积累而产生的产病毒细胞的形态变化，能够通过利用光学显微镜观察而容易地确认到。接着，回收增殖的强毒性的手足口病致病病毒。增殖的强毒性的手足口病致病病毒释放至培养液中或在产生细胞的内部积累，能够通过现有公知的方法来回收。例如，对于包含产病毒细胞的培养液，反复进行超声波破碎或冻融，破坏产病毒细胞之后，通过离心分离去除细胞残渣，由此能够回收增殖的强毒性的手足口病致病病毒。也可以根据需要，通过聚乙二醇沉淀或密度梯度超速离心等来进一步提纯所回收的强毒性的手足口病致病病毒。本实施方式的方法通过能够使强毒性的手足口病致病病毒稳定地增殖的宿主细胞而将将弱毒性的手足口病致病病毒的增殖限制为最小限度，由此，能够容易且稳定地生产强毒性的手足口病致病病毒。因此，根据本实施方式的方法，能够容易地制备强毒性的手足口病致病病毒株。即，根据第三实施方式，本发明提供一种采用上述方法所制备强毒性的手足口病致病病毒株。在本实施方式中，“强毒性的手足口病致病病毒株”是多个手足口病致病病毒粒子的集合体，集合体整体显示出强毒性。本实施方式中的“强毒性”与第一实施方式中的定义相同。本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株可以实质上由单一的血清型或基因型的强毒性的手足口病致病病毒而构成，也可以实质上(基本上)由多种血清型或基因型的强毒性的手足口病致病病毒而构成。在此，“实质上(基本上)由～构成”表示通过突变而减毒后的手足口病致病病毒的混入达到不会影响所制备的手足口病致病病毒株的神经致病性的程度。优选地，本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株实质上由ev71的vp1-145e突变株、或具有与之相同的对于scarb2的结合亲和性的并经由scarb2而感染的ev71、cva16、cva14或cva7的突变株而构成。本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株具有神经致病性，能够引起致命性感染。因此，能够用于开发强毒性的手足口病致病病毒株的疫苗或抗病毒药物。根据第四实施方式，本发明提供一种抗手足口病致病病毒疫苗的筛选方法，其包括下列步骤：(1)准备表达了灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)的转基因小鼠；(2)向所述转基因小鼠接种候选疫苗；(3)利用上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株来攻击所述步骤(2)中的转基因小鼠；以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。本实施方式中的“scarb2”及“强毒性的手足口病致病病毒”与第一实施方式中的定义相同，“强毒性的手足口病致病病毒株”与第三实施方式中的定义相同。在本实施方式的方法中，使用表达了灵长类的scarb2的转基因小鼠。本实施方式中的转基因小鼠能够通本领域中众所周知的方法来制作。例如，通过显微注射等向小鼠的受精卵中表达载体，该表达载体是导入将编码灵长类的scarb2的基因配置于适当的启动子序列的下游而成的，由此，能够制作表达了灵长类的scarb2的转基因小鼠。优选地，本实施方式中的转基因小鼠通过导入克隆了包含转录调控区的全长的灵长类的scarb2基因座的bac等人工染色体而制作。能够用于本实施方式的编码scarb2的基因可以来自任意的灵长类但优选来自人。如第一实施方式中所记载那样，编码灵长类的scarb2的基因的碱基序列信息能够从规定的数据库中获取。另外，作为表达了灵长类的scarb2的转基因小鼠，可以使用已经存在的系统，例如，能够使用表达了人scarb2的转基因小鼠hscarb2-tg10(《美国科学院院刊》,第110卷，第36期，第14753-14758页)等。优选地，本实施方式中所使用的转基因小鼠为建立了免疫反应的成年小鼠。不足4周龄的小鼠幼崽的免疫反应正在发育期间，因此，有时不能充分地评价疫苗的效果。因此，本实施方式中所使用的转基因小鼠优选为4周龄以上，特别优选为4～12周龄。接着，向上述转基因小鼠接种候选疫苗。候选疫苗包含处于开发阶段的疫苗、以及出货前进行检验以实施质量管理的产品化疫苗。作为候选疫苗，例如，可列举灭活疫苗、病毒样空心颗粒疫苗、活疫苗(减毒疫苗)、肽疫苗、dna疫苗等。候选疫苗的接种量根据候选疫苗的种类而不同，例如，能够在0.01～10μg/体重kg的范围内适当选择。另外，在本实施方式中，候选疫苗可以与佐剂混合后给药。佐剂是指非特异性地增强宿主动物的免疫反应的物质，各种佐剂是本
技术领域：
中所公知的。作为能够用于本实施方式的佐剂，例如，可列举：氢氧化铝、磷酸钙、磷酸铝、明矾、pepes、羧基乙烯基聚合物等，但不限定于这些。在本实施方式中，候选疫苗的接种能够进行一次或反复进行多次，但优选反复进行多次。在反复多次接种候选疫苗的情况下，优选以2～4周的间隔反复接种。对于候选疫苗的给药途径没有特别限定，例如，可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。接着，利用上述强毒性的手足口病致病病毒株来攻击接种候选疫苗后的上述转基因小鼠。攻击通过给药强毒性的手足口病致病病毒株来进行，给药量是向未给药候选疫苗的上述转基因小鼠给药时将会导致90％以上的小鼠死亡的量。即，优选地，本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株的攻击给药量为未给药候选疫苗的上述转基因小鼠中的ld50的10～100倍量。本实施方式对于强毒性的手足口病致病病毒株的给药途径没有特别限定，例如，可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。作为利用本实施方式中的强毒性的手足口病致病病毒株所进行的攻击，优选在接种上述候选疫苗1～20周后进行。另外，为了确定攻击的时段，可以预先从接种了候选疫苗的上述转基因小鼠中采取血清，并确认血清中的抗体滴度。接着，分析上述攻击后的转基因小鼠，由此评价候选疫苗的有效性。能够通过利用本领域中众所周知的方法来观察例如生死状态及有无瘫痪症状等而分析转基因小鼠。在本实施方式的筛选方法中，在通过给药候选疫苗，死亡率及瘫痪症状与未给药候选疫苗的转基因小鼠相比显著减少的情况下，则能够评价该候选疫苗有望作为抗手足口病致病病毒疫苗。另一方面，在通过给药候选疫苗，死亡率及瘫痪症状与未给药候选疫苗的转基因小鼠相比未见变化或增加的情况，则能够评价该候选疫苗无望作为抗手足口病致病病毒疫苗或者作为抗手足口病致病病毒疫苗无效。根据第五实施方式，本发明为一种抗手足口病致病病毒药物的筛选方法，其包括下列步骤：(1)准备表达了灵长类的清道夫受体b类成员2(scarb2)的转基因小鼠；(2)使所述转基因小鼠感染上述记载的强毒性的手足口病致病病毒株；(3)向所述步骤(2)中的转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物；以及(4)分析所述步骤(3)中的转基因小鼠。本实施方式中的“scarb2”，“强毒性的手足口病致病病毒”及“感染”与第一实施方式中定义相同，“强毒性的手足口病致病病毒株”与第三实施方式中的定义相同。在本实施方式的方法中，使用表达了灵长类的scarb2的转基因小鼠。本实施方式中的转基因小鼠与第四实施方式中的小鼠相同。本实施方式中所使用的转基因小鼠优选为4周龄以上，特别优选为4～12周龄。接着，向上述转基因小鼠给药并感染强毒性的手足口病致病病毒株。优选地，强毒性的手足口病致病病毒株的给药量为该转基因小鼠中的ld50的10～100倍量。本实施方式对于强毒性的手足口病致病病毒株的给药途径没有特别限定，例如，可列举腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。接着，向感染了强毒性的手足口病致病病毒的上述转基因小鼠给药抗手足口病致病病毒药物的候选化合物。作为候选化合物，可列举合成化合物、肽化合物、核酸、抗体等，这些候选化合物可以是新型化合物，也可以是公知的化合物。所给药的候选化合物的浓度根据化合物的种类而有所不同，例如，能够在1nm～10μm的范围内适当选择。另外，能够历时例如1天～2周来给药候选化合物。对于候选化合物的给药途径没有特别限定，例如，可列举口服给药、腹腔给药、静脉给药、皮下给药等。接着，分析已给药候选化合物的上述转基因小鼠，并评价候选化合物作为抗手足口病致病病毒药物的有效性。与第四实施方式相同地，转基因小鼠的分析能够通过本领域中众所周知的方法来进行。在本实施方式的筛选方法中，在通过给药候选化合物，死亡率及瘫痪症状与未给药候选化合物的转基因小鼠相比而显著减少的情况下，则能够评价该候选化合物有望作为抗手足口病致病病毒药物。另一方面，在通过给药候选化合物，死亡率及瘫痪症状与未给药候选化合物的转基因小鼠相比未见变化或增加的情况下，则能够评价该候选化合物无望作为抗手足口病致病病毒药物。实施例下面，通过例举实施例对本发明进行进一步说明。需要指出的是这些实施例丝毫不限定本发明。<1.硫酸乙酰肝素(hs)缺失细胞的制作>通过利用crispr/cas9系统的基因组编辑，制作不表达硫酸乙酰肝素(hs)的rd细胞。设计分别以ext1基因(genbank登录号nm_000127)及ext2基因(genbank登录号nm_000401、nm_207122、nm_1178083)为标靶的指导rna(sgrna)的序列，并将下面的编码sgrna的dna片段插入pspcas9(bb)-2a-gfp质粒(addgene公司制造)的bbsi切割位点。(i)用于ext1-sgrna的dna序列正义(sense):caccacccacaacacatc(序列号1)反义(antisense):aaaccatttcctccttc(序列号2)(ii)用于ext2-sgrna的dna序列正义(sense):cacccttcaattcaccaatcca(序列号3)反义(antisense):aaacctatttacattaac(序列号4)将得到的质粒转染至rd细胞，并培养3天。然后，将细胞提供给facsaria(becton,dickinson公司制造)，制备gfp阳性细胞。利用极限稀释法对所制备的细胞实施克隆，从而获得单克隆。针对得到的单克隆，通过下面的流程分析细胞表面上的hs的表达量。利用胰蛋白酶剥离并回收细胞，将其悬浮于含有2％胎牛血清的pbs。制备2×105细胞，使用小鼠抗hs单克隆抗体f58-10e4(amsbio公司制造)(1:50稀释)或同型对照抗体小鼠igmmm-30(biolegend公司制造)(1:50稀释)作为一抗，使用cy3标记抗小鼠igm抗体(jacksonimmunoresearch公司制造)(1:200稀释)作为二次抗体，分别在冰上使其反应30分钟。然后，通过离心分离从反应溶液中去除未反应的抗体，作为用于分析的样品。将用于分析的样品提供给bdlsrfortessax-20(becton,dickinson公司制造)，从而分析细胞表面的cy3结合量。另外，使用野生型rd细胞来代替得到的单克隆，除此之外，按照同样的流程制备的样品，将其用作阴性对照。将结果示于图1。在野生型rd细胞中，和与同型对照抗体反应的对照样品的荧光强度峰相比，与抗hs抗体反应的样品的荧光强度峰显著偏移，确认大量表达了hs(图1的左侧)。另一方面，在敲除了ext1基因的rd细胞克隆(rd-δext1)以及敲除了ext2基因的rd细胞克隆(rd-δext2)中，与抗hs抗体反应后的样品的荧光强度峰几乎和与同型对照抗体反应后的对照样品的荧光强度峰重叠，确认实质上未表达hs(图1的中央、右侧)。<2.hs缺失/scarb2过表达细胞的制作>通过下面的流程，向上述1中得到的rd-δext1及rd-δext2导入人scarb2基因(genbank登录号nm_001204255、nm_005506)，从而制作过表达人scarb2的hs缺失rd细胞(rd-δext1-scarb2及rd-δext2-scarb2)。将整合有人scarb2基因的逆转病毒载体(pqcxip-hscarb2)和pvsv-g转染至gp2-293包装细胞，并在2天后回收上清，从而得到人scarb2表达逆转病毒。使得到的逆转病毒感染rd-δext1及rd-δext2之后，在1μg/ml嘌呤霉素存在下进行选择培养，从而得到rd-δext1-scarb2及rd-δext2-scarb2。另外，通过同样的流程，制作使野生型rd细胞过表达scarb2基因而得到的细胞(rd-scarb2)。<3.使用hs缺失/scarb2过表达细胞增殖ev71>首先，通过下面的流程制备传代数p0的ev71。从ev71isehara株(由日本国立传染病研究所获得)中提取基因组rna，使用superscript(注册商标)iii逆转录酶(thermofisherscientific公司制造)制备cdna。通过利用下面的引物组的pcr来扩增对于全长基因组rna的cdna(序列号7)。5’引物(noti切割序列+t7启动子序列+病毒基因组5’端的20个碱基)cggcggccgcgtaatacgactcactataggttaaaacagcctgggttg(序列号5)3’引物(sali切割序列+poly(a)序列(25碱基)+病毒基因组3’端的10个碱基)tactcactttttttttttttttttttttttttctattct(序列号6)表1.ev71isehara株全长cdna序列(序列号7)表1a表1b表1c将得到的全长cdna插入psav14载体的noti/sali切割位点以进行克隆。以其为模板，使用megascript(注册商标)t7kit(ambion公司制造)进行体外转录，从而得到全长基因组rna。使用lipofectamine(注册商标)2000将4μg全长基因组rna转染至2×106的rd-scarb2细胞，第二天或第三天，在90％以上的细胞观察到细胞病变效应(cpe)使回收细胞。对所回收的细胞进行三次冻融，并提供给超声波破碎机，从而完全粉碎细胞，使病毒游离出来。然后，通过离心分离去除细胞残渣，并将上清作为病毒液而回收。使所回收的病毒以moi＝0.01感染rd-scarb2细胞(1×106)，历时5天观察细胞病变效应(cpe)，观察到显著的cpe后，回收细胞。通过与上述同样的流程，回收增殖后的病毒。并将其作为传代数p0的ev71。通过与上述同样的流程使传代数p0的ev71感染rd-scarb2细胞，从而得到传代数p1的ev71。使用传代数p1的ev71反复进行同样的流程，从而得到传代数p2的ev71(rd-scarb2(p2))。然后，使用上述1及2中得到的各细胞来代替rd-scarb2细胞，并进一步通过同样的流程连续传代rd-scarb2(p2)，得到直至传代数为p3～p5的ev71。通过下面的流程分析所得到的传代数p2～p5的ev71的衣壳蛋白vp1的氨基酸序列。从传代数p0～p3的ev71中提取rna，通过逆转录合成cdna。使用下面的序列的引物，扩增vp1基因(genbank登录号ab177816)的部分区域(对应于pv1的第58～297个氨基酸)。通过测序来分析被扩增后的dna片段的碱基序列。正向(forward):cnayayaatatatta(序列号8)反向(reverse):anacnarrttncccatca(序列号9)将结果示于表2。确认到，在由野生型rd细胞传代而来的ev71中，vp1的第145个谷氨酸(e)通过一次传代而突变为谷氨酰胺(q)。而由rd-δext1-scarb2及rd-δext2-scarb2传代而来的ev71仅是反复三次传代，仍然保持了vp1的第145个谷氨酸而没有突变。该结果表明，通过使用未表达hs且过表达scarb2的宿主细胞，能够使vp1的第145个氨基酸为谷氨酸(e)的强毒性ev71稳定地增殖。表2.vp1的第145个氨基酸表2宿主细胞p2p3p5rd-qqrd-δext1-eqrd-δext2-eqrd-scarb2eeq/erd-δext1-scarb2-eerd-δext2-scarb2-ee<4.由传代增殖而引起的ev71的毒性变化(1)>将利用rd-scarb2细胞使2716-yamagata-03株(由日本山形县卫生研究所获得)1代传代增殖而得到的株作为传代数p0的ev71；除此之外，通过与上述3同样的流程，使用上述1及2中得到的各个细胞进行连续传代，由此制备传代数p1～p3的ev71，并通过下面的流程来分析它们的致病性。作为人scarb2表达转基因小鼠，使用hscarb2-tg10(《美国科学院院刊》,第110卷，第36期，第14753-14758页)。向6～7周龄的hscarb2-tg10(各10只)腹腔给药106tcid50/ml上述各种ev710.5ml。给药之后，历时2周每天观察生死状态、瘫痪症状及体重变化。瘫痪率是表示在2天或更长的时间内四肢中的任意一个可见完全或不完全瘫痪的症状的小鼠的比例。体重变化率以给药前的体重为100％而算出。将结果示于表3～5。这表明，由rd-δext1-scarb2及rd-δext2-scarb2传代而来的ev71即使反复三次传代，仍然保持了与p0相同或超过其致病性。由该结果表明，通过使用未表达hs且过表达了scarb2的宿主细胞，能够使强毒性ev71稳定地增殖。表3.给药ev712周后的瘫痪率(％)表3宿主细胞p0p1p3rd-100rd-δext1--0rd-δext2-00rd-scarb290600rd-δext1-scarb2-100100rd-δext2-scarb2-100100表4.给药ev712周后的致死率(％)表4宿主细胞p0p1p3rd-00rd-δext1--0rd-δext2-00rd-scarb250300rd-δext1-scarb2-90100rd-δext2-scarb2-6070表5.给药ev716天后的体重变化(％)表5宿主细胞p0p1p3rd-99.696.7rd-δext1--96.1rd-δext2-95.697.4rd-scarb283.391.096.9rd-δext1-scarb2-76.0全部死亡rd-δext2-scarb2-72.773.0将根据上面的结果所预测的ev71的减毒机理示于图2。vp1衣壳蛋白的第145个氨基酸为谷氨酸(e)的强毒性ev71(vp1-145e)、以及同氨基酸为甘氨酸(g)或谷氨酰胺(q)的弱毒性ev71(vp1-145g或vp1-145q)均经由scarb2而感染宿主细胞(黑色箭头)。但是，在细胞表面上表达了hs的情况下，弱毒性ev71被hs吸引而靠近细胞表面，从而比强毒性ev71更容易经由scarb2而感染宿主细胞，而且，与hs结合而整合入细胞内的弱毒性ev71也与经由scarb2的感染路径进行汇合而增殖(白色箭头)。一般认为，其结果，弱毒性ev71优先增殖，随着传代的增加，发生ev71的减毒。<5.由传代增殖而引起的ev71的毒性变化(2)>使用rd-δext1-scarb2来代替rd-scarb2作为宿主细胞，除此之外，通过与上述3同样的流程，将全长基因组rna转染至细胞，并回收增殖后的病毒。分别向10周龄的hscarb2-tg10(各10只)静脉给药对所回收的病毒进行1代传代增殖而得到的病毒(rd-δext1-scarb2(p1))、以及上述3中使用rd-scarb2而制备的传代数p0的ev71(rd-scarb2(p2))，并比较给药2周后的存活率。将结果示于表6。这表明，与rd-scarb2(p2)相比，rd-δext1-scarb2(p1)经由高出1000倍以上的毒性。表6.rd-scarb2(p2)和rd-δext1-scarb2(p1)的毒性比较表6<6.使用强毒性ev71的疫苗的检验(1)>将sk-ev006(vp1-145g)株(由日本国立传染病研究所获得)作为ev71的活疫苗，将用福尔马林固定后的相同株用作灭活疫苗，并分别通过下面的流程来免疫hscarb2-tg10转基因小鼠。(利用活疫苗的免疫)向4周龄的hscarb2-tg10转基因小鼠腹腔给药106tcid50的sk-ev006(vp-145g)株(基础免疫)。然后，在8周龄时，进行相同的给药(加强免疫)。向对照组给药pbs。(利用灭活疫苗的免疫)使100μl福尔马林固定sk-ev006(vp-145g)与等量的alhydrogel(注册商标)(invivogen公司制造)混合，制得灭活疫苗制备物。将0.3μg灭活疫苗制备物进行皮下给药至4周龄的hscarb2-tg10转基因小鼠(基础免疫)。然后，在8周龄时，进行相同的给药(加强免疫)。向对照组给药等量的alhydrogel/pbs。在每只小鼠10周龄时采血，从而获得血清。通过标准噬斑减少中和试验(prnt)来评价血清的中和抗体滴度。简而言之，连续稀释得到的血清，与攻击病毒(500pfu)混合之后，使用rd细胞及sk-ev006(vp-145g)株进行噬斑检测，将实现噬斑数量减少80％的血清的最大稀释的倒数作为中和抗体滴度并记录。上述采血后第二天，向每只各小鼠静脉给药攻击病毒。作为攻击病毒，使用isehara株(上述3中所制备的rd-scarb2(p2))。攻击病毒的给药量采用使10周龄小鼠感染上述攻击病毒而预先确定的ld50的10～100倍量。攻击之后，历时2周每天观察生死状态及瘫痪症状。瘫痪率与上述5中的记载同样地算出。将结果示于表7及表8。在给药活疫苗和灭活疫苗中的任意一种的情况下，均可见中和抗体滴度升高、死亡率及瘫痪率显著降低，表示防御了强毒性ev71的攻击。由该结果确认到，能够使用hscarb2-tg10的成年小鼠来筛选抗ev71疫苗。表7.活疫苗的防御效果(攻击：iseharard-scarb2(p2)107tcid50)表7表8.灭活疫苗的防御效果(攻击：iseharard-scarb2(p2)107tcid50)表8<7.使用强毒性ev71检验疫苗(2)>与上述6同样地，通过灭活疫苗免疫hscarb2-tg10转基因小鼠。在每只小鼠的21周龄时采血，除此之外，通过与上述6同样的流程来进行噬斑检测。上述采血后第二天，使用上述3中所制备的rd-δext1-scarb2(p1)(ld50＝103.5)作为攻击病毒，除此之外，通过与上述6同样的流程进行攻击感染，并算出死亡率及瘫痪率。将结果示于表9。确认到，在使用rd-δext1-scarb2(p1)作为攻击病毒的情况下，由于其较高的毒性，可以通过比rd-scarb2(p2)更少量的病毒充分地进行攻击。由该结果表明，使用为表达hs且过表达了scarb2的宿主细胞传代增殖后的ev71可以用作用于疫苗检验的攻击病毒。表9.灭活疫苗的防御效果(攻击：iseharard-δext1-scarb2(p1)2×105tcid50)表9疫苗接种量(μg/针)死亡率(％)瘫痪率(％)01001000.0030330.0317170.3013<8.使用强毒性ev71检验疫苗(3)>除上述isehara株(c2型)之外，制备基因型不同的强毒性ev71(y90-3896株(c1型)(由日本仙台医疗中心病毒中心获得)、n772株(c4型)(由日本仙台医疗中心病毒中心获得)、c7/osaka株(b4型)(由日本国立传染病研究所获得)、以及2716-yamagata-03株(b5型)(由日本山形县卫生研究所获得))来作为用于疫苗检验的攻击病毒。将上述强毒性ev71的全长cdna序列、以及用于cdna扩增的引物组如下所示。表10.y90-3896株(c1型)(序列号10)表10a表10b表10c表11.n772株(c4型)(序列号11)表11a表11b表11c表12.c7/osaka株(b4型)(序列号12)表12a表12b表12c表13.2716-yamagata-03株(b5型)(序列号13)表13a表13b表13c表14.pcr使用的引物组(序列号14～21)表14将rd-δext1-scarb2用作宿主细胞以代替rd-scarb2，除此之外，通过与上述3同样的流程来制备传代数p0的ev71。使rd-δext1-scarb2细胞感染得到的传代数p0的ev71，得到传代数p1的ev71。将得到的传代数p1的ev71用作攻击病毒(接种量：1×106tcid50)，除此之外，通过与上述6同样的流程来攻击被灭活疫苗免疫后的hscarb2-tg10转基因小鼠，并算出死亡率及瘫痪率。将结果示于表15。确认到，使用rd-δext1-scarb2细胞传代增殖后的ev71均具有较高的毒性，能够用作攻击病毒。另外还表明，上述6中所制备的灭活疫苗不仅对于isehara株有效，对于基因型不同的多种强毒性ev71株也有效。表15.灭活疫苗对于强毒性ev71(rd-δext1-scarb2(p1))的攻击感染的防御效果表15<9.使用强毒性ev71检验疫苗(4)>使用上述8中所制备的n772株(rd-δext1-scarb2(p1)、106tcid50)作为攻击病毒，除此之外，通过与上述6同样的流程来免疫及攻击成年hscarb2-tg10小鼠，并算出血清的中和抗体滴度、体重变化、死亡率以及瘫痪率，从而评价灭活疫苗的有效性。将结果示于图3及4、以及表16。未接种灭活疫苗的hscarb2-tg10小鼠体重显著减少，死亡率及瘫痪率均为100％，但随着灭活疫苗的接种量的增加，可见中和抗体滴度升高、死亡率及瘫痪率的显著降低，从而确认防御了强毒性ev71的攻击。由该结果表明，通过使用在成年hscarb2-tg10小鼠、以及缺失hs且过表达scarb2的宿主细胞中传代增殖后的ev71株，能够评价抗ev71疫苗的有效性，可以筛选抗ev71疫苗。表16.灭活疫苗对于n772株(rd-δext1-scarb2(p1))的攻击感染的防御效果表16疫苗接种量(μg/针)死亡率(％)瘫痪率(％)01001000.00380900.0330500.300而且，通过算出脊髓中的ev71的滴度来评价接种灭活疫苗对于强毒性ev71的增殖抑制效果。通过与上述6同样的流程来利用灭活疫苗免疫成年hscarb2-tg10小鼠，并利用上述8中所制备的n772株(rd-δext1-scarb2(p1)、106tcid50)进行攻击。从攻击1天后、2天后、3天后的小鼠(各6只)中摘取脊髓(～0.1g)，加入10倍量的dmem(日水制药株式会社制造)并匀浆。以15000rpm、4℃进行分离得到的匀浆物20分钟，从而回收上清。使用rd-scarb2细胞测定上清的病毒滴度(tcid50)。将结果示于图5。在未接种灭活疫苗的hscarb2-tg10小鼠的脊髓中，ev71增殖，而在已接种过灭活疫苗的hscarb2-tg10小鼠的脊髓中，则几乎未见ev71增殖。由该结果表明，通过使用成年hscarb2-tg10小鼠、以及缺失hs且过表达scarb2的宿主细胞中传代增殖后的ev71株，能够评价抗ev71疫苗的有效性，可以筛选抗ev71疫苗。序列表<110>东京都医学综合研究所(tokyometropolitaninstituteofmedicalscience)<120>强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用<130>2936-pct<150>jp2017-072562<151>2017-03-31<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ext1-sgrna正义<400>1caccacccacaacacatc18<210>2<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ext1-sgrna反义<400>2aaaccatttcctccttc17<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ext2-sgrna正义<400>3cacccttcaattcaccaatcca22<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ext2-sgrna反义<400>4aaacctatttacattaac18<210>5<211>48<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ev71isehara5'-引物<400>5cggcggccgcgtaatacgactcactataggttaaaacagcctgggttg48<210>6<211>39<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><221><222><223>ev71isehara3'-引物<400>6tactcactttttttttttttttttttttttttctattct39<210>7<211>7434<212>dna<213>肠道病毒71isehara株(enterovirus71iseharastrain)<400>7ttaaaacagcctgtgggttgcacccacccacagggcccactgggcgccagcactctggta60ctgaggtacctttgtgcgcctgtttttacttcccctccccgaagtaacttagaagctgta120aatcaacgatcaatagtaggtgtgacacaccagtcacactttggtcaagcacttctgttt180ccccggactgagtatcaataggctgctcgcgcggctgaaggagaaaacgttcgttacccg240accaactacttcgagaagcttagtaccaccatgaacgaggcagagtgtttcgttcagcac300aaccccagtgtagatcaggctgatgagtcactgcaacccccatgggcgaccatggcagtg360gctgcgttggcggcctgcccatggagaaatccatgggacgctctaattctgacatggtgc420gaagagcctattgagctagttggtagtcctccggcccctgaatgcggctaatcctaactg480cggagcacatgctcacaaaccagtgggtggtgtgtcgtaacgggcaactctgcagcggaa540ccgactactttgggtgtccgtgtttccttttattcttatattggctgcttatggtgacaa600tcaaagaattgttaccatatagctattggattggccatccagtgtgcaacagagcaattg660tttatctattcattggtttcgtacctttatcactgaagtctgtgatcactcttaaattca720ttttgaccctcaatacaattaaacatgggctcacaggtgtccacacagcgctccggttcg780catgaaaattctaactcagccaccgagggttccaccataaattatactaccattaattac840tataaagactcctatgccgccacagcaggtaaacagagccttaagcaggacccagacaag900tttgcaaatcctgtcaaagacatcttcactgaaatggcagcgccattaaaatctccatct960gctgaggcatgtggttacagcgatcgggtagcacagttaactattggcaactctaccatc1020actacgcaagaagcagcaaacatgatagttggctatggtgagtggccatcctactgctcg1080gattctgacgccacagcagtggacaaaccaacgcgcccagatgtttcagtgaataggttt1140tatacattggacactaaattgtgggagaaatcatccaaggggtggtactggaaattcccg1200gatgtgttgactgaaaccggggtcttcggtcaaaatgcacaattccactacctctatcgg1260tcgggattctgcattcacgtgcagtgcaatgctagtaagttccaccaaggagcactccta1320gtcgctgtcctcccagaatatgtcattgggacagtagcaggtggcacagggacggaggat1380agtcaccccccttacaagcagactcaacccggtgctgatggctttgaattgcaacacccg1440tacgtgcttgatgctggcattccaatatcacaattaacagtgtgcccacaccagtggatt1500aatttgaggactaacaattgtgccacaataatagtaccgtacataaacgcactacccttt1560gattctgccttgaaccattgcaactttggtctgctggttgtgcctattagcccgttagat1620tatgaccaaggtgcgacgccagtgatccccattactatcacattggccccaatgtgctct1680gaatttgcaggccttaggcaagcagttacgcaagggtttcctactgagctgaaacccggc1740acaaaccaatttttaaccactgacgatggcgtctcagcacccattctgccaaactttcac1800cccaccccgtgtatccatatacccggtgaagttagaaacttgctagagctatgccaggtg1860gagaccatcttagaggttaacaatgtacccacgaatgccactagcttaatggagaggctg1920cgcttcccggtctcagcccaagccgggaaaggtgaactatgtgcagtgttcagagctgac1980cctgggcgaaatggaccatggcagtccaccctgttgggtcagttgtgtgggtattacacc2040caatggtcaggatcactggaagtcaccttcatgtttactgggtcctttatggctactggc2100aagatgctcatagcatacacaccaccaggaggccccttacccaaggaccgggcgaccgcc2160atgttgggtacacacgtcatctgggactttgggttgcaatcgtctgtcacccttgtaata2220ccatggatcagcaacactcactacagagcgcacgctcgagatggtgtgttcgattactac2280actacaggtttggttagcatatggtaccagacgaattacgtggttccaattggggcacct2340aatacagcctacataatagcattggcggcagcccagaagaatttcaccatgaagttgtgt2400aaggatgctagtgatatcctacagacaggcactatccagggagacagggtggcagatgtg2460attgagagttctataggggatagtgtgagcagagccctcacccaagctttaccggcacct2520acaggccaaaacacgcaggtaagcagccaccgattagacactggtaaagttccagcactc2580caagccgctgaaattggagcatcatcaaatgccagcgatgagagtatgattgagacacga2640tgtgttcttaattcacacagcacagctgagaccactcttgatagcttcttcagtagagcg2700ggattagttggagagatagacctccctcttgaaggcacaaccaacccgaatgggtatgca2760aattgggacatagacataacaggttacgcgcaaatgcgtagaaaggtggagctgtttacc2820tacatgcgttttgacgcagagttcaccttcgtagcgtgcacgcctaccggggaagttgtc2880ccgcaattgctccaatatatgtttgtaccacctggagcccccaagccagactctagagaa2940tctcttgcatggcaaactgccactaatccctcagtctttgtgaagctgtcagacccccca3000gcacaggtttcagttccattcatgtcacctgcaagcgcctaccaatggttttatgacggg3060tatcccacattcggtgaacacaagcaggaaaaagaccttgaatatggggcatgcccaaac3120aacatgatgggtacgttctcggtgcggactgtaggaacctcgaagtccaagtacccattg3180gtgatcaggatttacatgaggatgaagcacgtcagggcgtggatacctcgcccaatgcgt3240aaccaaaactacttatttaaagccaacccaaattatgctggtaactccattaaaccaact3300ggtaccagtcgcacagcgatcaccactctcgggaaatttggacagcaatccggggctatc3360tacgtgggcaactttagagtggttaaccgccaccttgctactcataatgactgggcaaac3420cttgtttgggaagacagctcccgcgacttgctcgtatcatctacctctgcccaaggttgt3480gacacgattgctcgttgcaactgtcagacaggagtgtattactgtaactcaatgagaaaa3540cactatccggtcagtttctcgaagcccagtttgatcttcgtagaggccagcgagtattac3600cctgctagataccagtcacaccttatgcttgcagtgggtcactcggagccaggggattgc3660ggtggcattcttagatgccaacacggtgtcgtagggatagtttccaccgggggaaacggc3720ctagtggggttcgccgatgtgagggatcttctgtggttggatgatgaggccatggagcag3780ggcgtgactgattacattaaagggcttggagatgcttttggcatggggtttacagacgca3840gtgtcaagagaagttgaagcattgaaaaatcacttgatcggctcagagggtgccgtggag3900aggatccttaagaacttagttaaactcatctctgcgctcgtcattgtcatcaggagtgat3960tatgacatggtcacattgacggcaacacttgccctgatcgggtgtcacggcagcccttgg4020gcctggattaagtcgaaaacagcgtcgattttgggcataccgatggctcaaaagcagagt4080gcctcttggttaaagaagttcaacgatgcggcgagtgccgccaaggggcttgagtggatc4140tccaacaaaatcagcaaatttatcgattggctcaaggagaaaattatcccggctgctaaa4200gagaaagtcgagtttctaaacaatctaaagcaactccccttattggagaaccaaatttct4260aatctcgaacagtcagcagcttcccaggaggacctcgaagcgatgtttggcaacgtgtct4320tatctggcccacttctgccgcaaattccaacccctctatgccacggaagcaaagagggtg4380tatgccctagaaaagagaatgaataattacatgcagttcaagagcaaacaccgtattgaa4440cctgtatgcctgattatcagaggctcgcctggcactgggaagt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