用于内化酶的组合物和方法与流程
相关申请的交叉引用
本专利申请根据35u.s.c.§119(e)要求以下的利益：于2018年5月17日提交的美国临时申请号62/673,098；于2017年10月19日提交的美国临时申请号62/574,719；以及于2017年6月7日提交的美国临时申请号62/516,656，所述美国临时申请各自在此以引用的方式整体并入。
本专利申请大体上涉及用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。本专利申请特别涉及含有替代酶的靶向蛋白质复合物及其在治疗溶酶体贮积病中的用途。
背景技术：
溶酶体贮积病是影响溶酶体中无数底物降解的一类罕见疾病。那些底物包括鞘脂、粘多糖、糖蛋白、糖原和寡糖，它们可在患有疾病的那些人的细胞中累积，导致细胞死亡。受溶酶体贮积病影响的器官包括中枢神经系统(cns)、外周神经系统(pns)、肺、肝、骨、骨骼肌和心肌、以及网状内皮系统。
治疗溶酶体贮积病的选项包括酶替代疗法(ert)、底物减少疗法、药物分子伴侣介导疗法、造血干细胞移植疗法和基因疗法。底物减少疗法的例子包括使用美格鲁特或依利格鲁司特治疗1型戈谢病。这些药物通过阻断合酶活性起作用，所述合酶减少了后续底物产生。例如，造血干细胞疗法(hsct)用于改善和减缓患有某些形式的mps的患者中的负中枢神经系统表型。参见r.m.boustany,"lysosomalstoragediseases--thehorizonexpands,"9(10)nat.rev.neurol.583-98，2013年10月。表1列出了一些溶酶体贮积病及其相关酶或其它蛋白质。
表1：溶酶体贮积病
两种最常见的lsd是庞贝氏症和法布里病。估计发病率为10,000分之一的庞贝氏症由缺陷型溶血体酶α-葡糖苷酶(gaa)(其导致溶酶体糖原的缺陷加工)引起。溶酶体糖原的累积主要发生在骨骼、心脏和肝组织中。婴儿发作型庞贝氏症通常在2岁前导致心脏扩张、张力减退、肝肿大和由于心肺衰竭的死亡。成人发作型庞贝氏症晚至二十至六十岁发生，并且通常只涉及骨骼肌。目前可用的治疗包括genzyme的
包括轻度晚期发作病例、估计总发病率为3,000分之一的法布里病，由缺陷型溶酶体酶α-半乳糖苷酶a(gla)(其导致球形三脂酰基鞘氨醇在血管及其它组织和器官中的累积)引起。与法布里病相关的症状包括来自神经损伤和/或小血管阻塞的疼痛，肾功能不全和最终的衰竭，心脏并发症如高血压和心肌病，皮肤病症状如血管角化瘤的形成、无汗症或多汗症，以及眼部问题如角膜涡状营养不良、轮辐状白内障、以及结膜和视网膜血管异常。目前可用的治疗包括genzyme的
用于溶酶体贮积病的目前治疗不太理想。例如，ert一般必须以高频率和高剂量施用，例如每两周一次和高达40mg/kg。另外，一些替代的酶可为免疫学交叉反应性的(crim)，刺激受试者中igg的产生并且因此阻碍酶经由甘露糖-6-磷酸(m6p)受体递送至溶酶体。igg可屏蔽替代酶的m6p残基，并且抗原-igg-抗体复合物可经由fc受体摄取到细胞溶酶体内，从而优先将替代酶分流至巨噬细胞。
将替代酶递送至适当的受累组织也是无效的(参见表2和desnick&schuchman,“enzymereplacementtherapyforlysosomaldiseases:lessonsfrom20yearsofexperienceandremainingchallenges,”13annu.rev.genomicshum.genet.307-35,2012)。例如，经历用于婴儿型庞贝氏症的长期酶替代治疗的患者仍然可能患有言语鼻音过重、残余肌肉无力、上睑下垂、骨量减少、听力丧失、误吸风险、咽下困难、心律失常和吞咽困难。替代酶的剂量常常必须随着时间过去增加至每周一次或每两周一次40mg/kg。
表2：ert的无效组织靶向
内源性甘露糖-6-磷酸受体(mpr)介导大多数重组酶至溶酶体的转运。存在两种互补形式的mpr：阳离子非依赖性(ci-mpr)和阳离子依赖性(cd-mpr)。任一种形式的敲除都具有错位的(missorted)溶酶体酶。溶酶体水解酶在内质网中合成，并且移动到顺面高尔基体网络，在其中它们通过添加甘露糖-6-磷酸(m6p)基团进行共价修饰。这种标记物的形成取决于两种溶酶体酶的序贯效应：udp-n-乙酰葡糖胺-l-磷酸转移酶(g1cnac-磷酸转移酶)和n-乙酰葡糖胺-l-磷酸二酯-α-n-乙酰氨基葡糖苷酶(外显酶)。glcnac-磷酸转移酶催化g1cnac-1-磷酸盐残基从udp-g1cnac到水解酶的高甘露糖型寡糖中所选择的甘露糖的c6位置的转移。然后，外显酶去除末端g1cnac，暴露m6p识别信号。在反面高尔基体网络中，m6p信号允许通过选择性结合m6p受体，将溶酶体水解酶与所有其它类型的蛋白质隔离。所产生的网格蛋白包被囊泡从反面高尔基体网络出芽脱落，并且与次级内体融合。在次级内体的低ph下，水解酶从m6p受体解离，并且空受体被循环到高尔基体用于更多轮转运。
除了经由甘露糖受体递送的β-葡糖脑苷脂酶之外，重组溶酶体酶包含m6p糖基化并且主要经由ci-mpr/igf2r递送至溶酶体。然而，糖基化/ci-mpr介导的酶替代递送并未达到所有临床相关组织(表2)。酶替代疗法的改善已集中于通过以下改善ci-mpr递送：(i)使用β2-激动剂克仑特罗增加ci-mpr的表面表达(koeberl等人，“enhancedefficacyofenzymereplacementtherapyinpompediseasethroughmannose-6-phosphatereceptorexpressioninskeletalmuscle,”103(2)mol.genet.metab.107-12,2011)，(ii)增加酶上m6p残基的量(zhu等人，“conjugationofmannose-6-phosphate-containingoligosaccharidestoacidalpha-glucosidaseimprovestheclearanceofglycogeninpompemice,”279(48)j.biol.chem.50336-41,2004)，或(iii)将igf-ii结构域与酶融合(maga等人，“glycosylation-independentlysosomaltargetingofacidalpha-glucosidaseenhancesmuscleglycogenclearanceinpompemice,”288(3)j.biol.chem.1428-38,2013)。
大量溶酶体贮积病无法通过酶替代疗法或基因疗法充分治疗，主要是由于替代酶对相关组织或器官的弱靶向、受体宿主中的负面免疫反应以及低血清半衰期。存在改善的酶替代疗法的需要，所述改善的酶替代疗法增强且促进酶的更佳组织生物分布和溶酶体摄取。申请人已开发了改善的酶替代疗法，其使用抗体引导的酶对靶受累组织的溶酶体的递送，这不依赖于ci-mpr而发生。
技术实现要素：
申请人已发现，当与作为多结构域治疗性蛋白质的部分的递送结构域结合时，替代酶可以有效地递送到靶细胞内。可以经由包含多结构域治疗性蛋白质的编码序列的基因治疗载体，例如病毒载体、裸多核苷酸、多核苷酸复合物等，将多结构域治疗性蛋白质递送到离体或在体内的细胞内。
在一个方面，本发明提供了包含编码多结构域治疗性蛋白质的核酸序列的多核苷酸。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含酶结构域和递送结构域。在一个实施例中，多核苷酸还包含病毒载体核酸序列。在一个具体实施例中，多核苷酸还包含腺相关病毒(aav)核酸序列。
在一个实施例中，酶结构域具有水解酶活性，例如糖基化酶，例如糖苷酶，例如α-葡糖苷酶(gaa)或α-半乳糖苷酶a(gla)。在一些实施例中，酶结构域包含如seqidno:1所示的氨基酸序列或其生物活性部分。在一些实施例中，酶结构域包含如seqidno:78所示的氨基酸序列。在一些实施例中，酶结构域基本上由如seqidno:78所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，酶结构域由如seqidno:78所示的氨基酸序列组成。在一个实施例中，递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在一个实施例中，内化效应物是itga7分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63或itga7的scfv(例如，图1a，小图g)。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含两个递送结构域(例如，图1a，小图h)。在一个实施例中，第一递送结构域结合内化效应物，以促进酶递送至适当的靶细胞或靶亚细胞区室；并且第二递送结构域结合转胞吞作用效应物，以促进多结构域治疗性蛋白质跨越生理障碍如肺泡膜、肝内皮、血脑屏障等等的转运。在一个具体实施例中，第二递送结构域是抗转铁蛋白受体(tfr)scfv结构域。在一个具体实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含gaa酶结构域、抗cd63scfv第一递送结构域和抗tfrscfv第二递送结构域。在另一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含gaa酶结构域、抗itga7scfv第一递送结构域和抗cd63scfv第二递送结构域。
在一个方面，本发明提供了基因治疗载体，例如aav载体、裸多核苷酸、多核苷酸复合物等，其包含编码包含酶结构域和递送结构域的多结构域治疗性蛋白质的核酸序列。
在一个实施例中，酶结构域具有水解酶活性，例如糖基化酶，例如糖苷酶，例如α-葡糖苷酶或α-半乳糖苷酶a。在一个实施例中，递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在一个实施例中，内化效应物是itga7分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63或itga7的scfv。
在一个方面，本发明提供了包含酶结构域和递送结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，酶结构域具有水解酶活性，例如糖基化酶，例如糖苷酶，例如α-葡糖苷酶或α-半乳糖苷酶a。在一个实施例中，递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在另一个实施例中，内化效应物是itga7分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63或itga7的scfv。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质用于治疗需要酶替代疗法的患者。
在一个方面，本发明提供了在细胞中产生多结构域治疗性蛋白质的方法，所述多结构域治疗性蛋白质包含酶结构域和递送结构域。在一个实施例中，通过使细胞与包含编码多结构域治疗性蛋白质的核酸序列的基因治疗载体接触，来产生多结构域治疗性蛋白质。核酸序列随后整合到细胞的基因组基因座内，在核酸序列是dna的情况下，由所述细胞转录且翻译核酸序列，或在核酸序列是rna的情况下，由所述细胞翻译核酸序列，并且产生多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，基因治疗载体是常用于细胞转染中的载体，例如腺相关病毒(aav)载体。在一个实施例中，基因治疗载体是裸多核苷酸。在一个实施例中，基因治疗载体是多核苷酸复合物，例如脂质纳米颗粒。在一个实施例中，基因组基因座是安全港基因座，其使得多结构域治疗性蛋白质的高表达成为可能，而不干扰必需基因的表达或者促进癌基因或其它有害基因的表达。在一个实施例中，基因组基因座是腺相关病毒位点。
在一个实施例中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或小鼠细胞。在一个实施例中，细胞是离体的，例如hek293细胞系。在另一个实施例中，细胞是体内的，并且将包含多结构域治疗性蛋白质编码核酸序列的基因治疗载体施用于人或非人受试者。
在一个实施例中，酶结构域具有水解酶活性，例如糖基化酶，例如糖苷酶，例如α-葡糖苷酶(gaa)或α-半乳糖苷酶a(gla)。在一个实施例中，递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63的scfv(例如，seqidno:2)。在一些实施例中，多结构域治疗性多肽包含可操作地连接至gaa(如seqidno:1所示)、结合cd63的scfv(例如，包含如seqidno:2所示的氨基酸序列的scfv)，或其生物活性部分(如seqidno:78所示)。在一些实施例中，多结构域治疗性多肽包含如seqidno:10或seqidno:79所示的序列。
在一个具体实施例中，将包含编码scfv水解酶融合蛋白的多核苷酸的aav载体施用于人或非人受试者。多核苷酸随后在基因组基因座处整合，并且产生编码的融合蛋白。在一个具体实施例中，融合蛋白是抗cd63scfv-gaa融合蛋白(例如，如seqidno:10或seqidno:79中所示)或抗itga7scfv-gaa融合蛋白，所述人或非人受试者缺乏内源性gaa活性，并且gaa活性在该受试者中得到有效恢复。
在一个方面，本发明提供了通过向患者施用包含核酸序列的基因治疗载体，来治疗患有酶缺乏症的患者(人或非人)的方法，所述核酸序列编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，酶结构域包含糖苷酶，例如gaa(例如，seqidno:1)或其生物活性部分(例如，seqidno:78)、或gla(例如，uniprotkb编号p06280，aa32-429，seqidno:13)，并且患者患有庞贝氏症或法布里病。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质的递送结构域是与内化效应物例如cd63或itga7结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，递送结构域是结合cd63的scfv分子。在一个实施例中，递送结构域是结合itga7的scfv分子。在另一个实施例中，基因治疗载体包括包含核酸序列的aav载体，所述核酸序列编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质(例如，seqidno:10或seqidno:79)。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含核酸序列的aav载体，所述核酸序列编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在另一个实施例中，基因治疗载体包括包含核酸序列的裸多核苷酸，所述核酸序列编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质(例如，seqidno:10或seqidno:79)。在另一个实施例中，基因治疗载体包括包含核酸序列的裸多核苷酸，所述核酸序列编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在另一个实施例中，基因治疗载体包括包含核酸序列的多核苷酸复合物，所述核酸序列编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质(例如，seqidno:10或seqidno:79)。在另一个实施例中，基因治疗载体包括包含核酸序列的多核苷酸复合物，所述核酸序列编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。
在一个方面，本发明涉及用于在医学中使用的根据本发明的组合物。在一个实施例中，该组合物，例如药物组合物，可包括包含核酸序列的基因治疗载体，所述核酸序列编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质的递送结构域是与内化效应物例如cd63或itga7结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，递送结构域是结合cd63的scfv分子。在一个实施例中，递送结构域是结合itga7的scfv分子。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在一些实施例中，多核苷酸，例如基因治疗载体，包含组织特异性调节元件。在一些实施例中，组织特异性调节元件包含如seqidno:8、seqidno:9或两者所示的序列。在一些实施例中，多核苷酸，例如基因治疗载体，包含seqidno:11的核酸序列。
在一个方面，本发明描述了包括包含基因的基因治疗载体的组合物，所述基因编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，所述组合物用于治疗患有酶缺乏症的患者(人或非人)、和/或用于减少人或非人受试者的组织中的糖原累积。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质的递送结构域是与内化效应物例如cd63或itga7结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，递送结构域是结合cd63的scfv分子。在一个实施例中，递送结构域是结合itga7的scfv分子。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。导致酶缺乏的临床适应症可为但不限于例如庞贝氏症或法布里病。在一些实施例中，多核苷酸，例如基因治疗载体，包含组织特异性调节元件。在一些实施例中，组织特异性调节元件包含如seqidno:8、seqidno:9或两者所示的序列。在一些实施例中，多核苷酸，例如基因治疗载体，包含seqidno:11的核酸序列。
在一个方面，本发明描述的是根据本发明的药物组合物用于制造用于治疗性应用的药物的用途，所述治疗性应用例如患有酶缺乏症的患者(人或非人)的治疗、和/或减少人或非人受试者的组织中的糖原累积。该组合物可包括例如包含基因的基因治疗载体，所述基因编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质的递送结构域是与内化效应物例如cd63或itga7结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，递送结构域是结合cd63的scfv分子。在一个实施例中，递送结构域是结合itga7的scfv分子。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗cd63-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。在另一个实施例中，基因治疗载体是包含多核苷酸的aav载体，所述多核苷酸编码抗itga7-gaa融合多结构域治疗性蛋白质。导致酶缺乏的临床适应症可为但不限于例如庞贝氏症或法布里病。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含gaa酶结构域，并且在施用基因治疗载体后，gaa的高血清水平在患者的血清中维持至少12周。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含gaa酶结构域，并且在基因治疗载体施用后3个月，患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平维持在野生型水平下。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含gaa酶结构域，并且在治疗后患者的肌肉强度恢复至野生型水平。
在一个方面，本发明提供了通过施用包含多核苷酸的基因治疗载体，来减少人或非人受试者的组织中的糖原累积的方法，所述多核苷酸编码多结构域治疗性蛋白质。在一个实施例中，组织是肝、心脏或骨骼肌。在一个实施例中，人或非人受试者患有庞贝氏症。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含抗cd63scfv-gaa融合蛋白。在另一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含抗itga7scfv-gaa融合蛋白。
在一个方面，本文描述的是减少患有酶缺乏症的患者(人或非人)中针对酶的交叉反应性免疫学材料的方法，该方法包括向患者施用包含基因的基因治疗载体，所述基因仅编码替代酶或编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一些实施例中，基因治疗载体是aav载体，其可为嵌合aav载体(例如，aav2/8)。在一些实施例中，酶结构域包含糖苷酶，例如gaa(例如，seqidno:1)或gla(例如，uniprotkb编号p06280，aa32-429，seqidno:13)，并且患者患有庞贝氏症或法布里病，并且递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一些实施例中，基因治疗载体以足够的量施用，以增加gaa的血清水平，使得交叉反应性免疫学材料减少或交叉反应性免疫学材料不以可检测的量生成。在一些实施例中，基因治疗载体以足够的量施用，以在一段时间内增加gaa的血清水平。在一些实施例中，患者被包含基因治疗载体的病毒(例如，aav)感染，任选地其中所述病毒被假型化，以特异性地靶向选自galt、肝、造血干细胞、红血细胞或其组合的组织或细胞，和/或其中所述基因治疗载体包含细胞或组织特异性增强子和/或启动子，例如肝特异性增强子(例如serpina1)和/或肝特异性启动子(例如，ttr)。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63的scfv(例如，seqidno:2)。在一些实施例中，该方法包括向患者施用与至少一种免疫抑制剂组合的如本文所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体和免疫抑制剂同时和/或序贯地施用。在一些实施例中，患者维持恒定水平的免疫抑制剂。
在一个方面，本文描述的是在患有酶缺乏症的患者(人或非人)中诱导对酶的耐受性(即，使患者对酶耐受的方法，该方法包括减少患者中的交叉反应性免疫学材料，例如，向患者施用包含基因的基因治疗载体，所述基因仅编码替代酶或编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。在一些实施例中，公开的是在患有酶缺乏症的患者中诱导对酶的耐受性的方法，该方法包括在一段时间内向患者施用包含基因的基因治疗载体，所述基因仅编码替代酶或编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质，使得不生成患者中可检测的交叉反应性免疫学材料的增加。在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。在一些实施例中，基因治疗载体是aav载体，其可为嵌合aav载体(例如，aav2/8)和/或经改造的aav载体(例如，可用于靶向例如优先地或专一地由细胞或组织(例如肝细胞或肝、粘膜组织、红血细胞、造血干细胞等)表达的受体或标记物的向性修饰的重组病毒载体)，并且任选地其中所述基因在细胞或组织特异性的增强子和/或启动子，例如肝特异性启动子等的控制下表达。在一些实施例中，酶结构域包含糖苷酶，例如gaa(例如，seqidno:1)或gla(例如，uniprotkb编号p06280，aa32-429，seqidno:13)，并且患者患有庞贝氏症或法布里病，并且递送结构域是与内化效应物结合的抗原结合蛋白。在一个实施例中，内化效应物是被胞吞且运输至溶酶体的细胞表面分子。在一个具体实施例中，内化效应物是cd63分子。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体、抗体片段或单链可变片段(scfv)，例如结合cd63的scfv(例如，seqidno:2)。在一些实施例中，治疗患有酶缺乏症的患者的方法包括向患者施用该酶的重组形式和/或同工酶(例如，患有庞贝氏症的患者中的gaa，例如scfv63::gaa、gaa、优化的gaa或其组合)，其中患者对酶是耐受的，例如其中患者已根据本文公开的方法对该酶耐受。相应地，在一些实施例中，向缺乏其的患者施用酶的方法包括例如通过施用基因治疗载体使患者对酶耐受，所述基因治疗载体编码该酶或包含该酶的多结构域治疗性蛋白质，优选以增加酶的血清水平的足够量，使得交叉反应性免疫学材料处于与不缺乏该酶的患者中发现的那种可比较的水平，任选地其中所述基因治疗载体特异性靶向肝和/或包含肝特异性增强子和/或启动子。在一些实施例中，该方法还包括在基因靶向载体施用后，进一步施用该酶和/或其重组变体，包括包含该酶的多结构域治疗性蛋白质。
在另一个方面，本发明提供了与人cd63结合的抗体及其抗原结合片段。根据本发明的这个方面的抗体尤其可用于特异性地指导酶例如gaa或gla的内化和/或溶酶体运输。像这样，本发明的这个方面还提供了双特异性抗体、其结合人cd63的抗原结合片段、以及抗体-蛋白质融合构建体(参见例如图1a)。
本发明的示例性抗cd63抗体在表11中列出。表11阐述了示例性抗cd63抗体的重链可变区(hcvr)和轻链可变区(lcvr)的氨基酸和核酸序列标识符，以及重链互补决定区(hcdr1、hcdr2和hcdr3)和轻链互补决定区(lcdr1、lcdr2和lcdr3)。
本发明提供了包含hcvr的抗体或其抗原结合片段，所述hcvr包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何hcvr氨基酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含lcvr的抗体或其抗原结合片段，所述lcvr包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何lcvr氨基酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含hcvr和lcvr氨基酸序列对(hcvr/lcvr)的抗体或其抗原结合片段，所述hcvr/lcvr包含与表11中列出的任何lcvr氨基酸序列配对的、表11中列出的任何hcvr氨基酸序列。根据某些实施例，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包括在表11中列出的任何示例性抗cd63抗体内包含的hcvr/lcvr氨基酸序列对。在某些实施例中，hcvr/lcvr氨基酸序列对选自seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54和seqidno:62/70。
本发明还提供了包含重链cdr1(hcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr1包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何hcdr1氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含重链cdr2(hcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr2包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何hcdr2氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含重链cdr3(hcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述重链cdr3包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何hcdr3氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含轻链cdr1(lcdr1)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr1包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何lcdr1氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含轻链cdr2(lcdr2)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr2包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何lcdr2氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含轻链cdr3(lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链cdr3包含的氨基酸序列选自表11中列出的任何lcdr3氨基酸序列，或者其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了包含hcdr3和lcdr3氨基酸序列对(hcdr3/lcdr3)的抗体或其抗原结合片段，所述hcdr3/lcdr3包含与表11中列出的任何lcdr3氨基酸序列配对的、表11中列出的任何hcdr3氨基酸序列。根据某些实施例，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包括在表11中列出的任何示例性抗cd63抗体内包含的hcdr3/lcdr3氨基酸序列对。在某些实施例中，hcdr3/lcdr3氨基酸序列对选自seqidno：seqidno:20/28、seqidno:36/44、seqidno:52/60和seqidno:68/76。
本发明还提供了抗体或其抗原结合片段，其包括在表11中列出的任何示例性抗cd63抗体内包含的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。在某些实施例中，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组选自seqidno:16-18-20-24-26-28、seqidno:32-34-36-40-42-44、seqidno:48-50-52-56-58-60和seqidno:64-66-68-72-74-76。
在一个相关实施例中，本发明提供了抗体或其抗原结合片段，其包括在如由表11中列出的任何示例性抗cd63抗体限定的hcvr/lcvr氨基酸序列对内包含的一组六个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3)。例如，本发明包括抗体或其抗原结合片段，其包括在选自seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54和seqidno:62/70的hcvr/lcvr氨基酸序列对内包含的hcdr1-hcdr2-hcdr3-lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组。用于鉴定在hcvr和lcvr氨基酸序列内的cdr的方法和技术是本领域众所周知的，并且可用于鉴定在本文公开的指定hcvr和/或lcvr氨基酸序列内的cdr。可用于识别cdr边界的示例性惯例包括例如kabat定义、chothia定义和abm定义。一般而言，kabat定义基于序列变异性，chothia定义基于结构环区域的位置，而abm定义是kabat和chothia方法之间的折衷方案。参见例如kabat,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,"nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)；al-lazikani等人，j.mol.biol.273:927-948(1997)；以及martin等人，proc.natl.acad.sci.usa86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的cdr序列。
本发明还提供了编码抗cd63抗体或其一部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表11中列出的任何hcvr氨基酸序列的核酸分子。在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何lcvr氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何hcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何hcdr1核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何hcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何hcdr2核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何hcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何hcdr3核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何lcdr1氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何lcdr1核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何lcdr2氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何lcdr2核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码表11中列出的任何lcdr3氨基酸序列的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何lcdr3核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。
本发明还提供了编码hcvr的核酸分子，其中所述hcvr包含一组三个cdr(即，hcdr1-hcdr2-hcdr3)，其中所述hcdr1-hcdr2-hcdr3氨基酸序列组如由表11中列出的任何示例性抗cd63抗体限定的。
本发明还提供了编码lcvr的核酸分子，其中所述lcvr包含一组三个cdr(即lcdr1-lcdr2-lcdr3)，其中所述lcdr1-lcdr2-lcdr3氨基酸序列组如由表11中列出的任何示例性抗cd63抗体限定的。
本发明还提供了编码hcvr和lcvr两者的核酸分子，其中所述hcvr包含表11中列出的任何hcvr氨基酸序列的氨基酸序列，并且其中所述lcvr包含表11中列出的任何lcvr氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施例中，核酸分子包含选自表11中列出的任何hcvr核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列，以及选自表11中列出的任何lcvr核酸序列的多核苷酸序列，或者其与之具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上相似的序列。在根据本发明的这个方面的某些实施例中，核酸分子编码hcvr和lcvr，其中所述hcvr和lcvr均源自表11中列出的相同抗cd63抗体。
本发明还提供了重组表达载体，其能够表达包含抗cd63抗体的重链或轻链可变区的多肽。例如，本发明包括重组表达载体，其包含上述任何核酸分子，即编码如表11中列出的任何hcvr、lcvr和/或cdr序列的核酸分子。在本发明的范围内还包括的是此类载体已引入其内的宿主细胞，以及通过在允许抗体或抗体片段产生的条件下培养宿主细胞，并且回收如此产生的抗体和抗体片段，来生产抗体或其一部分的方法。
在一些方面，本发明包括具有经修饰的糖基化模式的抗体或其抗原结合片段，例如抗cd63抗体。在一些实施例中，去除不期望的糖基化位点的修饰可能是有用的，或者抗体缺少寡糖链上存在的岩藻糖部分，例如以增加抗体依赖性细胞毒性(adcc)(参见shields等人(2002)jbc277:26733)，其中细胞毒性是期望的。在其它应用中，可进行半乳糖基化的修饰，以便修饰补体依赖性细胞毒性(cdc)。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含特异性结合cd63的重组人抗体或其片段和药学可接受的载体。在相关方面，本发明的特征在于组合物，其是抗cd63抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是有利地与抗cd63抗体组合的任何试剂。本文其它地方公开了涉及本发明的抗cd63抗体的另外组合疗法和共同制剂。
附图说明
图1a示意性地表示多结构域治疗性蛋白质。小图a描绘了包含双特异性抗体(ii)和替代酶(i)的多结构域治疗性蛋白质。小图b描绘了与内化效应物特异性半体(ii)结合的酶-fc融合多肽(i)，以形成多结构域治疗性蛋白质。小图c描绘了与抗内化效应物抗体的重链的c末端共价连接的替代酶(六边形)。小图d描绘了与抗内化效应物抗体的重链的n末端共价连接的替代酶(六边形)。小图e描绘了与抗内化效应物抗体的轻链的c末端共价连接的替代酶(六边形)。小图f描绘了与抗内化效应物抗体的轻链的n末端共价连接的替代酶(六边形)。小图g描绘了与包含vh区(阴影条)和vl区(空心条)的单链可变片段(scfv)的c末端共价连接的替代酶(六边形)。小图h描绘了与以下两个scfv结构域共价连接的替代酶(六边形)：(i)充当第一递送结构域的第一scfv，以及(ii)充当第二递送结构域的第二scfv。
图1b是aav基因治疗载体的非限制性例子性图示，其编码小图中表示的多结构域治疗性蛋白质，其中scfv是抗人cd63scfv，且替代酶是gaa(例如抗hcd63scfv::hgaa；参见例如如seqidno:10所示的氨基酸序列)。seqidno:10的氨基酸1-119提供了h5c6抗体的重链可变结构域(vh)的氨基酸序列；seqidno:10的氨基酸120-134提供了h5c6的重链和轻链可变结构域之间的氨基酸接头序列；seqidno:10的氨基酸135-245提供了h5c6抗体的轻链可变结构域(vl)的氨基酸序列；seqidno:10的氨基酸136-250提供了抗hcd63scfv和gaa之间的氨基酸接头序列，并且seqidno:10的氨基酸251-1133提供了gaa的氨基酸序列。示例性的5’itr和3’itr序列分别如seqidno:6和seqidno:7所示。示例性的肝特异性增强子(serpina1)如seqidno:9所示。示例性的肝特异性启动子(ttr)如seqidno:8所示。表11中提供了另外的示例性抗cd63vh和vl氨基酸序列(以及编码其的核苷酸序列)，其可用于构建包含抗cd63抗体或其抗原结合部分的多结构域治疗性蛋白质。
图2是条形图，其描绘了根据递送的酶，以微克/毫克组织表示的贮积糖原的量。x轴从左到右描绘了来自cd63hu/hu；gaa-/-小鼠的组织：心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和趾长伸肌(edl)。黑色方框(“1”)描述了未经治疗的小鼠庞贝氏症模型中的贮积糖原的量。橙色方框(“2”)描述了未处理的野生型小鼠模型中的贮积糖原的量。暗绿色方框(“3”)描绘了在用以1010vg剂量的aav-hgaa(包含编码人gaa的基因的腺相关病毒载体)处理的小鼠庞贝氏症模型中的贮积糖原的量。森林绿色方框(“4”)描述了在用以1011vg剂量的aav-hgaa处理的小鼠庞贝氏症模型中的贮积糖原的量。浅蓝色方框(“5”)描述了在用以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa(包含编码与人gaa连接的抗人cd63scfv结构域的基因的腺相关病毒载体)处理的小鼠庞贝氏症模型中的贮积糖原的量。深蓝色方框(“6”)描述了在用以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa处理的小鼠庞贝氏症模型中的贮积糖原的量。
图3是条形图，其描绘了在aav注射后3个月时，在每只小鼠的骨骼肌组织中测量的平均糖原(μg/mg)。每个测量根据gaa暴露(即血清水平)/小鼠进行绘制，所述小鼠用以特定剂量的特定酶构建体进行处理。实心正方形代表以1010vg剂量的aav-hgaa。实心金字塔代表以1011vg剂量的aav-hgaa。实心倒金字塔代表以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。实心菱形代表以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。
图4是点图，其描绘了根据gaa暴露(即血清水平)/小鼠，在aav注射后3个月时，在心脏组织中测量的平均心肌糖原(μg/mg)，所述小鼠用以特定剂量的特定酶构建体进行处理。实心正方形代表以1010vg剂量的aav-hgaa。实心金字塔代表以1011vg剂量的aav-hgaa。实心倒金字塔代表以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。实心菱形代表以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。
图5是点图，其描绘了根据gaa暴露(即血清水平)/小鼠，在aav注射后3个月时的抗gaa抗体滴度，所述小鼠用以特定剂量的特定酶构建体进行处理。空心正方形代表以1010vg剂量的aav-hgaa。空心圆圈代表以1011vg剂量的aav-hgaa。空心菱形代表以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。六边形代表以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。
图6是点图，其描绘了根据酶构建体和剂量，在aav注射后3个月时的抗gaa抗体滴度。圆圈代表接受空aav载体的对照小鼠。正方形代表以1010vg剂量的aav-hgaa。金字塔代表以1011vg剂量的aav-hgaa。倒金字塔代表以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。菱形代表以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。
图7a是线图，其描绘了在基因治疗载体注射后数周，根据时间的gaa的血清水平(任意单位“a.u.”；y轴)。正方形代表以1010vg剂量的aav-hgaa。金字塔代表以1011vg剂量的aav-hgaa。倒金字塔代表以1010vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。菱形代表以1011vg剂量的aav-抗hcd63scfv::hgaa。
图7b是条形图，其描绘了在cd63humingaako小鼠(gaa-/-,cd63hu/hu小鼠)、或gaa+/+,cd63hu/hu小鼠中施用aav构建体后的mrna比率(hgaamrna相对于mgadphmrna)，像这样：(1)未处理的对照，(2)aav-肝特异性启动子-hgaa(1e10vg)，(3)aav-肝特异性启动子-hgaa(1e11vg)，(4)aav-肝特异性启动子-抗hcd63::hgaa(1e10vg)，(5)aav-肝特异性启动子-抗hcd63::hgaa(1e11vg)，或(6)未处理的对照(gaa+/+,cd63hu/hu)。对于所有注射的aav构建体，检测到gaa的肝表达。
图7c是方块图，其对于接受编码融合蛋白的aav(正方形)的小鼠和接受编码gaa的aav的小鼠，比较了血清gaa水平与gaa的rna表达水平(两种构建体均提供了肝特异性启动子(lsp)，以驱动表达)。
图7d是条形图，其显示了用编码hgaa的肝特异性启动子驱动的构建体、抗hcd63scfv::gaa(融合构建体)、或非结合融合构建体scfv::gaa对照瞬时转染的huh-7人肝细胞。在转染后3天，两个scfv::gaa融合构建体在分泌的上清液中均具有高于单独的hgaa的蛋白质比率。在实验期间向上清液中添加m6p以减轻ci-mpr介导的摄取并不影响该比率。(*＝p<0.05，n＝3)。
图8是荧光显微照片，其描绘了用dapi复染以揭示核的小鼠肌肉纤维中lamp1染色的溶酶体。小图a和a1描绘了源自未处理的野生型(gaa+/+)小鼠，并且就lamp1(小图a)和核(小图a1)染色的四头肌细胞。小图b和b1描绘了源自未处理的gaa无效(gaa-/-)小鼠，并且就lamp1(小图b)和核(小图b1)染色的四头肌细胞。小图c和c1描绘了源自用aav-hgaa构建体处理的gaa-/-小鼠，并且就lamp1(小图c)和核(小图c1)染色的四头肌细胞。小图d和d1描绘了源自用aav-hcd63scfv::hgaa构建体处理的gaa-/-小鼠，并且就lamp1(小图d)和核(小图d1)染色的四头肌细胞。
图9描绘了线图，其显示了用aav-lsphgaa或aav-lsp抗hcd63::hgaa处理的小鼠的握力和rotarod测试性能。野生型gaa小鼠(倒三角形)、未处理的对照(正方形)、aav-lsp-hgaa处理(1e11vg/小鼠)(三角形)、或aav-lsp-a抗hcd63::hgaa处理(1e11vg/小鼠)(圆圈)的rotarod测量(a)和前肢握力测量(b)以每月间隔进行6个月。误差条为+/-sd。对于所有组n＝8-10。
图10a和图10b描绘了使用其它膜蛋白作为向导，例如抗itga7(整联蛋白α-7)scfv融合蛋白来引导gaa。图10a显示了连同或不连同5mmm6p的存在，与抗小鼠cd63-gaa或抗小鼠itga7-gaa一起温育过夜的c2c12小鼠成肌细胞的gaa活性(y轴)。图10b显示了对于cd63人源化的gaako小鼠(gaa-/-；cd63hu/hu)，所述小鼠通过流体动力学递送(hdd)给予编码抗hcd63::gaa的scfv::gaa形式(2)、或抗小鼠整联蛋白α-7的全长igg4::gaa形式(3)的质粒，然后在hdd后3周测量组织糖原水平。还测试了未处理的对照小鼠gaa-/-；cd63hu/hu(1)和未处理的野生型gaa对照小鼠gaa+/+；cd63hu/hu(4)在相同组织中的糖原水平。
图11是点图，其描绘了根据酶构建体和剂量，在aav注射后一个月时的gaa的血清水平(任意单位“a.u.”；y轴)。正方形代表aav-lsp-δ8gaa。金字塔代表aav-抗hcd63scfv::gaa。两种构建体均提供了肝特异性启动子(lsp)以驱动表达。剂量作为每千克(kg)小鼠的病毒基因组(vg)提供。
图12提供了斑点印迹，其描绘了根据gaa血清水平，以微克/毫克组织(心脏、四头肌、膈肌或三头肌)表示的糖原水平。正方形代表aav-lsp-δ8gaa。金字塔代表aav-抗hcd63scfv::gaa。两种构建体均提供了肝特异性启动子(lsp)以驱动表达。
具体实施方式
本发明并不限于所述的特定实施例、组合物、方法和实验条件，因为这样的实施例、组合物、方法和条件可变化。本文使用的术语仅为了描述特定实施例的目的，而不预期是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
尽管现在描述一些优选的方法和材料，但与本文所述那些相似或等价的任何方法和材料都可用于本发明的实践或测试中。本文引用的所有出版物都以引用的方式并入本文以全文描述。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
“酶缺陷疾病”包括非溶酶体贮积病，例如克拉伯病(半乳糖基神经酰胺酶)、苯酮酸尿症、半乳糖血症、枫糖浆尿病、线粒体病症、弗里德赖希共济失调、zellweger综合征、肾上腺脑白质营养不良、威尔逊病、血色素沉着病、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症、甲基丙二酸血症、丙酸血症和溶酶体贮积病。“溶酶体贮积病”包括来源于溶酶体功能缺陷的任何病症。目前，已鉴定了大约50种溶酶体贮积病，其中最众所周知的包括tay-sachs、戈谢病和尼曼-皮克病。这些疾病的发病机制归于溶酶体中不完全降解产物的累积，通常是由于蛋白质功能的丧失。溶酶体贮积病由其正常功能是降解或协调溶酶体内容物降解的蛋白质中的功能丧失或减弱变体引起。与溶酶体贮积病有关联的蛋白包括酶、受体和其它跨膜蛋白(例如npc1)、翻译后修饰蛋白(例如硫酸酯酶)、膜转运蛋白以及非酶促辅因子和其它可溶性蛋白质(例如gm2神经节苷脂激活因子)。因此，溶酶体贮积病涵盖超过由缺陷酶本身引起的那些病症，还包括由任何分子缺陷引起的任何病症。因此，如本文使用的，术语“酶”意欲涵盖与溶酶体贮积病相关的那些其它蛋白质。
在很多情况下，分子损伤的性质影响疾病的严重程度，即完全丧失功能趋于与出生前或新生儿发作相关，并且涉及严重症状；部分功能丧失与更轻度(相对)和晚发型疾病相关。一般地，仅需要恢复小百分比的活性，以纠正缺陷细胞中的代谢缺陷。表1列出了一些较常见的溶酶体贮积病及其相关的功能丧失蛋白。溶酶体贮积病通常描述在desnick和schuchman，2012中。
溶酶体贮积病可根据在缺陷溶酶体内累积的产物类型进行分类。鞘脂类代谢障碍是影响鞘脂类代谢的一类疾病，所述鞘脂是含有与脂肪族氨基醇连接的脂肪酸的脂质(在s.hakomori,“glycosphingolipidsincellularinteraction,differentiation,andoncogenesis,”50annualreviewofbiochemistry733-764，1981年7月中综述)。鞘脂类代谢障碍的累积产物包括神经节苷脂(例如tay-sachs病)、糖脂(例如法布里病)和葡糖脑苷脂(例如戈谢病)。
粘多糖贮积症是影响糖胺聚糖(gags或粘多糖)代谢的一组疾病，所述糖胺聚糖是帮助构建骨、软骨、腱、角膜、皮肤和结缔组织的重复二糖的长非分支链(在j.muenzer,“earlyinitiationofenzymereplacementtherapyforthemucopolysaccharidoses,”111(2)mol.genet.metab.63-72(2014年2月)；sasisekharan等人，“glycomicsapproachtostructure-functionrelationshipsofglycosaminoglycans,”8(1)ann.rev.biomed.eng.181-231(2014年12月)中综述)。粘多糖的累积产物包括硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、各种形式的硫酸软骨素和透明质酸。例如，莫奎欧综合征a是由于溶酶体酶半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶中的缺陷，其导致硫酸角蛋白和6硫酸软骨素的溶酶体累积。
糖原贮积病(又名糖原累积病)来源于细胞代谢(产生或分解)糖原的无能。糖原代谢由各种酶或其它蛋白质调节，包括葡萄糖-6-磷酸酶、酸性α-葡糖苷酶、糖原脱支酶、糖原分支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖转运蛋白、醛缩酶a、β-烯醇酶和糖原合酶。示例性的溶酶体贮积病/糖原贮积病是庞贝氏症，其中缺陷型酸性α-葡糖苷酶引起糖原在溶酶体中累积。症状包括肝肿大、肌无力、心力衰竭，并且在婴儿变体的情况下，到2岁时的死亡(参见dimauro和spiegel，“progressandproblemsinmuscleglycogenosis,”30(2)actamyol.96-102(2011年10月))。
“多结构域治疗性蛋白质”包括(i)包含多于一个功能结构域的单个蛋白质，(ii)包含多于一条多肽链的蛋白质，以及(iii)多于一种蛋白质或多于一种多肽的混合物。术语多肽一般视为意指经由肽键连接在一起的单链氨基酸。术语蛋白质涵盖术语多肽，但还包括更复杂的结构。即，单个多肽是蛋白质，并且蛋白质可含有以更高级结构结合的一种或多种多肽。例如，血红蛋白是含有四种多肽的蛋白质：两种α珠蛋白多肽和两种β珠蛋白多肽。肌红蛋白也是蛋白质，但它仅含有单一肌红蛋白多肽。
多结构域治疗性蛋白质包含一种或多种多肽以及提供两种功能的至少两个结构域。这些结构域之一是“酶结构域”，其提供了与酶缺乏症相关的缺陷型蛋白质活性的替代。这些结构域中的另一个是“递送结构域”，其提供了与内化效应物的结合。因此，提供酶替代活性和结合内在效应物(又名内在效应物结合蛋白(递送结构域活性)的能力的单一多肽是多结构域治疗性蛋白质。另外，其中一种蛋白质提供了酶功能，并且另一种蛋白质提供了内化效应物结合活性的蛋白质混合物是多结构域治疗性蛋白质。图1a描绘了多结构域治疗性蛋白质的各种示例。在一个例子中(图1a，小图a)，多结构域治疗性蛋白质包含酶(由六边形表示)，以及结合酶(虚线)和内部效应物(实线)的双特异性抗体(ie-bp)。在此处，双特异性抗体的一个臂与酶非共价结合，而另一臂与内化效应物非共价结合，从而致使替代酶内化到细胞或亚细胞区室内。在另一个例子中(小图b)，多结构域治疗性蛋白质包括包含两种多肽的单个蛋白质，一种多肽具有酶功能，并且另一种多肽具有递送结构域功能。在此处，该酶融合至免疫球蛋白fc结构域或重链恒定区，其与酶半抗体的fc结构域结合，以形成双功能多结构域治疗性蛋白质。小图b中描绘的实施例类似于小图a中的实施例，不同之处在于该酶共价附着至半抗体之一，而不是通过在半抗体的免疫球蛋白可变结构域处的抗原-抗体相互作用。
在其它例子中，多结构域治疗性蛋白质由共价连接(直接或间接通过接头)至递送结构域的酶组成。在一个实施例中，该酶附着至免疫球蛋白分子的c末端(例如，重链或可替代地轻链)。在另一个实施例中，该酶附着至免疫球蛋白分子的n末端(例如，重链或可替代地轻链)。在这些例子中，免疫球蛋白分子是递送结构域。在另外一个实施例中，该酶附着至结合内化效应物的scfv分子的c末端。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含两个递送结构域。在一个实施例中，第一递送结构域与溶酶体运输分子或其它内化效应物(例如，cd63)结合。在另一个实施例中，第二递送结构域与转胞吞作用效应物结合，以促进多结构域治疗性蛋白质的跨细胞运输。在一个实施例中，转胞吞作用效应物尤其是ldl受体、iga受体、转铁蛋白受体或新生儿fc受体(fcrn)。在一个具体实施例中，转胞吞作用递送结构域包含与转铁蛋白受体结合的分子，例如抗转铁蛋白受体抗体或抗转铁蛋白受体scfv分子。关于介导可用于本发明实践的转胞吞作用的细胞表面受体，tuma和hubbard，“transcytosis:crossingcellularbarriers,”physiologicalreviews,83(3):871-935(2003年7月1日)以引用的方式并入本文。
“酶结构域”或“酶”指示与酶缺乏症的病因或生理效应相关的任何蛋白质。酶包括实际的酶、转运蛋白、受体或其它蛋白质，其是有缺陷的并且归因于引起疾病的分子损伤。酶还包括可提供相似或足够的生化或生理活性来替代或绕过疾病的分子损伤的任何蛋白质。例如，“同工酶”可用作酶。溶酶体贮积病有关的蛋白质的实例包括表1中作为“涉及的酶/蛋白质”列出的那些蛋白质，以及任何已知或以后发现的蛋白质或其它分子，其绕过酶缺乏症的分子缺陷。
在一些实施例中，该酶是水解酶，包括酯酶、糖基化酶、作用于醚键的水解酶、肽酶、线性酰胺酶、二磷酸酶、酮水解酶、卤化酶、磷酰胺酶、磺基水解酶、硫苷酶(sulfinase)、脱硫酶等等。在一些实施例中，该酶是糖基化酶，包括糖苷酶和n-糖基化酶。在一些实施例中，该酶是糖苷酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶、纤维素、内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶、菊粉酶、内切-1,4-β-木聚糖酶、内切-1,4-b-木聚糖酶、葡聚糖酶、几丁质酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、外切-α-唾液酸酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、α,α-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、木聚糖内切-1,3-β-木糖苷酶、淀粉-α-1,6-葡糖苷酶、透明质酸葡糖胺酶、透明质酸葡萄糖醛酸酶等等。
在其中分子缺陷是α-葡糖苷酶活性中的缺陷的庞贝氏症的情况下，酶包括人α-葡糖苷酶和“同工酶”，例如其它α-葡糖苷酶、经改造的重组α-葡糖苷酶、其它葡糖苷酶、重组葡糖苷酶、经改造为水解末端非还原性1-4连接的α-葡萄糖残基以释放单个α-葡萄糖分子的任何蛋白质、任何ec3.2.1.20酶、用于糖原或淀粉的天然或重组的低ph碳水化合物水解酶、以及葡糖基水解酶，例如蔗糖酶异麦芽糖酶、麦芽糖酶葡糖淀粉酶、葡糖苷酶ii和中性α-葡糖苷酶。
“内化效应物”包括能够被内化到细胞内或以其它方式参与或促成逆行膜运输的蛋白质。在一些情况下，内化效应物是经历转胞吞作用的蛋白质；即，蛋白质在细胞的一侧上被内化并且转运到细胞的另一侧(例如，顶端至基底)。在许多实施例中，内化效应蛋白是细胞表面表达的蛋白质或可溶性细胞外蛋白质。然而，本发明还考虑了其中内化效应蛋白在细胞内区室内表达的实施例，所述细胞室内区例如内体、内质网、高尔基体、溶酶体等。例如，涉及逆行膜运输(例如，从早期/再循环内体到反面高尔基体网络的途径)的蛋白质可充当本发明的各种实施例中的内化效应蛋白。无论如何，递送结构域与内化效应蛋白的结合导致整个多结构域治疗性蛋白质以及与之结合的任何分子(例如酶)也变得内化到细胞内。如下文解释的，内化效应蛋白包括直接内化到细胞内的蛋白质，以及间接内化到细胞内的蛋白质。
直接内化到细胞内的内化效应蛋白包括具有至少一个细胞外结构域的膜结合分子(例如跨膜蛋白、gpi锚定蛋白等)，所述膜相关分子经历细胞内化，并且优选经由细胞内降解和/或再循环途径加工。直接内化到细胞内的内化效应蛋白的具体非限制性例子包括例如cd63、mhc-i(例如hla-b27)、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl受体、ldl相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、apelin受体(aplnr)、mal(髓磷脂和淋巴细胞蛋白，又名vip17)、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体(例如scara1-5、scarb1-3、cd36)等等。
在某些实施例中，内化效应物是促乳素受体(prlr)。发现prlr不仅是某些治疗应用的靶，基于其高内化率和周转率，还是有效的内化效应蛋白。例如，w02015/026907中示出了prlr作为内化效应蛋白的潜力，其中尤其证实了抗prlr抗体在体外被prlr表达细胞有效内化。
在某些实施例中，内化效应物是肾脏特异性内化剂(internalizer)，例如cdh16(cadheri-16)、cldn16(claudn-16)、kl(klotho)、pth1r(甲状旁腺激素受体)、slc22a13(溶质载体家族22成员13)、slc5a2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)和umod(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，例如bmpr1a(骨形态发生蛋白受体1a)、m-钙粘蛋白、cd9、musk(肌肉特异性激酶)、lgr4/gpr48(g蛋白偶联受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、cdh15(cadheri-15)、itga7(整联蛋白α-7)、cacng1(l型钙通道亚基γ-1)、cacnals(l型钙通道亚基α-15)、cacng6(l型钙通道亚基γ-6)、scn1b(钠通道亚基β-1)、chrna1(ach受体亚基α)、chrnd(ach受体亚基δ)、lrrc14b(富含亮氨酸重复的蛋白质14b)、肌营养不良蛋白聚糖(dag1)和popdc3(含popeye结构域的蛋白质3)。在一些具体实施例中，内化效应物是itga7、cd9、cd63、alpl2、asgr1、asgr2或prlr。
在其中内化效应物(ie)直接内化到细胞内的那些实施例中，递送结构域可为例如特异性结合ie的抗体或抗体的抗原结合片段，或者与ie特异性相互作用的配体或配体的一部分。例如，如果ie是kremen-1或kremen-2，则递送结构域可包含下述或由下述组成：kremen配体(例如dkk1)或其kremen结合部分。作为另一个例子，如果ie是受体分子例如asgr1，则递送结构域可包含以下或由以下组成：对于受体特异性的配体(例如，脱唾液酸血清类粘蛋白[asor]或β-ga1nac)或其受体结合部分。
间接内化到细胞内的内化效应蛋白包括这样的蛋白质和多肽，其自身并不内化，但在与直接内化到细胞内的第二蛋白质或多肽结合或以其它方式相关联后，变得内化到细胞内。间接内化到细胞内的蛋白质包括例如能够与内化性细胞表面表达受体分子结合的可溶性配体。经由其与内化性细胞表面表达受体分子的相互作用(间接)内化到细胞内的可溶性配体的非限制性例子是转铁蛋白。在其中ie是转铁蛋白(或另一种间接内化的蛋白质)的实施例中，递送结构域与ie的结合以及ie与转铁蛋白受体(或另一种内化性细胞表面表达受体分子)的相互作用，导致整个递送结构域以及与其相关的任何分子(例如酶)，与ie及其结合配偶体的内化同时变得内化到细胞内。
在其中ie间接内化到细胞内的那些实施例中，递送结构域可为例如抗体、抗体的抗原结合片段、或特异性结合ie的scfv、或者与可溶性效应蛋白特异性相互作用的受体或受体的一部分。例如，如果ie是细胞因子，则递送结构域可包含下述或由下述组成：相应的细胞因子受体或其配体结合部分。
示例性的ie是cd63，其是跨越细胞膜四次的细胞表面蛋白的四次跨膜蛋白超家族的成员。cd63在实际上所有组织中表达，并且被认为涉及形成和稳定化信号传导复合物。cd63定位于细胞膜、溶酶体膜和次级内体膜。已知cd63与整联蛋白结合并且可涉及上皮-间充质转化。参见h.maecker等人，“thetetraspaninsuperfamily:molecularfacilitators,”11(6)fasebj.428-42，1997年5月；以及m.metzelaar等人，“cd63antigen.anovellysosomalmembraneglycoprotein,clonedbyascreeningprocedureforintracellularantigensineukaryoticcells,”266j.biol.chem.3239-3245,1991。
另一个示例性的ie是淀粉样β(a4)前体样蛋白2(“aplp2”)，其是app(淀粉样前体蛋白)家族的遍在表达的成员。aplp2是已知与主要组织相容性复合体(mhc)i类分子(例如kd)相互作用的膜结合蛋白。它在细胞表面处结合kd，并且紧随其后以网格蛋白依赖性方式与kd一起内化。参见tuli等人，“mechanismforamyloidprecursor-likeprotein2enhancementofmajorhistocompatibilitycomplexclassimoleculedegradation,”284thejournalofbiologicalchemistry34296-34307(2009)。
另一个ie示例是促乳素受体(prlr)。促乳素受体是i型细胞因子受体家族的成员，并且在配体结合和后续二聚化后激活“酪氨酸激酶jak2、fyn和tec，磷酸酶shp-2，鸟嘌呤核苷酸交换因子vav和信号传导抑制因子socs”(参见clevenger和kline,“prolactinreceptorsignaltransduction,”10(10)lupus706-18(2001)，摘要)。促乳素受体经历内吞再循环并且可在溶酶体级分中发现。参见genty等人，“endocytosisanddegradationofprolactinanditsreceptorinchinesehamsterovarycellsstablytransfectedwithprolactinreceptorcdna,”99(2)mol.cellendocrinol.221-8(1994)；以及ferland等人，“theeffectofchloroquineonlysosomalprolactinreceptorsinratliver,”115(5)endocrinology1842-9(1984)。
如本文使用的，“免疫反应”一般意指患者对外部或‘非自身’蛋白质的免疫应答。这种免疫应答包括变态反应和干扰替代酶效力的抗体的发展。一些患者可能不产生任何无功能的蛋白质，因此致使替代酶成为“外来”蛋白质。例如，对缺乏gla的那些法布里病患者重复注射重组gla(rgla)频繁导致变态反应。在其它患者中，针对rgla的抗体的产生已显示降低替代酶在治疗疾病中的有效性。参见例如tajima等人(“useofamodifiedα-n-acetylgalactosaminidase(naga)inthedevelopmentofenzymereplacementtherapyforfabrydisease,”85(5)am.j.hum.genet.569-580(2009))，其讨论了经修饰的naga作为替代gla的“同工酶”的用途。经修饰的naga与gla没有免疫交叉反应性，并且“不与来自用重组gla重复治疗的法布里病患者的血清反应”。同上，摘要。
“免疫抑制剂”包括导致一般的免疫抑制的药物和/或蛋白质，并且可分别用于预防庞贝氏症或法布里病患者中针对替代酶(例如gaa或gla)的交叉反应性免疫学材料(crim)。免疫抑制剂的非限制性例子包括氨甲蝶呤、霉酚酸酯、环磷酰胺、雷帕霉素dna烷化剂、抗cd20抗体、抗baff抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体及其任何组合。
对组织例如肝特异性的调节元件，例如启动子，在该调节元件对于其特异性的组织中，处于此类调节元件的控制下，增强核酸序列例如基因的表达。肝特异性调节元件，例如肝特异性启动子的非限制性例子，可在chuah等人(2014)mol.ther.22:1605-13中找到。
术语“蛋白质”意指具有经由酰胺键共价连接的超过约20个氨基酸的任何氨基酸聚合物。蛋白质含有一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中一般称为“多肽”。因此，多肽可为蛋白质，并且蛋白质可含有多重多肽以形成单一功能性生物分子。二硫桥(即在半胱氨酸残基之间以形成胱氨酸)可存在于一些蛋白质中。这些共价键可在单个多肽链内，或在两个个别多肽链之间。例如，二硫桥对于胰岛素、免疫球蛋白、鱼精蛋白等等的适当结构和功能是必需的。关于二硫键形成的最近综述，参见oka和bulleid，“formingdisulfidesintheendoplasmicreticulum,”1833(11)biochimbiophysacta2425-9(2013)。
如本文使用的，“蛋白质”包括生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法中的重组蛋白质、陷阱蛋白质和其它fc-融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、scfv融合蛋白、细胞因子、趋化因子、肽激素等等。可使用基于重组细胞的生产系统如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母属物种(pichiasp.))、哺乳动物系统(例如cho细胞和cho衍生物如cho-k1细胞)来产生蛋白质。关于讨论生物治疗性蛋白质及其产生的最近综述，参见ghaderi等人，“productionplatformsforbiotherapeuticglycoproteins.occurrence,impact,andchallengesofnon-humansialylation,”28biotechnolgenetengrev.147-75(2012)。
如本文使用的，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重链(h)和两条轻链(l))的免疫球蛋白分子。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域cl。vh和vl区还可细分成称为互补决定区(cdr)的高变区，其间插有称为构架区(fr)的更保守的区。每个vh和vl由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr的组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4(重链cdr可缩写为hcdr1、hcdr2和hcdr3；轻链cdr可缩写为lcdr1、lcdr2和lcdr3。术语“高亲和力”抗体指对于其靶具有至少10-9m、至少10-10m；至少10-11m；或至少10-12m的结合亲和力的那些抗体，如通过表面等离振子共振例如biacoretm或溶液亲和elisa测量的。术语“抗体”可涵盖任何类型的抗体，例如单克隆或多克隆抗体。此外，抗体可为或来自任何来源，例如哺乳动物或非哺乳动物。在一个实施例中，抗体可为哺乳动物或禽类。在一个进一步实施例中，抗体可为或人来源，并且还可为人单克隆抗体。
短语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或更多个表位的抗体。双特异性抗体一般包含两条不同的重链，其中每条重链特异性结合不同表位—或在两个不同分子(例如抗原)上或在相同分子上(例如在相同抗原上)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对于第一表位的亲和力一般比第一重链对于第二表位的亲和力低至少一个到两个或三个或四个数量级，并且反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可在相同或不同的靶上(例如在相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可例如通过组合识别相同抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别相同抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且这样的序列可在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。通常的双特异性抗体具有两条重链以及免疫球蛋白轻链，所述两条重链各自具有三个重链cdr，随后为(n末端至c末端)ch1结构域、铰链、ch2结构域和ch3结构域，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性，但可与每条重链结合，或者可与每条重链结合并且可结合由重链抗原结合区结合的一个或多个表位，或者可与每条重链结合并且使得重链之一或两者能够与一个或两个表位结合。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任何生物的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括重链可变结构域。除非另有说明，否则重链可变结构域包括三个重链cdr和四个fr区。重链片段包括cdr、cdr和fr及其组合。通常的重链在可变结构域之后具有(从n末端到c末端)ch1结构域、铰链、ch2结构域和ch3结构域。重链的功能片段包括能够特异性识别抗原的片段(例如，以在微摩尔、纳摩尔或皮摩尔范围内的kd识别抗原)，其能够由细胞表达且分泌，并且包含至少一个cdr。
短语“轻链”包括来自任何生物的免疫球蛋白轻链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包括人κ和λ轻链。除非另有说明，否则轻链可变(vl)结构域通常包括三个轻链cdr和四个构架(fr)区。一般地，全长轻链从氨基末端到羧基末端包括包含fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4的vl结构域和轻链恒定结构域。可用于本发明的轻链包括例如不选择性结合由抗原结合蛋白选择性结合的第一抗原或第二抗原的那些。合适的轻链包括可通过在现有抗体文库(湿文库或在计算机芯片上)中筛选最常用的轻链来鉴定的那些，其中所述轻链基本上不干扰抗原结合蛋白的抗原结合结构域的亲和力和/或选择性。合适的轻链包括可结合被抗原结合蛋白的抗原结合区结合的一个或两个表位的那些。
短语“可变结构域”包括免疫球蛋白轻链或重链(根据需要进行修饰)的氨基酸序列，其从n末端到c末端序贯包含下述氨基酸区(除非另有说明)：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。“可变结构域”包括能够折叠成具有双重β片层结构的经典结构域(vh或vl)的氨基酸序列，其中β片层通过第一β片层和第二β片层的残基之间的二硫键连接。
短语“互补决定区”或术语“cdr”包括由生物的免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，其通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或t细胞受体)的轻链或重链的可变区中的两个构架区之间。cdr可由例如种系序列或者重排或未重排序列，以及例如天然或成熟的b细胞或t细胞编码。在一些情况下(例如对于cdr3)，cdr可由两个或更多个序列(例如，种系序列)编码，所述两个或更多个序列是不邻接的(例如，未重排的核酸序列中)，但在b细胞核酸序列中是邻接的，例如由于剪接或连接序列(例如，v-d-j重组以形成重链cdr3)。
术语“抗体片段”指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。在术语“抗体片段”内涵盖的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含通过在铰链区处的二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)由vh结构域组成的dab片段(ward等人(1989)nature241:544-546)，(vi)经分离的cdr，以及(vii)scfv，其由fv片段的两个结构域vl和vh组成，所述两个结构域vl和vh通过合成接头连接以形成单条蛋白质链，其中vl和vh区配对以形成单价分子。其它形式的单链抗体例如双抗体也涵盖在术语“抗体”下(参见例如holliger等人(1993)pnasusa90:6444-6448；poljak等人(1994)structure2:1121-1123)。
短语“含fc的蛋白质”包括抗体、双特异性抗体、免疫粘附素和其它结合蛋白，其包含免疫球蛋白ch2和ch3区的至少一个功能部分。“功能部分”指可结合fc受体(例如fcγr；或fcrn，即新生儿fc受体)和/或可参与补体活化的ch2和ch3区。如果ch2和ch3区含有致使其不能与任何fc受体结合并且也不能激活补体的缺失、置换和/或插入或其它修饰，则ch2和ch3区是无功能的。
含fc的蛋白质可包含免疫球蛋白结构域中的修饰，包括影响结合蛋白的一种或多种效应子功能的修饰(例如影响fcγr结合、fcrn结合和因此的半衰期和/或cdc活性的修饰)。参考免疫球蛋白恒定区的eu编号，此类修饰包括但不限于下述修饰及其组合：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
例如，但不作为限制，结合蛋白是含fc的蛋白质，并且显示出增强的血清半衰期(与没有所述修饰的相同的含fc的蛋白质相比)，并且具有位置250(例如e或q)；250和428(例如l或f)；252(例如l/y/f/w或t)、254(例如s或t)和256(例如s/r/q/e/d或t)处的修饰；或在428和/或433(例如l/r/si/p/q或k)和/或434(例如h/f或y)处的修饰；或在250和/或428处的修饰；或在307或308(例如308f、v308f)和434处的修饰。在另一个例子中，修饰可包括428l(例如m428l)和434s(例如n434s)修饰；428l、2591(例如v259i)和308f(例如v308f)修饰；433k(例如h433k)和434(例如434y)修饰；252、254和256(例如252y、254t和256e)修饰；250q和428l修饰(例如t250q和m428l)；307和/或308修饰(例如308f或308p)。
如本文使用的，术语“抗原结合蛋白”指特异性识别抗原上的表位的多肽或蛋白质(在功能单元中复合的一种或多种多肽)，所述抗原例如细胞特异性抗原和/或本发明的靶抗原。抗原结合蛋白可为多特异性的。关于抗原结合蛋白的术语“多特异性”意指蛋白质识别不管是在相同的抗原上还是在不同的抗原上的不同表位。本发明的多特异性抗原结合蛋白可为单个多功能多肽，或者它可为彼此共价或非共价结合的两个或更多个多肽的多聚复合物。术语“抗原结合蛋白”包括可与另一种功能分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达的本发明的抗体或其片段。例如，抗体或其片段可与一个或多个其它分子实体例如蛋白质或其片段功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。
如本文使用的，术语“表位”指被多特异性抗原结合多肽识别的抗原的一部分。单个抗原(例如抗原性多肽)可具有超过一个表位。表位可被定义为结构或功能的。功能表位一般是结构表位的子集，并且定义为直接促成抗原结合多肽与抗原之间相互作用的亲和力的那些残基。表位也可为构象的，即由非线性氨基酸组成。在某些实施例中，表位可包括决定簇，所述决定簇是分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。由邻接氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。
术语“结构域”指具有特定功能或结构的蛋白质或多肽的任何部分。优选地，本发明的结构域结合细胞特异性抗原或靶抗原。如本文使用的，细胞特异性抗原或靶抗原结合结构域等等包括任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或遗传改造的特异性结合抗原的多肽或糖蛋白。
可互换使用的术语“半体”或“半抗体”指抗体的一半，其基本上含有一条重链和一条轻链。抗体重链可形成二聚体，因此一个半体的重链可与和不同分子(例如另一个半体)或另一个含fc多肽结合的重链结合。两个略微不同的fc-结构域可“异源二聚化”，如在双特异性抗体或其它异源二聚体、-三聚体、-四聚体等等的形成中。参见vincent和murini，“currentstrategiesinantibodyengineering:fcengineeringandph-dependentantigenbinding,bispecificantibodiesandantibodydrugconjugates,”7biotechnol.j.1444-1450(20912)；以及shimamoto等人，“peptibodies:aflexiblealternativeformattoantibodies,”4(5)mabs586-91(2012)。
在一个实施例中，半体可变结构域特异性识别内化效应物，并且半体fc-结构域与包含替代酶(例如肽体)的fc-融合蛋白二聚化，同上，586。
术语“单链可变片段”或“scfv”包括含有免疫球蛋白重链可变区(vh)和免疫球蛋白轻链可变区(vl)的单链融合多肽。在一些实施例中，vh和vl通过10至25个氨基酸的接头序列连接。scfv多肽还可包括其它氨基酸序列，例如cl或ch1区。scfv分子可通过噬菌体展示来制造，或可通过直接从杂交瘤或b细胞亚克隆重链和轻链来制备。关于通过噬菌体展示和抗体结构域克隆制备scfv片段的方法，ahmad等人，clinicalanddevelopmentalimmunology，第2012卷，文章id98025，以引用的方式并入本文。
“α-葡糖苷酶(alpha-glucosidase)”(或“α-葡糖苷酶(α-glucosidase)”)、“α-葡糖苷酶活性”、“gaa”和“gaa活性”可互换使用，并且指促进糖原和淀粉的1,4-α键水解成葡萄糖的任何蛋白质。gaa尤其还称为ec3.2.1.20、麦芽糖酶、葡糖转化酶、葡糖苷蔗糖酶、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、α-吡喃葡糖苷酶、葡糖苷转化酶、α-d-葡糖苷酶、α-葡糖苷水解酶、α-1,4-葡糖苷酶和α-d-葡糖苷葡糖水解酶。gaa可在溶酶体中和小肠的刷状缘处发现。患有庞贝氏症的患者缺乏功能性溶酶体α-葡糖苷酶。参见s.chiba,“molecularmechanisminalpha-glucosidaseandglucoamylase,”61(8)biosci.biotechnol.biochem.1233-9(1997)；以及hesselink等人，“lysosomaldysfunctioninmusclewithspecialreferencetoglycogenstoragediseasetypeii,”1637(2)biochim.biophys.acta.164-70(2003)。
“α-半乳糖苷酶a(alpha-galactosidasea)”(或“α-半乳糖苷酶a(α-galactosidasea)”)、“α-半乳糖苷酶a活性”、“α-半乳糖苷酶”、“α-半乳糖苷酶活性”、“gla”和“gla活性”是可互换使用，并且指促进来自糖脂和糖蛋白的末端α-半乳糖基部分水解，且还水解α-d-岩藻糖苷的任何蛋白质。gla尤其也称为ec3.2.1.22、蜜二糖酶、α-d-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶a、α-半乳糖苷半乳糖水解酶、α-d-半乳糖苷半乳糖水解酶。gla是由x连锁gla基因编码的溶酶体酶。gla中的缺陷可导致法布里病，其中称为球形三脂酰基鞘氨醇(又名gb3、gl-3或三己糖苷神经酰胺)的糖脂在血管内累积(即显著的血管病变)，导致肾、心脏、皮肤和/或脑血管组织及其它组织和器官的疼痛和功能受损。参见例如prabakaran等人“mannose6-phosphatereceptorandsortilinmediatedendocytosisofα-galactosidaseainkidneyendothelialcells,”7(6)plosonee39975第1-9页(2012)。
在一个方面，本发明提供了通过向患者施用“多结构域治疗性蛋白质”，来治疗患有溶酶体贮积病的患者(或受试者)的方法。多结构域治疗性蛋白质进入患者的细胞，并且向溶酶体中递送酶或酶促活性(即“替代酶”)，所述酶或酶促活性替代与lsd相关的酶(即“内源酶”)或酶促活性。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质经由基因治疗载体递送至患者，所述基因治疗载体含有编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸。
lsd包括鞘脂类代谢障碍、粘多糖贮积病和糖原贮积病。在一些实施例中，lsd是法布里病、i型戈谢病、ii型戈谢病、iii型戈谢病、a型尼曼-皮克病、b型尼曼-皮克病、gm1-神经节苷脂贮积症、桑德霍夫病、tay-sachs病、gm2-激活因子缺乏症、gm3-神经节苷脂贮积症、异染性脑白质营养不良、鞘脂激活因子缺乏症、scheie病、hurler-sceie病、hurler病、hunter病、sanfilippoa、sanfilippob、sanfilippoc、sanfilippod、莫奎欧综合征a、莫奎欧综合征b、maroteaux-lamy病、sly病、mpsix和庞贝氏症。在一个具体实施例中，lsd是法布里病。在另一个实施例中，lsd是庞贝氏症。
在一些实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含(a)替代酶，以及(b)结合内化效应物(递送结构域)的分子实体。在一些情况下，在一些情况下，替代酶是以下中的任何一种或多种：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鞘脂激活蛋白c激活因子、神经酰胺酶、鞘磷脂酶、β-氨基己糖苷酶、gm2激活因子、gm3合酶、芳基硫酸酯酶、鞘脂激活因子、α-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸酶-2-硫酸酯酶、肝素n-硫酸酯酶、n-乙酰-α-氨基葡糖苷酶、α-葡糖酰胺n-乙酰转移酶、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶和透明质酸酶。
在一些情况下，患者无法制备足够的蛋白质，使得替代酶被患者识别为“非自身的”，并且免疫反应在施用替代酶后跟着发生。这是不期望的。因此，在一些实施例中，以避免在受试者中诱导免疫反应的方式设计或生产替代酶。一种这样的解决方案是使用“同工酶”作为替代酶。同工酶足够接近于患者的“自身”蛋白质，但具有足以改善lsd症状的替代酶活性。
在其中lsd是庞贝氏症并且内源性酶是α-葡糖苷酶(gaa)的一个特定实施例中，同工酶可为酸性α-葡糖苷酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶(si)、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(mgam)、葡糖苷酶ii(ganab)和中性α-葡糖苷酶(cgnac)中的任何一种。在其中lsd是法布里病并且内源性酶是α-半乳糖苷酶a(gla)的另一个特定实施例中，同工酶可为经改造为具有gla活性的α-n-乙酰半乳糖胺酶。
本文提供的是除使用同工酶外，减少针对替代酶的交叉反应性免疫学材料(crim)的方法。如图5和6中证实的，包含内化效应物结合结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质(例如，经由基因治疗载体)的施用，减少针对施用对照治疗性蛋白质(缺乏内在效应物结构域且包含酶结构域)所包含的替代酶的crim水平。像这样，在一个实施例中，或减少酶缺乏症患者中针对酶的crim包括向患者施用多结构域治疗性蛋白质(或编码其的核酸，例如含有编码多结构域治疗性蛋白质的基因的基因治疗载体，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域(例如内在效应物结合蛋白)和酶结构域。
多结构域治疗性蛋白质具有内化效应物结合蛋白组分，其使得能够将替代酶摄取到细胞内。因此，在一些实施例中，内化效应物可为cd63、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl-受体、ldl-相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、爱帕琳受体(aplnr)、prlr(促乳素受体)、mal(髓鞘和淋巴细胞蛋白，又名vip17)、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体、scara1-5、scarb1-3和cd36。在某些实施例中，内化效应物是肾脏特异性内化剂，例如cdh16(cadheri-16)、cldn16(claudn-16)、kl(klotho)、pth1r(甲状旁腺激素受体)、slc22a13(溶质载体家族22成员13)、slc5a2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)和umod(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，例如bmpr1a(骨形态发生蛋白受体1a)、m-钙粘蛋白、cd9、musk(肌肉特异性激酶)、lgr4/gpr48(g蛋白偶联受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、cdh15(cadheri-15)、itga7(整联蛋白α-7)、cacng1(l型钙通道亚基γ-1)、cacnals(l型钙通道亚基α-15)、cacng6(l型钙通道亚基γ-6)、scn1b(钠通道亚基β-1)、chrna1(ach受体亚基α)、chrnd(ach受体亚基δ)、lrrc14b(富含亮氨酸重复的蛋白质14b)、肌营养不良蛋白聚糖(dag1)和popdc3(含popeye结构域的蛋白质3)。在一些具体实施例中，内化效应物是itga7、cd9、cd63、aplp2、asgr1、asgr2或prlr。
在一些实施例中，内化效应物结合蛋白包含抗原结合蛋白，其包括例如受体-融合分子、陷阱分子、受体-fc融合分子、抗体、fab片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、单链fv(scfv)分子、dab片段、经分离的互补决定区(cdr)、cdr3肽、受限的fr3-cdr3-fr4肽、结构域特异性抗体、单抗结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体、单价纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(smip)、骆驼科抗体(vhh重链同型二聚体抗体)和鲨鱼可变ignar结构域。
在一个实施例中，结合内化效应物的分子实体是抗体、抗体片段或其它抗原结合蛋白。例如，分子实体可为双特异性抗体，其中一个臂结合内化效应物(例如itga7、cd9、cd63、prlr、aplp2.asgr1、asgr2)，并且另一个臂结合替代酶。在此处，多结构域治疗性蛋白质包含双特异性抗体和替代酶(图1a)。在一个具体实施例中，所治疗的疾病是法布里病，并且多结构域治疗性蛋白质包含gla以及结合gla和cd63的双特异性抗体。在一个具体实施例中，所治疗的疾病是法布里病，并且多结构域治疗性蛋白质包含gla以及结合gla和itga7的双特异性抗体。在另一个具体实施例中，所治疗的疾病是庞贝氏症，并且多结构域治疗性蛋白质包括gaa以及结合gaa和cd63的双特异性抗体。在另一个具体实施例中，所治疗的疾病是庞贝氏症，并且多结构域治疗性蛋白质包含gaa以及结合gaa和itga7的双特异性抗体。
在另一个实施例中，结合内化效应物的分子实体包含半抗体，并且替代酶含有fc结构域(酶-fc融合多肽)。在一个实施例中，酶-fc融合多肽的fc结构域与内化效应物特异性半体的fc结构域结合，以形成多结构域治疗性蛋白质(图1b)。
在其它实施例中，替代酶与内化效应物结合蛋白共价连接。由于fc二聚体可经由一个或多个二硫桥固定，所以在先前段落中描述的酶-fc融合物:半体实施例(也参见图1b)落入该类别内。酶活性结构域或多肽与内化-结合结构域或多肽之间的共价连接可为任何类型的共价键，即涉及电子共享的任何键。在一些情况下，共价键是两个氨基酸之间的肽键，使得替代酶和内化效应物结合蛋白全部或部分形成如融合蛋白中的连续多肽链。在一些情况下，替代酶部分和内化效应物结合蛋白直接连接。在其它情况下，使用接头来栓系两个部分。参见chen等人，“fusionproteinlinkers:property,designandfunctionality,”65(10)advdrugdelivrev.1357-69(2013)。
在一个特定实施例中，替代酶共价连接至抗内化效应物抗体的重链的c末端(参见图1c)或轻链的c末端(图1e)。在另一个特定实施例中，替代酶共价连接至抗内化效应抗体的重链的n末端(参见图1d)或轻链的n末端(图1f)。在另一个特定实施例中，该酶连接至抗内化效应物scfv结构域的c末端(图1g)。
在一些情况下，尤其是替代酶通常不在溶酶体中进行蛋白水解加工的情况下，将可切割接头加入包含抗体-酶融合物的多结构域治疗性蛋白质的那些实施例中。在一些实施例中，将组织蛋白酶可切割接头插入抗体和替代酶之间，以促进溶酶体中抗体的去除，以便a)可能通过去除空间上大的抗体来帮助保存酶促活性，和b)可能增加溶酶体酶的半衰期。
在一个特定实施例中，将多结构域治疗性蛋白质在基因治疗载体中递送至患者或细胞，所述基因治疗载体包含编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸。在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质包含递送结构域和酶结构域。在一个具体实施例中，递送结构域结合内化效应物，例如cd63、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl受体、ldl相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、apelin受体(aplnr)、mal(髓磷脂和淋巴细胞蛋白(mal)、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体a1-5(scara1-5)、scarb1-3或cd36。在一个实施例中，递送结构域是与cd63结合的单链可变片段(scfv)(即，抗cd63scfv)。在另一个实施例中，递送结构域是与itga7结合的单链可变片段(scfv)(即，抗itga7scfv)。
在一个特定实施例中，多结构域治疗性蛋白质的酶结构域包含水解酶。在一个具体实施例中，酶结构域包含其为糖基化酶的水解酶。在一个更具体的实施例中，酶结构域包含其为糖苷酶的糖基化酶。在一个更具体的实施例中，酶结构域是糖苷酶，其为α-葡糖苷酶。
一般地，本文公开的是包含多核苷酸的组合物和多核苷酸在溶酶体贮积病的治疗中的用途，例如用于减少庞贝氏症患者中的糖原和/或增强对于gaa的免疫耐受性，所述多核苷酸例如(m)rna、dna及其修饰形式，其编码包含内化效应物结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。
术语“多核苷酸”包括核苷酸的聚合物(例如，rna或dna)，其编码至少一种多肽，包括融合多肽，例如包含内化效应物结构域和酶结构域的多结构域治疗性多肽。如本文使用的，多核苷酸涵盖包含经修饰的和未修饰的核苷酸两者的聚合物。多核苷酸可包含一个或多个编码区和非编码区。多核苷酸可从天然来源中纯化，使用重组表达系统产生，并且任选地纯化、化学合成等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，多核苷酸可包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有说明，否则多核苷酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施例中，多核苷酸是或包含天然核苷(例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基尿苷、c5-丙炔基胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、o(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入碱基；经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5'-n-亚磷酰胺键合)。
在一些实施例中，多核苷酸包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可包括例如5-甲基-胞苷("5mc")、假尿苷(".psi.u")和/或2-硫代尿苷("2su")。参见例如，美国专利号8,278,036或wo2011012316，其各自关于此类残基的讨论及其掺入多核苷酸内以引用的方式整体并入。非标准核苷酸残基的存在可致使多核苷酸比对照多核苷酸更稳定和/或免疫原性更低，所述对照多核苷酸具有相同序列但仅包含标准残基。在进一步的实施例中，多核苷酸可包含选自以下的一个或多个非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶，例如以及这些修饰和其它核碱基修饰的组合。某些实施例可还包括对呋喃糖环或核碱基的另外修饰。另外的修饰可包括例如糖修饰或取代(例如，2'-o-烷基修饰中的一个或多个，锁核酸(lna))。在一些实施例中，多核苷酸可与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(pna)复合或杂交。在其中糖修饰为2'-o-烷基修饰的实施例中，此类修饰可包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-o-甲基修饰、2'-o-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在某些实施例中，这些修饰中的任一种可个别或组合存在于0-100％的核苷酸中--例如，超过0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成成分核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包含信使rna(mrna)分子，其可通过众所周知的方法进行修饰或不进行修饰，例如其可包含或不包含经修饰的核苷酸，以增加其稳定性和/或降低其免疫原性。在一些实施例中，多核苷酸包含dna分子，其可通过众所周知的方法进行修饰或不进行修饰，例如其可包含或不包含经修饰的核苷酸，以增加其稳定性和/或降低其免疫原性。
在一些实施例中，多核苷酸还包括“基因座靶向核酸序列”。基因座靶向序列使得编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸能够整合到受体宿主细胞的基因组内。在一些实施例中，基因座靶向序列包括侧翼同源臂，以允许同源重组。在一些实施例中，基因座靶向序列包括指导rna序列和ii型cas酶，以促进整合(即，crispr-cas9方法)。在一些实施例中，基因座靶向序列包括指导锌指核酸酶(zfn)识别序列，以促进整合。在一些实施例中，基因座靶向序列包括转录激活因子样效应物核酸酶(talen)识别序列，以促进整合。在另外其它实施例中，基因座靶向序列包括由bud衍生的核酸酶使用的单个残基至核苷酸密码，以促进整合。
在一些实施例中，编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸整合到其内的基因组基因座是“安全港基因座”。在一个实施例中，“安全港基因座”使得多结构域治疗性蛋白质的高表达成为可能，而不干扰必需基因的表达或者促进癌基因或其它有害基因的表达。在一个实施例中，基因组基因座在以下处或附近：肝表达的白蛋白(alb)基因座、eesyr基因座、sars基因座、人染色体1的位置188,083,272或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体10的位置3,046,320或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体17的位置67,328,980或其非人哺乳动物直系同源物、染色体上的腺相关病毒位点1(aavs1)、aav病毒在人染色体19或其非人哺乳动物直系同源物上的天然存在的整合位点、趋化因子受体5(ccr5)基因、编码hiv-1共受体的趋化因子受体基因、或小鼠rosa26基因座或其非鼠哺乳动物直系同源物。在一个实施例中，基因组基因座是腺相关病毒位点。在一个实施例中，关于用于基因治疗载体整合的安全港基因组基因座的逐步选择，根据papapetrou和schambach，j.moleculartherapy，第24卷，(4):678-684，2016年4月的方法选择用于整合的基因组基因座，所述参考文献以引用的方式并入本文；关于无启动子基因靶向进入肝表达的白蛋白(alb)基因座内，还参见barzel等人nature，第517卷：360-364，其以引用的方式整体并入本文。
在一些实施例中，多核苷酸例如dna，还包含与多结构域治疗性蛋白质编码核酸序列可操作连接的启动子。在一个具体实施例中，启动子是组织特异性启动子，其在特定组织中驱动基因表达。在一个实施例中，组织特异性启动子是源自serpina1的肝特异性增强子/启动子(例如，seqidno:9)和/或是ttr启动子(seqidno:8)。在其它实施例中，启动子是cmv启动子。在其它实施例中，启动子是泛素c启动子。
在一个实施例中，编码多结构域治疗性蛋白质的“基因治疗载体”是能够将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送给宿主例如患者的任何载体。在一些实施例中，基因治疗载体靶向特定的宿主细胞或器官，例如用于局部递送，例如组织特异性递送。通常，局部递送需要由mrna编码的蛋白质(例如多结构域治疗性蛋白质)主要在器官(例如肝)中和/或由器官(例如肝)翻译且表达，从而由此形成贮库，例如用于蛋白质生产(和分泌)的肝贮库。在一些实施例中，基因治疗载体将多结构域治疗性蛋白质多核苷酸递送至患者的肝，以形成肝贮库。参见例如derosa等人genetherapy，第10卷：699-707，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施例中，基因治疗载体将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送至患者中的肌肉组织。在一些实施例中，基因治疗载体将编码多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸递送至患者的大脑。
任何目前已知或将来开发的、天然或经改造的基因治疗递送载体都可用于本发明的实践中。在一些实施例中，基因治疗载体是病毒载体，例如包含病毒、病毒衣壳、病毒基因组等。在一些实施例中，基因治疗载体是裸多核苷酸，例如附加体。在一些实施例中，基因治疗载体包含多核苷酸复合物。用作基因治疗载体的示例性非限制性多核苷酸复合物包括脂质复合物、聚合物囊泡(polymersome)、polypexes、树枝状聚合物、无机纳米颗粒(例如多核苷酸包被的金、二氧化硅、氧化铁、磷酸钙等)。在一些实施例中，如本文所述的基因治疗载体包含病毒载体、裸多核苷酸和多核苷酸复合物的组合。
在一个实施例中，基因治疗载体是病毒，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒。在一个实施例中，基因治疗载体是腺相关病毒(aav)，包括血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10和aav11、或其经改造的或天然选择的变体。
在一个实施例中，多核苷酸还包含腺相关病毒(aav)核酸序列。在一个实施例中，基因治疗载体是包含来自两种或更多种血清型的遗传元件的嵌合腺相关病毒。例如，具有来自aav1的rep基因和来自aav2的cap基因的aav载体(称为aav1/2或aavrc1/2)可用作基因治疗载体，以将多结构域治疗性蛋白质多核苷酸递送至细胞或有需要的患者的细胞。在一个实施例中，基因治疗载体是aav1/2、aav1/3、aav1/4、aav1/5、aav1/6、aav1/7、aav1/8、aav1/9、aav1/10、aav1/11、aav2/1、aav2/3、aav2/4、aav2/5、aav2/6、aav2/7、aav2/8、aav2/9、aav2/10、aav2/11、aav3/1、aav3/2、aav3/4、aav3/5、aav3/6、aav3/7、aav3/8、aav3/9、aav3/10、aav3/10、aav4/1、aav4/2、aav4/3、aav4/5、aav4/6、aav4/7、aav4/8、aav4/9、aav4/10、aav4/11、aav5/1、aav5/2、aav5/3、aav5/4、aav5/6、aav5/7、aav5/8、aav5/9、aav5/10、aav5/11、aav6/1、aav6/2、aav6/3、aav6/4、aav6/5、aav6/7、aav6/8、aav6/9、aav6/10、aav6/10、aav7/1、aav7/2、aav7/3、aav7/4、aav7/5、aav7/6、aav7/8、aav7/9、aav7/10、aav7/11、aav8/1、aav8/2、aav8/3、aav8/4、aav8/5、aav8/6、aav8/7、aav8/9、aav8/10、aav8/11、aav9/1、aav9/2、aav9/3、aav9/4、aav9/5、aav9/6、aav9/7、aav9/8、aav9/10、aav9/11、aav10/1、aav10/2、aav10/3、aav10/4、aav10/5、aav10/6、aav10/7、aav10/8、aav10/9、aav10/11、aav11/1、aav11/2、aav11/3、aav11/4、aav11/5、aav11/6、aav11/7、aav11/8、aav11/9、aav11/10、嵌合病毒粒子或其衍生物。关于可用作基因治疗载体的aav载体和嵌合病毒粒子、及其构建和用途，gao等人，“noveladeno-associatedvirusesfromrhesusmonkeysasvectorsforhumangenetherapy,”pnas99(18):11854–11859，2002年9月3日，以引用的方式并入本文。
在一个更具体的实施例中，基因治疗载体是具有血清型2rep基因序列和血清型8cap序列的嵌合aav载体(“aav2/8”或“aavrc2/8)。
在一些实施例中，基因治疗载体是已被假型化(例如，改造)以靶向特定细胞，例如肝细胞的病毒载体。使用病毒载体在靶向基因治疗中的许多进展可归纳为病毒载体的非重组(非遗传)或重组(遗传)修饰，其导致病毒载体的假型化、天然向性的扩大和/或重新靶向。(nicklin和baker(2002)curr.genether.2:273-93；verheiji和rottier(2012)advancesvirol2012:1-15中综述)。非遗传方法通常利用衔接子，其识别野生型(未修饰的)病毒表面蛋白和靶细胞两者。可溶性假受体(对于野生型病毒)、聚合物例如聚乙二醇、以及抗体或其一部分已用作衔接子的病毒结合结构域，而天然肽或维生素配体、以及抗体及其一部分已用于上述衔接子的细胞结合结构域。例如，在载体:衔接子复合物与靶细胞的表面上表达的蛋白质，例如细胞表面蛋白质的结合后，可完成病毒载体对靶细胞的重新靶向。此类方法已用于aav(bartlett等人(1999)nat.biotechnol.74:2777-2785)、腺病毒(hemminki等人(2001)cancerres.61:6377–81；vanbeusechem等人(2003)genetherapy10:1982–1991；einfeld,等人(2001)j.virol.75:11284–91；glasgow等人(2009)plosone4:e8355)、疱疹病毒(nakano等人(2005)mol.ther.11:617-24)、以及副粘病毒(bian等人(2005)cancergenether.12:295-303；bian等人(2005)int.j.oncol.29:1359-69)、冠状病毒(haijema等人(2003)j.virol.77:4528–4538；wurdinger等人(2005)genetherapy12:1394–1404)。
更流行的方法已是病毒衣壳蛋白的重组遗传修饰，并且因此是病毒衣壳的表面。在间接重组方法中，病毒衣壳用异源“支架”修饰，所述异源“支架”然后连接至衔接子。衔接子与支架和靶细胞结合。(arnold等人(2006)mol.ther.5:125-132；ponnazhagen等人(2002)j.virol.76:12900–907；还参见wo97/05266)支架例如(1)与抗体衔接子fc结合的fc结合分子(例如fc受体、蛋白a等)，(2)与生物素化衔接子结合的(链霉)抗生物素蛋白，(3)与融合至(链霉)抗生物素蛋白的衔接子结合的生物素，以及(4)形成等距肽键例如spycatcher的蛋白质:蛋白质结合对，其结合spytagged衔接子，已掺入以下内：ad(pereboeva等人(2007)genetherapy14:627–637；park等人(2008)biochemicalandbiophysicalresearchcommunications366:769–774；henning等人(2002)humangenetherapy13:1427–1439；banerjee等人(2011)bioorganicandmedicinalchemistryletters21:4985–4988)、aav(gigout等人(2005)moleculartherapy11:856–865；stachler等人(2008)moleculartherapy16:1467–1473)、以及披膜病毒(quetglas等人(2010)virusresearch153:179–196；ohno等人(1997)naturebiotechnology15:763–767；klimstra等人(2005)virology338:9–21)。
在直接重组靶向方法中，将靶向配体直接插入病毒衣壳内或联接至病毒衣壳，即，修饰蛋白质病毒衣壳以表达异源配体。配体随后重定向或结合优先地或专一地在靶细胞上表达的受体或标记物。(stachler等人(2006)genether.13:926–931；white等人(2004)circulation109:513–519.)。直接重组方法已用于以下中：aav(park等人，(2007)frontiersinbioscience13:2653–59；girod等人(1999)naturemedicine5:1052–56；grifman等人(2001)moleculartherapy3:964–75；shi等人(2001)humangenetherapy12:1697–1711；shi和bartlett(2003)moleculartherapy7:515–525)、逆转录病毒(dalba等人currentgenetherapy5:655–667；tai和kasahara(2008)frontiersinbioscience13:3083-3095；russell和cosset(1999)journalofgenemedicine1:300–311；erlwein等人(2002)virology302:333–341；chadwick等人(1999)journalofmolecularbiology285:485–494；pizzato等人(2001)genetherapy8:1088–1096)、痘病毒(guse等人(2011)expertopiniononbiologicaltherapy11:595–608；galmiche等人(1997)journalofgeneralvirology78:3019–3027；paul等人(2007)viralimmunology20:664–671)、副粘病毒(nakamura和russell(2004)expertopiniononbiologicaltherapy4:1685–1692；hammond等人(2001)journalofvirology75:2087–2096；galanis(2010)clinicalpharmacologyandtherapeutics88:620–625；blechacz和russell(2008)currentgenetherapy8:162–175；russell和peng(2009)currenttopicsinmicrobiologyandimmunology330:213–241)、以及疱疹病毒(shah和breakefield(2006)currentgenetherapy6:361-370；campadelli-fiume等人(2011)reviewsinmedicalvirology21:213–226)。
在一些实施例中，将如本文所述的基因治疗载体对那些组织假型化，所述组织特别适合于生成针对例如替代酶的调节应答例如耐受性。此类组织包括但不限于粘膜组织，例如肠相关淋巴样组织(galt)、造血干细胞和肝。在一些实施例中，基因治疗载体或如本文所述的编码多结构域治疗性蛋白质的基因在对于那些组织特异性的启动子，例如肝特异性启动子的控制下表达。
在一些实施例中，如本文所述的基因治疗载体包含裸多核苷酸。例如，在一些实施例中，可将编码多结构域治疗性多肽的多核苷酸例如肌内直接注射到器官内用于形成储库，静脉内注射等。众所周知的用于增强裸多核苷酸递送的另外方法包括但不限于电穿孔，声纳穿孔，使用基因枪射击多核苷酸包被的金颗粒，磁转染和流体动力学递送。
在一些实施例中，如本文所述的基因治疗载体包含多核苷酸复合物，例如但不限于纳米颗粒(例如，多核苷酸自组装纳米颗粒、基于聚合物的自组装纳米颗粒、无机纳米颗粒、脂质纳米颗粒、半导体/金属纳米颗粒)、凝胶和水凝胶、具有阳离子和阴离子的多核苷酸复合物、微粒及其任何组合。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可配制为自组装纳米颗粒。作为非限制性例子，多核苷酸可用于制备可用于多核苷酸的递送系统中的纳米颗粒(参见例如国际公开号wo2012125987；以引用的方式整体并入本文)。在一些实施例中，多核苷酸自组装纳米颗粒可包含本文公开的多核苷酸的核和聚合物壳。聚合物壳可为本文描述的任何聚合物，并且是本领域已知的。在一个另外的实施例中，聚合物壳可用于保护核中的多核苷酸。
在一些实施例中，这些自组装纳米颗粒可为由多核苷酸发夹的长聚合物形成的微海绵，其在自组装成微海绵之前形成为结晶‘褶皱’片层。这些微海绵是紧密堆积的海绵状微粒，其可充当有效载体，并且可将货物递送到细胞。微海绵的直径可为1μm至300nm。微海绵可与本领域已知的其它试剂复合，以形成更大的微海绵。作为非限制性例子，微海绵可与试剂复合以形成外层以促进细胞摄取，例如聚阳离子聚乙烯亚胺(pei)。该复合物可形成直径250-nm的颗粒，所述颗粒可在高温(150℃)下保持稳定。(grabow和jaegar，naturematerials2012,11:269-269；以引用的方式整体并入本文)。另外，这些微海绵可能能够显示出非凡程度的保护，以免被核糖核酸酶降解。在另一个实施例中，基于聚合物的自组装纳米颗粒例如但不限于微海绵，可为完全可编程的纳米颗粒。可精确地控制纳米颗粒的几何形状、大小和化学计量，以产生用于递送货物例如但不限于多核苷酸的最佳纳米颗粒。
在一些实施例中，多核苷酸可在无机纳米颗粒中配制(美国专利号8,257,745，以引用的方式整体并入本文)。无机纳米颗粒可包括但不限于水可溶胀的粘土物质。作为非限制性例子，无机纳米颗粒可包括由简单的硅酸盐制成的合成蒙脱石粘土(参见例如，美国专利号5,585,108和8,257,745，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施例中，多核苷酸可在包含半导体或金属材料的水可分散的纳米颗粒中配制(美国公开号20120228565；以引用的方式整体并入本文)，或在磁性纳米颗粒中形成(美国公开号20120265001和20120283503；其各自以引用的方式整体并入本文。水可分散的纳米颗粒可为疏水性纳米颗粒或亲水性纳米颗粒。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可被封装到本领域已知的任何水凝胶内，当注射到受试者内时，所述水凝胶可形成凝胶。水凝胶是其为亲水性的聚合物链的网络，并且有时作为其中水是分散介质的胶体凝胶发现。水凝胶是高度吸收的(它们可包含99％以上的水)天然或合成聚合物。由于其显著的含水量，水凝胶还具有与天然组织非常相似的柔性程度。本文所述的水凝胶可用于包封其为生物相容性、可生物降解和/或多孔的脂质纳米颗粒。
作为非限制性例子，水凝胶可为适体官能化的水凝胶。适体官能化的水凝胶可使用多核苷酸杂交进行编程，以释放一种或多种多核苷酸。(battig等人，j.am.chem.society.2012134:12410-12413；以引用的方式整体并入本文)。在一些实施例中，多核苷酸可被包封在脂质纳米颗粒中，然后脂质纳米颗粒可被包封在水凝胶内。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可被包封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶内。在另一个实施例中，在被包封到纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶或纤维蛋白胶内之前，多核苷酸可在脂质纳米颗粒或快速消除的脂质纳米颗粒中配制。在另外一个实施例中，在被包封到纤维蛋白凝胶、水凝胶或纤维蛋白胶内之前，多核苷酸可配制为脂质复合物。纤维蛋白凝胶、水凝胶和胶包含两种组分：纤维蛋白原溶液和富含钙的凝血酶溶液(参见例如，spicer和mikos，journalofcontrolledrelease2010.148:49-55；kidd等人journalofcontrolledrelease2012.157:80-85；其各自以引用的方式整体并入本文)。可改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶的组分浓度，以改变凝胶、水凝胶和/或胶的特征、网眼尺寸和/或降解特征，例如但不限于改变纤维蛋白凝胶、水凝胶和/或胶的释放特征。(参见例如，spicer和mikos，journalofcontrolledrelease2010.148:49-55；kidd等人journalofcontrolledrelease2012.157:80-85；catelas等人tissueengineering2008.14:119-128；其各自以引用的方式整体并入本文)。当用于递送本文公开的多核苷酸时，这个特征可能是有利的。(参见例如，kidd等人journalofcontrolledrelease2012.157:80-85；catelas等人tissueengineering2008.14:119-128；其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可包括阳离子或阴离子。在一个实施例中，所述制剂包括金属阳离子，例如但不限于zn2+、ca2+、cu2+、mg+及其组合。作为非限制性例子，制剂可包括与金属阳离子络合的聚合物和多核苷酸(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施例中，多核苷酸可在纳米颗粒和/或微粒中配制。这些纳米颗粒和/或微粒可被模制成任何大小的形状和化学性质。例如，纳米颗粒和/或微粒可通过liquidatechnologies.rtm.(morrisville,n.c.)使用
在一些实施例中，本文公开的多核苷酸可由keystonenano(statecollege,pa.)在nanojackets和纳米脂质体(nanoliposome)中配制。nanojackets由体内天然发现的化合物包括钙、磷酸盐制成，并且还可包括少量硅酸盐。nanojackets的大小范围可为5至50nm，并且可用于递送亲水性化合物和疏水性化合物，例如但不限于多核苷酸、初级构建体和/或多核苷酸。纳米脂质体由脂质制成，所述脂质例如但不限于体内天然存在的脂质。纳米脂质体的大小范围可为60-80nm，并且可用于递送亲水性化合物和疏水性化合物，例如但不限于多核苷酸、初级构建体和/或多核苷酸。在一个方面，本文公开的多核苷酸在纳米脂质体，例如但不限于神经酰胺纳米脂质体中配制。
在一个实施例中，多结构域治疗性蛋白质是抗cd63scfv-gaa融合蛋白或抗itga7scfv-gaa融合蛋白。经由aav递送施用抗cd63scfv-gaa融合蛋白或抗itga7scfv-gaa融合蛋白，提供了在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后，在患者的血清中的gaa的长期稳定产生。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，受体患者的血清中的gaa水平为接受未与递送结构域连接的gaa的患者血清水平的≥1.5倍至100倍、≥1.5倍至10倍、≥2.5倍、2.5倍–3倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
在一个实施例中，经由aav递送施用抗cd63scfv-gaa融合蛋白或抗itga7scfv-gaa融合蛋白，在患有庞贝氏症的患者中提供了贮积的糖原水平中的长期稳定减少。在一个实施例中，患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平减少至野生型(非疾病)水平。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平维持在野生型水平下。
在一个实施例中，经由aav递送施用抗cd63scfv-gaa融合蛋白或抗itga7scfv-gaa融合蛋白，在患有庞贝氏症的患者中提供了肌肉强度的长期恢复。在一个实施例中，在容纳多结构域治疗性蛋白质的基因治疗载体施用后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后，如通过握力测量的患者强度恢复到正常(即，非疾病正常水平)。
在另一个方面，本发明提供了包含酶活性和抗原结合蛋白的组合物，其中所述酶与酶缺乏症(lsd)和内化效应物结合蛋白相关。与溶酶体贮积病相关的酶(包括本身并非催化性的蛋白质)包括例如任何和所有水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鞘脂激活蛋白c激活因子、神经酰胺酶、鞘磷脂酶、β-氨基己糖苷酶、gm2激活因子、gm3合酶、芳基硫酸酯酶、鞘脂激活因子、α-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸酶-2-硫酸酯酶、肝素n-硫酸酯酶、n-乙酰-α-氨基葡糖苷酶、α-葡糖酰胺n-乙酰转移酶、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶等等。
内化效应物结合蛋白例如包括受体-融合分子、陷阱分子、受体-fc融合分子、抗体、fab片段、f(ab')2片段、fd片段、fv片段、单链fv(scfv)分子、dab片段、经分离的互补决定区(cdr)、cdr3肽、受限的fr3-cdr3-fr4肽、结构域特异性抗体、单抗结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、纳米抗体、单价纳米抗体、二价纳米抗体、小模块免疫药物(smip)、骆驼科抗体(vhh重链同型二聚体抗体)、鲨鱼可变ignar结构域、其它抗原结合蛋白等等。
内化效应物包括例如cd63、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl-受体、ldl-相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、爱帕琳受体(aplnr)、prlr(促乳素受体)、mal(髓鞘和淋巴细胞蛋白，又名vip17)、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体、scara1-5、scarb1-3和cd36。在某些实施例中，内化效应物是肾脏特异性内化剂，例如cdh16(cadheri-16)、cldn16(claudn-16)、kl(klotho)、pth1r(甲状旁腺激素受体)、slc22a13(溶质载体家族22成员13)、slc5a2(钠/葡萄糖协同转运蛋白2)和umod(尿调节蛋白)。在其它某些实施例中，内化效应物是肌肉特异性内化剂，例如bmpr1a(骨形态发生蛋白受体1a)、m-钙粘蛋白、cd9、musk(肌肉特异性激酶)、lgr4/gpr48(g蛋白偶联受体48)、胆碱能受体(烟碱)α1、cdh15(cadheri-15)、itga7(整联蛋白α-7)、cacng1(l型钙通道亚基γ-1)、cacnals(l型钙通道亚基α-15)、cacng6(l型钙通道亚基γ-6)、scn1b(钠通道亚基β-1)、chrna1(ach受体亚基α)、chrnd(ach受体亚基δ)、lrrc14b(富含亮氨酸重复的蛋白质14b)、肌营养不良蛋白聚糖(dag1)和popdc3(含popeye结构域的蛋白质3)。在一些具体实施例中，内化效应物是itga7、cd9、cd63、alpl2、asgr1、asgr2或prlr。
在一些实施例中，酶共价连接(即，跨越原子共享的电子)至抗原结合蛋白。在一个特定实施例中，内化效应物结合蛋白由半体组成或包含半体；该酶与fc-融合结构域融合(例如在c末端处)；并且与酶共价连接的fc结构域与抗原结合蛋白的fc结构域结合，使得结合含有一个或多个二硫桥。图1a，小图b中示意性地描绘了该特定实施例。
在另一个特定实施例中，内化效应物结合蛋白(递送结构域)由抗体或抗体片段组成或者包含抗体或抗体片段，并且该酶共价连接至抗体或抗体片段。在一个具体实施例中，递送结构域是抗体，并且该酶共价连接(通过肽键直接地，或经由接头间接地)至抗体的重链或轻链的c末端(分别为图1a，小图c或e)。在另一个具体实施例中，递送结构域是抗体，并且该酶共价连接(通过肽键直接地，或经由接头间接地)至抗体的重链或轻链的n末端(分别为图1a，小图d或f)。
在一些实施例中，酶和递送结构域不是共价连接的，而是在混合物中组合。递送结构域和酶可通过非共价力结合形成复合物。例如，在一个特定实施例中，递送结构域是双特异性抗体，其中抗体的一个臂结合内化效应物，并且另一个臂结合酶。图1a，小图a中示意性地描绘了该实施例。
在一些实施例中，酶是gaa或包含gaa活性(例如，具有gaa活性的同工酶)，并且内化效应物是itga7、cdh15、cd9、cd63、aplp2、asgr1、asgr2或prlr。在一个特定实施例中，酶是gaa或包含gaa活性，内化结构域是cd63，并且递送结构域是对于cd63和gaa具有特异性的双特异性抗体。在一个特定实施例中，酶是gaa或包含gaa活性，内化结构域是itga7，并且递送结构域是对于itga7和gaa具有特异性的双特异性抗体。
在一些实施例中，酶是gla或包含gla活性(例如，具有gaa活性的同工酶)，并且内化效应物是itga7、cd9、cd63、aplp2、asgr1、asgr2或prlr。在一个特定实施例中，酶是gla或包含gla活性，内化结构域是cd63，并且递送结构域是对于cd63和gla具有特异性的双特异性抗体。在一个特定实施例中，酶是gla或包含gla活性，内化结构域是itga7，并且递送结构域是对于itga7和gla具有特异性的双特异性抗体。
药物组合物及其施用
药物制剂可另外包含药学可接受的赋形剂，如本文使用的，其包括如适合所需的特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等等。remington'sthescienceandpracticeofpharmacy,21.sup.stedition,a.r.gennaro(lippincott,williams&wilkins,baltimore,md.,2006；以引用的方式整体并入本文)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。除非任何常规的赋形剂介质与某种物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望有的生物效应或以有害的方式与药物组合物的任何其它组分相互作用，否则其使用考虑在本发明的范围内。
在一些实施例中，药学可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施例中，赋形剂被批准用于在人中使用以及用于兽医学用途。在一些实施例中，赋形剂由美国食品和药物管理局(unitedstatesfoodanddrugadministration)批准。在一些实施例中，赋形剂是药物级的。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制造药物组合物的药学可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或制粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。此类赋形剂可任选地包括在药物组合物中。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或其组合。
示例性制粒剂和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、淀粉羟乙酸钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、皂粘土、纤维素和木制品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基吡咯烷酮)(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(淀粉羟乙酸钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶化淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝
示例性的表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、chondrux、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)、胶体粘土(例如皂粘土[硅酸铝]和
示例性的粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露醇)；天然和合成胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰藓提取物、潘瓦尔胶(panwargum)、茄替胶、依莎贝果壳粘液(mucilageofisapolhusk)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯-吡咯烷酮)、硅酸镁铝
示例性的防腐剂可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其它防腐剂。示例性的抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和/或亚硫酸钠。示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(edta)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性的抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、溴硝醇、西曲溴铵、西吡氯铵、氯己定、三氯叔丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、丙三醇、海克替啶、咪唑烷基脲、苯酚、苯氧乙醇、苯乙醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞。示例性的抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性的醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、苯酚、酚类化合物、双酚、三氯叔丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯乙醇。示例性的酸性防腐剂包括但不限于维生素a、维生素c、维生素e、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其它防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去氧肟酯、西曲溴铵、丁羟茴醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、乙二胺、月桂基硫酸钠(sls)、月桂基醚硫酸钠(sles)、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钾、焦亚硫酸钾、
示例性的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、d-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊酸、二碱式磷酸钙、磷酸、三碱式磷酸钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇等和/或其组合。
示例性的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等、及其组合。
示例性的油包括但不限于杏仁油、苦杏仁油、鳄梨油、巴巴苏油、佛手柑油、黑醋栗籽油、琉璃苣油、杜松油、甘菊油、芥花油、葛缕子油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可脂油、椰子油、鳕鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙酯油、荷荷巴油、夏威夷核果油、杂薰衣草油、熏衣草油、柠檬油、山苍子油、澳洲坚果油、锦葵油、芒果仁油、白芒花籽油、貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、橙鱼油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷迭香油、红花油、檀香油、山茶花油、夏香薄荷油、沙棘油、芝麻油、乳木果油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、岩兰草油、核桃油和小麦胚芽油。示例性的油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、环甲硅油、癸二酸二乙酯、二甲硅油360、肉豆蔻酸异丙酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或其组合。
根据制剂者的判断，组合物中可存在赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或加香剂。
递送
考虑到药物递送科学中可能的进展，本公开内容涵盖通过任何适当的途径递送基因治疗载体(例如，多核苷酸)。递送可为裸露的或配制的。
裸露递送
本发明的多核苷酸可裸露地递送至细胞。如本文使用的，“裸露的”指递送不含促进转染的试剂的多核苷酸。例如，递送至细胞的多核苷酸可不含修饰。可使用本领域已知的和本文描述的施用途径，将裸多核苷酸递送至细胞。
配制的递送
可使用本文所述的方法配制多核苷酸。制剂可包含多核苷酸，并且还可包括但不限于细胞渗透剂、药学可接受的载体、递送剂、生物可侵蚀或生物相容性聚合物、溶剂和缓释递送储库。可使用本领域已知的和本文描述的施用途径，将配制的多核苷酸mrna递送至细胞。
施用
可通过导致治疗有效结果的任何途径来施用本发明的多核苷酸。这些包括但不限于肠内、胃肠道、硬膜外、经口、经皮、硬膜外(硬膜外的)、脑内(进入大脑内)、脑室内(进入脑室内)、表皮(应用于皮肤上)、皮内(进入皮肤本身内)、皮下(皮肤下)、鼻腔施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉内)、动脉内(进入动脉内)、肌内(进入肌肉内)、心内(进入心脏内)、骨内输注(进入骨髓内)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射到腹膜内)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵体内注射(进入阴茎底部内)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、经皮(扩散通过完整皮肤用于全身分布)、经粘膜(扩散通过粘膜)、吹入(鼻吸)、舌下、唇下、灌肠剂、滴眼剂(到结膜上)或滴耳剂中。在具体实施例中，组合物可以允许其穿过血脑屏障、血管屏障或其它上皮屏障的方式施用。用于本发明的多核苷酸、初级构建体或mrna的非限制性施用途径在下文描述。
肠胃外和可注射施用
用于肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂和/或酏剂。除活性成分之外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包括佐剂，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或加香剂。在用于肠胃外施用的某些实施例中，将组合物与增溶剂如
根据已知技术，使用合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂，可配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油质悬浮液。无菌可注射制剂可为在无毒的肠胃外可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。在可采用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液。无菌的不挥发性油照常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸如油酸可用于注射剂的制备中。
可注射制剂可例如通过以下进行灭菌：经由细菌保留过滤器过滤，和/或掺入以无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。
为了延长活性成分的效应，经常期望减慢来自皮下或肌内注射的活性成分的吸收。这可通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，所述溶解速率依次又可取决于晶体大小和晶体形式。可替代地，通过将药物溶解或悬浮在油媒介物中，来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成药物的微胶囊基质，来制备可注射的储库形式。根据药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中，来制备储库可注射制剂。
储库施用
如本文所述，在一些实施例中，组合物在用于延长释放的储库中配制。一般地，靶向特定器官或组织(“靶组织”)用于施用。
在本发明的一些方面，多核苷酸在空间上保留在靶组织内或邻近靶组织。本发明提供的是通过在这样的条件下使靶组织(其含有一种或多种靶细胞)与组合物接触，向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法，所述条件使得组合物，特别是组合物的核酸组分基本上保留在靶组织中，这意味着至少10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的组合物保留在靶组织中。有利地，通过测量进入一个或多个靶细胞的组合物中存在的核酸量来确定保留。例如，施用于受试者的至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99、99.9、99.99或大于99.99％的核酸在施用后的一段时间内在细胞内存在。例如，使用含有多核苷酸和转染试剂的水性组合物，执行对哺乳动物受试者的肌内注射，并且通过测量存在于肌肉细胞中的核糖核酸的量来确定组合物的保留。
本发明的方面涉及通过在这样的条件下使靶组织(含有一种或多种靶细胞)与组合物接触，向哺乳动物受试者的靶组织提供组合物的方法，所述条件使得组合物基本上保留在靶组织中。组合物包含有效量的多核苷酸，从而目的多肽在至少一个靶细胞中产生。组合物一般包含细胞渗透剂和药学可接受的载体，尽管也考虑了“裸”核酸(例如不含细胞渗透剂或其它试剂的核酸)。
在一些情况下，期望增加由组织中的细胞产生的蛋白质的量。优选地，蛋白质生产中的这种增加在空间上限于靶组织内的细胞。因此，本发明提供的是增加哺乳动物受试者的组织中的目的蛋白质产生的方法。本发明提供的是包含多核苷酸的组合物，其特征在于已确定单位数量的组合物，以在预定体积的靶组织内包含的相当大百分比的细胞中产生目的多肽。
在一些实施例中，组合物包括多种不同的多核苷酸，其中一种或多于一种多核苷酸编码目的多肽。任选地，组合物还包含细胞渗透剂，以辅助该组合物的细胞内递送。做出关于所需的组合物剂量的确定，以在预定体积的靶组织内包含的相当大百分比的细胞中产生目的多肽(一般地，而不在与预定体积相邻或对靶组织远端的组织中诱导目的多肽的显著产生)。在这种确定之后，将确定的剂量直接引入哺乳动物受试者的组织内。
在一个实施例中，本发明提供了待在多于一次注射中或通过分剂量注射递送的多核苷酸。
在一个实施例中，使用小型一次性药物贮积器、贴片泵或渗透泵，可将本发明保留在靶组织附近。贴片泵的非限制性例子包括由以下制造和/或销售的那些泵：
给药
本发明提供了包括向有此需要的受试者施用基因治疗载体，以及任选地随后施用多结构域治疗性多肽的方法，所述基因治疗载体包含编码多结构域治疗性多肽的多核苷酸。在一些实施例中，方法包括向有此需要的患者施用包含以治疗有效量的包含编码多结构域治疗多肽的多核苷酸的基因治疗载体，其中所述治疗有效量足以避免多结构域治疗多肽的后续施用。相应地，在一些实施例中，治疗缺乏酶的有此需要的患者，例如减少庞贝氏症患者中的糖原水平和/或减少针对gaa的crim的方法，包括向患者施用以治疗有效量的包含多核苷酸的基因治疗载体，所述多核苷酸编码包含替代酶的多结构域治疗性蛋白质，例如抗cd63scfv::gaa融合蛋白，例如包含如seqidno:11所示序列的多结构域治疗性蛋白质，其中所述治疗有效量取消了替代酶例如gaa或其衍生物对患者的后续施用。在一些实施例中，治疗缺乏酶且有此需要的患者，例如减少庞贝氏症患者中的糖原水平和/或减少针对gaa的crim的方法，包括向患者施用以治疗有效量的包含多核苷酸的基因治疗载体，所述多核苷酸编码包含替代酶的多结构域治疗性蛋白质，例如抗cd63scfv::gaa融合蛋白，例如包含如seqidno:11所示序列的多结构域治疗性蛋白质，并且还包括向患者施用治疗有效量的替代酶。使用有效预防、治疗、诊断或成像疾病、病症和/或状况(例如与工作记忆缺陷有关的疾病、病症和/或状况)的任何量和任何施用途径，可将核酸、蛋白质或复合物，或者其药学、成像、诊断或预防组合物施用于受试者。取决于受试者的物种、年龄和一般状况，疾病的严重程度，特定组合物，其施用模式，其活性模式等等，所需的确切量因受试者而异。为了易于施用和剂量均匀度，根据本发明的组合物通常以剂量单位形式配制。然而，应理解，本发明的组合物的每日总用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体的治疗有效、预防有效或适当的成像剂量水平取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的类似因素。
提供下述实例以进一步说明本发明的方法。这些实例仅是说明性的，并且不预期以任何方式限制本发明的范围。
实例
实例1：抗hcd63scfv::gaa多核苷酸和基因治疗载体的构建
使用标准的三重转染方案(gray等人2011；还参见“productionofrecombinantadeno-associatedviralvectorsanduseinvitroandinvivoadministration”,currentprotocolsinneuroscience,johnwiley&sons,newyork(1999)，第4.17.1–4.17.25页，第1卷)，生成编码人gaa(hgaa；seqidno:1；核酸序列由seqidno:12表示)、或在其c末端上融合至人gaa的抗人cd63单链可变片段(scfv)(抗scfv-hcd63scfv-hgaa；seqidno:10；核酸序列由seqidno:11表示)表达的aav2/8病毒。为了生产，将1×107个hek293细胞铺平板到15cm板上。第二天，使用peipro(polyplus转染，newyork,ny目录#115-100)介导的转染，以1:1(1ulpeipro:1μgdna)的比率，用(a)8μg包含肝特异性serpina1增强子(seqidno:9)且编码ttr驱动的人gaa的对照paav载体，或包含肝特异性serpina1增强子(seqidno:9)且编码ttr驱动的hcd63scfv-hgaa的测试paav(参见图1b)，以及(b)paavrc2/8衍生的载体(gao，2002)和16μgphelper(agilent，目录#240074)转染细胞。在转染后七十二小时，将细胞收集，并茄子使用标准冻融法，在包含20mmtris-hcl、1mmmgcl2、2.5mmkcl，100mmnacl的缓冲液中裂解。接下来，将苯甲酸酶(sigma，目录#e1014-25ku)以0.5u/μl的最终浓度加入样品中，然后使这在37℃下温育60分钟。然后如(zolotukhin等人，1999,genether1999；6:973–985)中所述，使用碘克沙醇梯度超速离心来纯化病毒，然后通过qpcr进行滴定。
aav样品在37℃下用dnasei(thermofisherscientific，目录#en0525)处理一小时，并且使用dna提取allreagents(thermofisherscientific目录#4403319)进行裂解。使用针对aav2itr的引物，使用quantstudio3real-timepcrsystem(thermofisherscientific)，来定量衣壳化的病毒基因组。aav2itr引物的序列是5′-ggaacccctagtgatggagtt-3′(正向itr；seqidno:3)和5′-cggcctcagtgagcga-3′(反向itr；seqidno:4)(aurnhammer等人，2012)，分别地左内部反向重复(itr)序列源自aav(seqidno:6)和右内部反向重复(itr)序列源自aav(seqidno:7)。aav2itr探针的序列是5′-6-fam-cactccctctctgcgcgctcg-tamra-3′(seqidno:5)(aurnhammerc.,haasem.,muethern.,等人，2012,hum.genether.methods23,18–28)。在95℃激活步骤10分钟后，两步pcr循环在95℃下执行15秒且在60℃下执行30秒，共40个循环。在qpcr中使用thetaqmanuniversalpcrmastermix(thermofisherscientific，目录#4304437)。dna质粒(agilent，目录#240074)用作测定绝对滴度的标准。
抗人cd63抗体及其融合使用h5c6小鼠抗人cd63可变结构域(seqidno:10的氨基酸1-119提供了h5c6抗体的重链可变结构域(vh)的氨基酸序列，并且seqidno:10的氨基酸135-245提供了h5c6抗体的轻链可变结构域(vl)的氨基酸序列)。此处使用的抗hcd63scfv(seqidno:2)源自h5c6克隆，其为小鼠抗hcd63单克隆igg1，κ轻链抗体(h5c6保藏于位于universityofiowa的developmentalstudieshybridomabank到八月，j.t./hildreth,j.e.k.(dshbhybridomaproducth5c6；dshb目录#h5c6,rrid:ab_528158)。抗体的scfv形式以重-轻次序用可变结构域克隆，其中甘氨酸-丝氨酸接头位于两者之间(5’-vh-gly-ser-vl-3’)
实例2：aav后在鼠庞贝氏症模型中的糖原含量
为了确定aav递送的抗hcd63scfv-gaa融合物相对于aav递送的gaa在体内模型的有关糖原贮积中的效应，两种疗法均递送至庞贝氏症小鼠模型，其中小鼠对于小鼠gaa基因的缺失为纯合的，并且对于代替小鼠cd63的人cd63的表达是纯合的，具有75％c57bl/6；25％129svj的品种背景。这些小鼠在本文中称为cd63humingaako小鼠或可替代地称为cd63hu/hu；gaa-/-小鼠。
对于该实验，2月龄的cd63humingaako小鼠经由尾静脉注射施用含有基因组的任一aav2/8病毒，具有驱动人gaa的ttr肝特异性启动子(aav-hgaa；在实例1中描述)，或在其c末端处与人gaa融合、驱动抗人cd63scfv的ttr肝特异性启动子(aav-抗hcd63scfv-hgaa；在实例1中描述)。两种aav2/8病毒以两种剂量之一递送：1e10vg/小鼠或1e11vg/小鼠。作为对照，测定中包括未处理的cd63humingaako小鼠和未处理的具有完整小鼠gaa基因的cd63humin。小鼠在处理后饲养3个月，并且在此期间以增量(每月)放血，用于gaa水平和抗gaa抗体的血清测量。3个月后，处死所有小鼠，并且收获各种组织用于糖原测量、pas-h染色、中央核的定量、溶酶体增殖的测量和lc3b表达的测量。表4中显示了关于各组小鼠的实验给药和处理方案。
表4：关于各组小鼠的实验给药和处理方案
结果也在图2中描绘，其显示了抗hcd63scfv::gaa使骨骼肌中的糖原下降至野生型水平，与单独的gaa不同。与单结构域gaa替代酶相比，用两结构域抗hcd63scfv::gaa多结构域治疗性蛋白质的处理导致贮积糖原中大得多的减少。通过对于各个小鼠，针对经过三个月的gaa或scfv-gaa的总血清表达绘制四头肌糖原水平(图3)或心脏糖原水平(图4)，观察到即使在相似的血清水平下，抗hcd63scfv::gaa融合蛋白也去除比单独的gaa酶更多的糖原(图3和4)。
实例3：对gaa的免疫应答
为了测量抗人gaa抗体血清水平，按照制造商的说明书，使用血清分离器管(bdbiosciences，目录#365967)，将来自所有处理组的血清与在最终放血期间收集的血液分开。分别地，96孔高蛋白结合板(thermofisher，目录#15041)用在pbs中稀释的20μghgaa(r&dsystems，目录#8329-gh-025)包被过夜。将板用pbs+0.05％tween(pbs-t)洗涤3次。用0.5％bsa的pbs-t溶液封闭板，并且将范围为1:300至1:5.1e7的小鼠血清的系列稀释物加入板中过夜。使用hrp缀合的山羊抗小鼠igg抗体(jacksonimmunoresearch，目录#115-035-164)和bdopteia底物试剂盒，测量总抗小鼠igg(亚类1+2a+2b+3)。使用1n磷酸来终止显色反应。然后在spectramaxi3板阅读器(moleculardevices)上，在450nm处读取吸光度。将稀释曲线与s形曲线拟合，并且从该曲线计算滴度。表5中显示了表示为平均总igg滴度+/-sd的滴度。
如表5中所示，未接受处理的小鼠显示了平均水平为1.1e+03的平均背景滴度。用aav-抗hcd63scfv-hgaa或aav-hgaa的低剂量病毒(1e10vg/小鼠)处理的小鼠证实高滴度，而在用高剂量(1e11vg/小鼠)处理的小鼠中，滴度较低。在血清中具有最高水平的gaa、用1e11vg的aav-抗hcd63scfv-hgaa处理的小鼠具有的滴度在未处理小鼠的范围内。
表5：血清抗gaa抗体水平
在aav施用后较高水平的gaa或抗hcd63scfv::gaa对应较低的抗gaa滴度。在注射后三个月的过程中，用高或低滴度的aav-抗hcd63scfv::gaa或aav-gaa处理的gaa无效小鼠的血清就抗gaa抗体进行评价。图5描绘了对于各个小鼠的血清抗gaa抗体滴度相对于gaa暴露(即，经过3个月的gaa或scfv-gaa的总血清表达)，其证实抗体滴度与对gaa的血清暴露之间的负相关，证实具有高gaa暴露的小鼠对gaa耐受。同样地，对于用编码gaa或抗hcd63scfv::gaa蛋白的aav感染的各组绘制抗gaa抗体滴度的图6，证实较高剂量的构建体导致较低滴度的抗gaa。
实例4：血清gaa
为了在整个实验过程中测量人的gaa血清水平，经由尾部放血在每月一次的时间点收集样品。按照制造商的说明书，使用血清分离管(bdbiosciences，目录#365967)从血液中分离血清。然后将1μl分离的血清上样到4-20％novex楔形孔(wedgewell)预制凝胶上，在220v下运行45分钟，并且使用标准程序在200ma下转移至硝酸纤维素膜共1小时。然后硝酸纤维素膜用在12ml中以1:2000稀释度使用的抗gaa一抗(abcam,#ab137068)、以及以1:1000稀释度使用的抗gapdh抗体(abcam,#ab9484)进行探测，并且在4℃下温育过夜。在一抗温育后，将膜用1xtbst洗涤三次，每次洗涤5分钟。然后将在12ml中以1:15000稀释度的抗兔igg(licor,926-32211)和抗小鼠igg(licor,925-68070)(licor,lincoln,ne)二抗加入膜中，并且在室温下温育1小时。在二抗温育后，将膜用1xtbst洗涤两次，每次洗涤5分钟，且用1xtbs洗涤一次，共5分钟。然后使用licorodyssey仪器(li-corbiotechnology)，对膜进行成像且定量。表6中显示了表示为以任意单位的平均值+/-标准差(sd)的gaa血清水平。
如表6中所示，用测试的高剂量(1011vg/小鼠)的aav-抗hcd63scfv-hgaa或aav-hgaa处理的cd63humingaako小鼠证实在实验过程中的血清中gaa的持续水平，其中gaa的血清水平在aav-抗hcd63scfv-hgaa处理的小鼠中高于aav-hgaa处理的小鼠。在用低剂量(1010vg/小鼠)的aav-抗hcd63scfv-hgaa或aav-hgaa处理的小鼠中，gaa的水平在实验过程中下降，到12周时间点，在某些小鼠中接近可忽略不计的水平。
表6：血清gaa水平
gaa或抗hcd63scfv::gaa的表达在接受高剂量的aav(1011vg/小鼠)的小鼠中随着时间过去得到维持，但在接受较低剂量(1010vg/小鼠)的小鼠中下降。图7a描绘了绘制如通过蛋白质印迹探测的，对于用编码gaa或与gaa的抗hcd63scfv融合物的aav感染的各个组，随着时间过去的gaa血清水平的图。与不含递送结构域的gaa酶相比，融合蛋白(scfv::gaa)证实始终较高水平(例如2.5至3倍)的血清gaa(图7a)。
在注射后3个月，肝、心脏和四头肌裂解产物中的表达的实时pcr定量显示于图7b中。对于aav构建体的所有注射都检测到肝表达，其中对于aav-hgaa和aav-抗hcd63::hgaa两者(两者均由肝特异性启动子lsp驱动)，对于1e11vg/小鼠注射具有最高水平。还做出了血清gaa水平与gaa的rna表达水平的比较(图7c)，并且结果显示接受编码融合蛋白的aav的小鼠在3个月时存在定位于肝的较低gaarna表达，然而，gaa血清水平在该特定小鼠中很高。当rna水平在肝中很低时，aav-lsp-hgaa注射不呈现gaa的高血清水平。参见图7c。这一数据提示编码融合蛋白(并且表达由肝特异性启动子驱动)的aav获得关于gaa的改善分泌谱。
还观察到在huh-7肝细胞中，抗体::hgaa相对于单独的hgaa的较高分泌/细胞内比率。在一个实验中，用编码hgaa、抗hcd63scfv::gaa融合物、或非结合scfv::gaa融合对照的肝特异性启动子驱动的构建体瞬时转染huh-7人肝细胞。在转染后3天，两种scfv::gaa融合构建体在分泌的上清液中具有比单独的hgaa更高比率的蛋白质(统计学显著至p<0.05，n＝3)。在实验期间向上清液中添加m6p以减轻ci-mpr介导的摄取并不影响该比率。
实例5：糖原的组织测量和肌肉组织的组织学表征
糖原的组织测量：为测量各个组织中的糖原含量，在co2窒息后立即从来自各组的小鼠中解剖出心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和edl组织，然后将其在液氮中速冻，并且贮存于-80℃下。将～50mg的每种组织在台式匀浆器上用不锈钢珠在蒸馏水中以1mg/25μl水的比率裂解，用于糖原测量。糖原分析裂解产物在105℃下加热15分钟，并且以21000xg离心以清除碎片。根据制造商关于荧光测定的说明书，使用glycogenassaykit(sigma-aldrich,#mak016)执行糖原测定。在荧光板阅读器(moleculardevices,spectramaxi3)上，在535nm激发和587nm发射下，测量每个样品的荧光。使用制造商提供的以下公式计算糖原的计算量。然后将每个处理组中来自每种组织的糖原的计算量取平均值，并且在表7中表示为平均值+/-标准差(sd)。
如表7中所示，与gaawt小鼠相比，gaa的损失导致跨越测量的所有组织的平均糖原水平中的大量增加。用aav-抗hcd63scfv-hgaa以1011vg/小鼠的处理将测试的所有组织中的糖原减少至wt或接近wt水平，与仅部分减少贮积糖原的用aav-gaa的处理不同。任一病毒的低剂量也减少糖原，但程度低于高剂量。1010vg/小鼠剂量的aav-抗hcd63scfv-hgaa以与1011vg/小鼠剂量的aav-gaa相似的方式减少糖原水平。
表7：在心脏、四头肌、腓肠肌、膈肌、比目鱼肌和edl中测量的平均值+/-sd糖原水平
用于组织病理学和定量的四头肌收获物：除低剂量(1e10vg/小鼠)处理组外，将来自各组小鼠的四头肌组织样品或在解剖后立即在液氮中速冻，并且贮存于-80℃下用于定量lc3b表达，或置于含有o.c.t培养基(tissue-tek,#4583)的块上。
将o.c.t培养基中的组织样品送至histoserv,inc(germantown,md)用于切片和过碘酸希夫(pas)染色，以检测多糖。制备另外的切片并且返回，用于中央核的染色和溶酶体增殖。
pas染色：使用leica幻灯片扫描仪以20x放大率，对pas染色切片进行成像。来自每个处理组的代表性小鼠所得到的图像显示于图8中。
如图8中所示，与不含处理的cd63humingaako小鼠和用aav-hgaa处理的cd63humingaako小鼠(其展示高水平的pas染色)相比，用aav-抗hcd63scfv-hgaa处理的cd63humingaako在3个月时证实染色中的明显降低。这进一步指出，用aav-抗hcd63scfv-hgaa的处理可减少cd63humingaako小鼠中的多糖累积，并且可以跨越肌肉纤维均匀的方式实现这点。
中央核的定量和溶酶体增殖：将来自histoserv的未染色的切片从冷冻器中取出，然后在染色室中用4％多聚甲醛的pbs溶液固定15分钟。然后将固定的载玻片在pbs中洗涤两次，每次5分钟，然后在室温下与封闭缓冲液(ebiosciences,00-4953-54)一起温育1小时。然后载玻片在加湿染色室中的同时，用在封闭缓冲液中以1:50稀释度的大鼠抗lamp-1抗体(abcam,#ab25245)、在封闭缓冲液中以1:1000稀释度的兔抗层粘连蛋白抗体(sigma,#l9393)、或未添加抗体的封闭缓冲液进行染色，然后转移至4℃用于过夜温育。第二天，然后将载玻片在pbs中洗涤两次，每次5分钟，然后在染色室中用与alexafluor647缀合的山羊抗兔igg(h+l)超克隆二抗(lifetechthermo,#a27040)、或与alexafluor555缀合的山羊抗大鼠igg(h+l)交叉吸附的二抗(lifetechthermo,#a21434)进行染色，然后允许在室温下温育1小时。然后将染色的载玻片在pbs中清洗两次，每次5分钟，然后将它们用具有dapi的fluoromount-g(lifetechthermo,#00-4959-52)固定，并且在zeisslsm710仪器(carlzeissmicroscopygmbh)上成像。中央核的数目使用halo软件(indicalabs,nm)进行定量，并且表示为显示中央核的纤维百分比+/-标准差，显示于表8中。溶酶体增殖在图8中描绘。
表8：中央核的定量
lc3b表达的定量：为了定量lc3b表达，将速冻的样品融化，匀浆化，然后在ripa缓冲液中以1mg组织/25μlripa缓冲液的比率(150mmnacl、1.0％
如表9中所示，与cd63humingaawt小鼠相比，存在缺乏gaa的小鼠中的平均lc3b-i和lc3b-ii水平两者中的显著增加。用aav-抗hcd63scfv-hgaa处理将cd63humingaako中的平均lc3b-i和lc3b-ii水平降低至wt或接近wt水平。与cd63humingaako小鼠相比，用aav-hgaa处理的cd63humingaako证实略微下降的平均lc3b-i和lc3b-ii水平，但这种下降并不像aav-抗hcd63scfv-hgaa处理那样明显。
表9：在小鼠的四头肌中的lc3b-i和lc3b-ii水平
实例6：aav抗hcd63::gaa处理导致肌肉强度和协调测试中的显著进步
用aav-lsphgaa或aav-lsp抗hcd63::hgaa治疗(参见上文)的小鼠的握力和rotarod测试性能。野生型gaa小鼠、未处理的对照、aav-lsp-hgaa(1e11vg/小鼠)、或aav-lsp-抗hcd63::hgaa治疗(1e11vg/小鼠)的加速rotarod测量(图9a)和前肢握力测量(图9b)以每月一次的间隔进行6个月。误差条为+/-sd。对于所有组n＝8-10。
实例7：作为将gaa引导至组织的“向导”的其它膜蛋白
测试了其它膜蛋白，例如抗itga7(整联蛋白α-7)融合蛋白，以将gaa导向组织，以替代酶缺乏症小鼠中的gaa。连同或不连同5mmm6p的存在，使c2c12小鼠成肌细胞与抗mcd63-gaa或抗itga7-gaa一起温育过夜。对于两种融合蛋白，随着时间过去，在成肌细胞裂解产物中均检测到活性gaa酶(图10a)。在进一步的实验中，对于cd63人源化的gaako小鼠(gaa-/-；cd63hu/hu)通过流体动力递送(hdd)给予编码抗hcd63::gaa的scfv::gaa形式、或抗整联蛋白α-7的全长igg4::gaa形式的质粒，并且在hdd后3周处死小鼠。在心脏、四头肌、腓肠肌和膈肌中测量组织糖原水平。还在相同条件下测试了未处理的对照小鼠gaa-/-xcd63hu/hu和未处理的野生型gaa对照小鼠gaa+/+；cd63hu/hu(4)。如野生型小鼠中，糖原水平在抗hcd63::gaa处理的小鼠和抗itga7::gaa处理的小鼠组两者中均处于非常低的水平下。参见图10b。
实例8：在可比较的血清水平下，aav抗cd63::gaa处理比具有优化gaa构建体的aav更有效
用aav感染的cd63humingaako小鼠(gaa-/-xcd63hu/hu)显示出在肌肉强度和协调测试中的显著进步，所述aav含有肝特异性增强子(serpina1；seqidno:9)和肝特异性启动子(lsp；ttr；seqidno:8)来驱动抗hcd63::gaa多结构域治疗剂(seqidno:10)的表达，其使用胰凝乳蛋白酶原b2信号肽(sp7)，并且包含人gaa的氨基酸36-952(δ8gaa；seqidno:78)。对于每种病毒给予三种不同剂量：5e11vg/kg、2e12vg/kg和4e12vg/kg。定期地通过下颌下放血收集血清。aav感染后一个月，处死小鼠。收集心脏和骨骼肌组织样品，并且在液氮中速冻，并且保持在-80℃下用于贮存。通过在蒸馏水中的珠撞击使组织匀浆化，来测量组织中的糖原。将样品煮沸且离心，并且将上清液用于商业糖原测定试剂盒中。如先前实施例中所述，使用蛋白质印迹用针对人gaa的抗体定量血清。对于每只小鼠，每种组织中的糖原水平针对在1个月时构建体的血清水平进行绘制。4-参数曲线拟合用于确定每种组织中的两种处理的ec50。
用编码抗hcd63::gaa或sp7-δ8gaa的含有肝特异性启动子(lsp)的aav感染提供了在每个感染剂量下可比较的gaa血清水平。图11。然而，在测定的每种肌肉组织中，当使用抗hcd63::gaa相对于sp7-δ8gaa时，观察到ec50中的～2.2倍减少，证实在等价血清水平下，与不融合至抗体的经修饰的gaa表达构建体相比，抗cd63::gaa更有效地清除糖原。参见图12和表10。
表10：心脏、膈肌、四头肌和三头肌中aav抗hcd63::gaa和aavsp7-δ8gaa的ec50(95％置信区间)
实例9：示例性cd63抗体
抗人cd63抗体的生成
通过用人cd63免疫小鼠(例如，包含编码人免疫球蛋白重链和人κ轻链可变区的dna的改造小鼠)获得抗人cd63抗体。
免疫后，从每只小鼠中收获脾细胞，并且或(1)与小鼠骨髓瘤细胞融合以保存其活力且形成杂交瘤细胞，并且筛选人cd63特异性，或(2)使用人cd63片段作为结合且鉴定反应性抗体(抗原阳性b细胞)的分选试剂进行b细胞分选(如us2007/0280945a1中所述)。
最初使用例如如美国专利号7,105,348；美国专利号8,642,835；和us9,622,459中所述的velocimmune技术，分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对人cd63的嵌合抗体；所述专利各自以引用的方式并入本文。
在某些抗体中，出于测试目的，将小鼠恒定区替换为所需的人恒定区，例如野生型人ch或经修饰的人ch(例如igg1、igg2或igg4同种型)和轻链恒定区(cl)，以生成全人抗hcd63，包括包含抗hcd63抗体或其抗原结合部分的全人双特异性抗体。虽然选择的恒定区可根据具体用途而变，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征位于可变区中。
根据本实例的方法生成的包含抗人cd63结合臂的示例性双特异性抗体的某些生物学特性在下文阐述的实例中详细描述。
抗cd63抗体的重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表11阐述了编码所选择的抗cd63抗体的重链或轻链可变区(分别为hcvr或lcvr)、或者重链或轻链cdr(分别为hcdr和lcdr)的核酸(na)序列，以及在括号中的氨基酸(aa)序列的序列标识符，所述抗cd63抗体用于生成本文公开的多结构域治疗性抗cd63::gaa蛋白。
表11：抗cd63序列标识符
通过亲本抗人cd63抗体的结合
使用内源性表达人cd63的cd63阳性hek293细胞(atcc，目录#crl-1573)，以及cd63阴性的hek293/cd63敲除细胞，经由流式细胞术获得抗cd63抗体与表达人cd63的细胞的相对细胞表面结合。对于测定，将细胞在96孔v型底板(axygenscientific，目录#p-96-450-v-c-s)中，在含有2％fbs(saradigm目录#1500-500)(染色缓冲液)、不含钙和镁的pbs(vwr，目录号45000-446)中铺平板。然后使细胞与浓度范围为100nm至1.7pm的抗cd63抗体或同种型对照抗体一起在冰上温育30分钟。不含抗体的孔用作对照。仅用最高浓度(100nm)的抗体，对hek293/cd63ko细胞进行染色。然后将细胞用染色缓冲液洗涤一次，并且与以100nm的pe缀合的抗小鼠fc二抗(jacksonimmunoresearch，目录#115-115-164)一起在4℃下温育30分钟。然后将细胞洗涤，并且使用在pbs中稀释的50％cytofix(bdbiosciences，目录#554655)溶液固定。在intellicytehypercyt流式细胞仪上运行样品，并且在forecyt软件(intellicyte)中分析结果，以计算平均荧光强度(mfi)。使用graphpadprism在12点响应曲线上，使用四参数逻辑方程分析测量值，并且报告所得到的ec50值(表12)。信噪比(s/n)通过计算抗cd63抗体或对照抗体mfi与不含抗体的孔的比率来确定(表12)。
如表12中所示，本发明的三种抗cd63抗体证实以范围为21.0至31.6的s/n值和范围为0.5nm至1.9nm的ec50值与hek293细胞结合。非结合对照并未证实与hek293细胞的结合(s/n≤1.5)。抗cd63抗体和同种型对照抗体两者均证实与hek293/cd63ko细胞的弱结合几乎不结合(s/n≤4.4)。
表12：如通过流式细胞术测量的，抗cd63抗体与hek293和hek293/cd63ko细胞的结合
nd＝未确定
还使用基于电化学发光(ecl)的检测测定，来确定本发明的抗cd63单克隆抗体结合人cd63表达细胞的能力。
为了生成过表达的细胞，转染小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3细胞(atcc，目录#crl-1658)，以形成稳定表达人cd63(hcd63；登录号np_001771的氨基酸m1-m238；seqidno:77)的细胞系“nih3t3/hcd63”。遵循制造商的说明书，用quantumtmalexa
简言之，将细胞系在不含ca2+/mg2+的pbs缓冲液中清洗一次，并且在37℃下与enzymefreecelldissociationsolution(millipore，目录#s-004-c)一起温育10分钟，以使细胞解离。然后将细胞用含ca2+/mg2+的pbs洗涤一次，并且用cellometertmautot4细胞计数器(nexcelombioscience,llc)计数。将大约2.0x104nih3t3/hcd63、lncap、u87mg或nih3t3细胞分开接种到96孔碳电极板(mesoscalediscovery，目录#l15xb-6)上，然后在37℃下温育一小时。在室温(rt)下，用在含ca2+/mg2+的pbs中的2％bsa(w/v)封闭非特异性结合位点一小时。然后将含有在含ca2+/mg2+的pbs中的0.5％bsa(w/v)中的一系列浓度(1.7pm至100nm)的抗cd63抗体或同种型对照抗体的溶液，以及单独的对照缓冲液，一式两份地加入板结合的nih3t3/hcd63、lncap、u87mg或nih3t3细胞中，并且在tr下温育一小时。随后使用具有细胞清洗头(mdsanalyticaltechnologies)的aquamax2000板洗涤器，来洗涤平板以去除未结合的抗体。用1μg/ml对于fcγ片段特异性的sulfo-tagtm缀合的山羊多克隆抗人igg抗体(jacksonimmunoresearch，目录#109-005-098)、或对于fcγ片段特异性的sulfo-tagtm缀合的山羊多克隆抗小鼠igg抗体(jacksonimmunoresearch，目录#115-005-164))在rt下检测板结合的抗体一小时。将板洗涤，然后根据制造商的说明书，与readbuffer(msd，目录#r92td-2)一起温育。使用sectorimager(msd)测量发光信号。记录以相对光单位(rlu)测量的发光强度，以指示每种抗体在测试的浓度范围下的结合强度。与相同浓度的与阴性细胞结合的抗体相比，用3.7nm与人cd63表达细胞结合的抗体检测到的信号比报道为cd63结合特异性的指示。将结合比大于3的抗体归类为特异性结合剂，并且将结合比小于或等于3的抗体归类为非结合剂，并且在表13中标记为nb。另外，直接结合信号(以rlu表示)根据抗体浓度进行分析，并且使用graphpadprismtm软件，将数据与s形(四参数逻辑)剂量应答模型拟合。确定与人cd63表达细胞结合的ec50值，其定义为在其下检测到最大结合信号的50％的抗体浓度，以指示每种抗体的效力，并且仅对于特定结合剂在表13中报告。
如表13中所示，如实例9中所述生成的四种抗cd63抗体和比较物ab(比较物1)特异性结合在经改造的nih3t3/hcd63细胞上表达的人cd63，以及在lncap和u87mg细胞系上内源性表达的人cd63。实例9中描述的四种抗cd63抗体以范围为280pm至970pm的ec50值，以及超过阴性细胞系范围为91至281倍的结合比，与nih3t3/hcd63细胞结合。本发明的四种抗cd63抗体以范围为500pm至1.4nm的ec50值，以及超过阴性细胞系范围为52至272倍的结合比，与u87mg细胞结合。如实例9所述生成的四种抗cd63抗体以范围为210pm至1.7nm的ec50值，以及超过阴性细胞系范围为7至20倍的结合比，与lncap细胞结合。与u87mg细胞相比，在lncap细胞上较低的结合比与这些细胞上较低的cd63拷贝数一致。如预期的，同种型对照抗体是非结合剂，具有小于或等于3的细胞结合比。
表13.如通过基于化学发光的检测测量的，与人cd63表达细胞结合的抗cd63抗体
nb-非粘合剂；将结合比小于或等于3的抗体归类为非结合剂。
由亲本抗人cd63抗体介导的细胞毒性
为了评价本文所述的抗cd63抗体在表达cd63的细胞中内化的能力，执行体外间接细胞毒性测定。将人cd63阳性t47d细胞(atcc，目录#htb-133)和人cd63阴性nih3t3细胞(atcc，目录#crl-1658)，在pdl包被的96孔板(bdbiocoat，目录#356461)中分别以6,000个细胞/孔接种在rpmi(irvinescientific，目录#9160)中，所述rpmi含有10％fbs(atcc，目录#30-2020)、青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺(gibco，目录#10378-016)、50umβ-巯基乙醇(sigma，目录#m7522)(生长培养基)、丙酮酸钠100mm(millipore，目录#tms-005-c)、hepes1m(irvinescientific，目录#9319)和牛胰岛素10ug/ml(geminibioproducts，目录#700-912p)，或以2,000个细胞/孔接种在dme高葡萄糖(irvinescientific，目录#9033)、10％胎牛血清(hyclone，目录#sh30072.03)、加上青霉素/链霉素/l-谷氨酰胺(gibco，目录#10378-016)中，并且在5％co2中在37℃下过夜生长。对于细胞活力曲线，使细胞与连续稀释的抗cd63抗体(h2m12450n)或浓度范围为3.0pm至2.2nm的非结合同种型对照抗体在37℃下温育5分钟。然后将与细胞毒性有效载荷mmaf(moradec，目录#am-201af-50)缀合的fab抗mfc二抗以20nm加入每个孔中。单独的培养基充当阴性对照，并且使用33μm洋地黄皂苷(promega，目录#g9441)以确定最大细胞毒性。温育72小时后，按照制造商的方案，使用cellcountingkit-8(dojindo，目录#ck04)测量细胞活力，具有1-3小时的温育时间范围。在envision板阅读器(perkinelmer)上测量在450nm处的吸光度(od450)。从所有孔中减去来自洋地黄皂苷处理的细胞的背景od450水平，并且将活力表示为未处理对照的百分比(％活力)。ic50值由在8点响应曲线(graphpadprism)上的四参数逻辑方程确定。所有ic50值都以nm浓度表示，并且报告了在处理后剩余的最小％存活细胞。
如表14中概括的，抗cd63抗体h2m12450n将t47d活力减少至21％，具有0.24nm的ic50值，而同种型对照仅将活力减少至64％。该抗体对nih3t3细胞系的活力具有很少的影响至没有影响。
表14.在t47d和nih3t3细胞中通过间接细胞毒性测定测量的抗cd63抗体内化
nd＝未确定
在25℃和37℃下测量的抗cd63单克隆抗体与cd63(ec2)环试剂结合的biacore结合动力学
使用基于实时表面等离振子共振的biacoret200生物传感器或biacore2000生物传感器，确定与纯化的抗cd63单克隆抗体结合的不同cd63环试剂的平衡解离常数(kd)。所有结合研究都在25℃和37℃下在10mmhepes、150mmnacl、3mmedta和0.05％v/v表面活性剂tween-20，ph7.4(hbs-et)运行缓冲液中执行。首先通过用兔抗小鼠fc特异性多克隆抗体(gehealthcare，目录#br100838)、或抗人fab试剂盒(gehealthcare，目录#28958325)的胺偶联，使biacorecm5传感器芯片表面衍生化，以捕获抗cd63单克隆抗体。对用c末端myc-myc-六组氨酸表达的重组人cd63细胞外环2(hcd63ec环2-mmh；seqidno:80)、或用c末端人fc标签表达的重组人cd63细胞外环2(hcd63ec环2-hfc；seqidno:81)执行结合研究。首先在hbs-et运行缓冲液中制备不同浓度的hcd63ec环2-mmh或hcd63ec环2-hfc(以4倍稀释度的50nm–12.5nm或以3倍连续稀释度的90nm-0.37nm测试)，并且以35μl/分钟或50μl/分钟的流速注入抗小鼠fc捕获的抗cd63单克隆抗体表面4分钟，同时在hbs-et运行缓冲液中监测单克隆抗体结合的cd63试剂的解离共8或10分钟。使用scrubber2.0c曲线拟合软件，通过将实时结合传感图与具有质量转运限制的1:1结合模型拟合，来确定结合速率(ka)和解离速率(kd)。结合解离平衡常数(kd)和解离半衰期(t1/2)根据动力学速率计算为：
表15至18中显示了在25℃和37℃下，人cd63ec环2蛋白与本发明的不同抗cd63单克隆抗体结合的结合动力学参数。
如表15中所示，在25℃下，本发明的所有抗cd63单克隆抗体都以范围为530pm至11.0nm的kd值结合hcd63ec环2-mmh。如表16中所示，在37℃下，本发明的所有抗cd63单克隆抗体都以范围为1.15nm至56.4nm的kd值结合hcd63ec环2-mmh。
如表17中所示，在25℃下，本发明的所有抗cd63单克隆抗体都以范围为150pm至753pm的kd值结合hcd63ec环2-hfc。如表18中所示，在37℃下，本发明的抗cd63单克隆抗体都以范围为119pm至3.38nm的kd值结合hcd63ec环2-hfc。
表15：在25℃下人cd63ec环2-mmh与抗cd63单克隆抗体结合的结合动力学参数
表16：在37℃下人cd63ec环2-mmh与抗cd63单克隆抗体结合的结合动力学参数
表17：在25℃下人cd63ec环2-hfc与抗cd63单克隆抗体结合的结合动力学参数
表18：在37℃下人cd63ec环2-hfc与抗cd63单克隆抗体结合的结合动力学参数
生成双特异性抗体以确定具有抗cd63结合臂的双特异性复合物的内化
为了评价如本实例中所述生成的抗cd63抗体作为双特异性抗原结合分子的部分内化的能力，将抗体重构成双特异性形式，其中一个结合臂是抗cd63抗体vh/vl对(参见表11亲本抗体)，且另一个是无关的结合臂。使用制备双特异性抗体的标准方法，并且示例性方法在例如美国申请公开号2010/0331527和美国专利号us5731168中进行描述，其各自以引用的方式并入本文。使用人cd63表达细胞测试双特异性抗体的内化能力。对于测定，将内源性表达人cd63的hek293细胞以10,000个细胞/孔的密度在含有10％fbs和青霉素-链霉素/l-谷氨酰胺(gibco，目录#10378016)的dmem中，在透明底部黑色聚d-赖氨酸包被的96孔板(greiner，目录#655946)中铺平板。两天后，将培养基更换为新鲜培养基，其含有以10μg/ml开始至0.157μg/ml的2倍稀释系列的抗cd63双特异性抗体以及阴性对照抗体，连同仅培养基对照。然后使细胞在37℃下温育3小时，以允许抗体内化。温育后，将细胞用pbs洗涤，在4％多聚甲醛(thermoscientific，目录#28908)中在室温下固定20分钟，然后用在5％正常山羊血清(ngs)(gibco，目录#pcn5000)中的0.2％tritonx-100(spectrumchemical，目录#tr135)在室温下渗透化处理20分钟。然后使细胞与2ug/ml驴抗小鼠iggalexafluor-647fab(manufacture，目录#115-606-006)、或2μg/ml山羊抗人iggalexafluor-647fab(jacksonimmunoresearch，目录#115-606-006)一起在5％ngs中在室温下温育1小时。去除二抗溶液，然后用pbs洗涤细胞，随后加入含有2滴/mlnucblue(invitrogen，目录#r37605)的新鲜pbs，以染色活细胞核。抗体内化和核在imagexpresshigh-contentimagingsystem(moleculardevices)上以40x成像，并且使用metaxpresssoftwaretransfluorapplicationmodule(moleculardevices)定量抗体内化。抗体内化报告为小窝集成强度(pitintegratedintensity)/细胞±标准差(sd)。
如表15中所示，掺入与人cd63结合的单臂(源自h1m12451、h2m12450或h2m12395)和无关的非结合臂的所有双特异性抗体都证实有效内化到hek293细胞内。掺入mab12450的一个结合臂的双特异性抗体证实比测试的其它双特异性抗体更高的内化量。
表15：抗cd63双特异性抗体通过hek293细胞的内化
序列表
<110>瑞泽恩制药公司
a·巴伊克
k·席格纳
c·舍恩赫尔
c·基拉索斯
c·王
<120>用于内化酶的组合物和方法
<130>009108.361wo1/10361wo01
<150>62/673,098
<151>2018-05-17
<150>62/574,719
<151>2017-10-19
<150>62/516,656
<151>2017-06-07
<160>81
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>952
<212>prt
<213>智人
<400>1
metglyvalarghisproprocysserhisargleuleualavalcys
151015
alaleuvalserleualathralaalaleuleuglyhisileleuleu
202530
hisasppheleuleuvalproarggluleuserglyserserproval
354045
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505560
proargaspalaglnalahisproglyargproargalavalprothr
65707580
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859095
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100105110
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115120125
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130135140
glumetglytyrthralathrleuthrargthrthrprothrphephe
145150155160
prolysaspileleuthrleuargleuaspvalmetmetgluthrglu
165170175
asnargleuhisphethrilelysaspproalaasnargargtyrglu
180185190
valproleugluthrprohisvalhisserargalaproserproleu
195200205
tyrservalgluphesergluglupropheglyvalilevalargarg
210215220
glnleuaspglyargvalleuleuasnthrthrvalalaproleuphe
225230235240
phealaaspglnpheleuglnleuserthrserleuproserglntyr
245250255
ilethrglyleualagluhisleuserproleumetleuserthrser
260265270
trpthrargilethrleutrpasnargaspleualaprothrprogly
275280285
alaasnleutyrglyserhisprophetyrleualaleugluaspgly
290295300
glyseralahisglyvalpheleuleuasnserasnalametaspval
305310315320
valleuglnproserproalaleusertrpargserthrglyglyile
325330335
leuaspvaltyrilepheleuglyprogluprolysservalvalgln
340345350
glntyrleuaspvalvalglytyrprophemetproprotyrtrpgly
355360365
leuglyphehisleucysargtrpglytyrserserthralailethr
370375380
argglnvalvalgluasnmetthrargalahispheproleuaspval
385390395400
glntrpasnaspleuasptyrmetaspserargargaspphethrphe
405410415
asnlysaspglypheargasppheproalametvalglngluleuhis
420425430
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serproglylys
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种用于在医学中使用的组合物，其包含多核苷酸和药学可接受的载体，所述多核苷酸编码包含递送结构域和酶结构域的多结构域治疗性蛋白质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述递送结构域是抗原结合蛋白。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述递送结构域是单链可变片段(scfv)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述递送结构域结合内化效应物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述递送结构域结合选自以下的内化效应物：cd63、整联蛋白α-7(itga7)、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl受体、ldl相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、apelin受体(aplnr)、mal(髓磷脂和淋巴细胞蛋白(mal))、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体a1-5(scara1-5)、scarb1-3和cd36。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述递送结构域结合内化效应物cd63。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述递送结构域包含seqidno:2的氨基酸序列，或选自表11中所示的hcvr的氨基酸序列、表11中所示的lcvr的氨基酸序列、表11中所示的hcdr1的氨基酸序列、表11中所示的hcdr2的氨基酸序列、表11中所示的hcdr3的氨基酸序列、表11中所示的lcdr1的氨基酸序列、表11中所示的lcdr2的氨基酸序列、表11中所示的lcdr3的氨基酸序列的氨基酸序列，如seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54或seqidno:62/70所示的hcvr/lcvr氨基酸对，任选地其中所述hcvr/lcvr氨基酸对从n末端到c末端包含：hcvr、任选的接头和lcvr，和/或任选地其中所述酶结构域附着至lcvr的c末端(例如，经由接头)及其任何组合。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述酶结构域包含水解酶。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述酶结构域包含糖基化酶。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述酶结构域包含糖苷酶。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述酶结构域包含seqidno:1、seqidno:13、seqidno:78的氨基酸序列或其片段。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含病毒核酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含病毒核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(aav)核酸序列。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含病毒核酸序列和任选的基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是腺相关病毒(aav)核酸序列，并且其中所述aav核酸序列包含内部末端重复序列，以及任选地，组织特异性调节元件例如肝特异性启动子。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含病毒核酸序列和任选的基因座靶向核酸序列，其中所述病毒核酸序列是包含内部末端重复序列的腺相关病毒(aav)核酸序列，所述内部末端重复序列包含seqidno:6、seqidno:7或两者，以及任选地，组织特异性调节元件例如肝特异性启动子。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含组织特异性调节元件，所述组织特异性调节元件包含如seqidno:8、seqidno:9或两者所示的序列。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸包含seqidno:11的核酸序列，和/或编码如seqidno:10或seqidno:78所示的氨基酸序列。
19.一种基因治疗载体，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸。
20.根据权利要求19所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体选自以下：
包含根据权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸的病毒载体，任选地其中所述病毒载体是天然病毒、改造病毒或嵌合病毒，
裸多核苷酸，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸，
多核苷酸复合物，任选地其中所述多核苷酸复合物是包含根据权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸和脂质的脂质纳米颗粒，和
其任何组合。
21.根据权利要求19或权利要求20的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是选自逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘病毒、牛痘病毒、慢病毒或腺相关病毒的病毒载体。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体是aav2/8嵌合体和/或对特定组织例如肝假型化的aav。
23.一种重组多结构域治疗性蛋白质，其包含递送结构域和酶结构域，其中所述蛋白质由根据权利要求1-18中任一项所述的多核苷酸编码。
24.根据权利要求23所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域是抗原结合蛋白。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域是单链可变片段(scfv)。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域结合内化效应物。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域结合选自以下的内化效应物：cd63、整联蛋白α-7(itga7)、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl受体、ldl相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、apelin受体(aplnr)、mal(髓磷脂和淋巴细胞蛋白(mal))、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体a1-5(scara1-5)、scarb1-3和cd36。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域结合内化效应物cd63。
29.根据权利要求23-28中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述递送结构域包含seqidno:2的氨基酸序列，或选自表11中所示的hcvr的氨基酸序列、表11中所示的lcvr的氨基酸序列、表11中所示的hcdr1的氨基酸序列、表11中所示的hcdr2的氨基酸序列、表11中所示的hcdr3的氨基酸序列、表11中所示的lcdr1的氨基酸序列、表11中所示的lcdr2的氨基酸序列、表11中所示的lcdr3的氨基酸序列的氨基酸序列，如seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54或seqidno:62/70所示的hcvr/lcvr氨基酸对，任选地其中所述hcvr/lcvr氨基酸对从n末端到c末端包含：hcvr、任选的接头和lcvr，和/或任选地其中所述酶结构域附着至lcvr的c末端(例如，经由接头)及其任何组合。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包括水解酶。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含糖基化酶。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含糖苷酶。
33.根据权利要求23-32中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶(gaa)或其一部分。
34.根据权利要求23-33中任一项所述的重组多结构域治疗性蛋白质，其中所述酶结构域包含seqidno:1、seqidno:13、seqidno:78的氨基酸序列或其片段，任选地其中所述多结构域治疗性蛋白质包含如seqidno:79所示的氨基酸序列。
35.一种在体内的细胞中表达包含递送结构域和酶结构域的重组多结构域治疗性蛋白质的方法，所述方法包括：
a.使所述细胞与含有编码重组多结构域治疗性蛋白质的多核苷酸的基因治疗载体接触；
b.允许所述多核苷酸整合到所述细胞的基因组基因座内；和
c.允许所述细胞产生所述重组多结构域治疗性蛋白质，
其中所述基因治疗载体根据权利要求19-22中任一项所述。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述基因治疗载体是腺相关病毒(aav)载体。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述细胞的基因组基因座是安全港基因座。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的方法，其中所述基因组基因座在选自以下的基因座处或附近：eesyr基因座、sars基因座、人染色体1的位置188,083,272或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体10的位置3,046,320或其非人哺乳动物直系同源物、人染色体17的位置67,328,980或其非人哺乳动物直系同源物、染色体上的腺相关病毒位点1(aavs1)、aav病毒在人染色体19或其非人哺乳动物直系同源物上的天然存在的整合位点、趋化因子受体5(ccr5)基因、编码hiv-1共受体的趋化因子受体基因、小鼠rosa26基因座或其非鼠哺乳动物直系同源物、以及人白蛋白(alb)基因座。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述递送结构域是抗原结合蛋白。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述递送结构域是单链可变片段(scfv)。
41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述递送结构域结合内化效应物。
42.根据权利要求35-41中任一项所述的方法，其中所述递送结构域结合选自以下的内化效应物：cd63、整联蛋白α-7(itga7)、mhc-i、kremen-1、kremen-2、lrp5、lrp6、lrp8、转铁蛋白受体、ldl受体、ldl相关蛋白1受体、asgr1、asgr2、淀粉样前体蛋白样蛋白-2(aplp2)、apelin受体(aplnr)、mal(髓磷脂和淋巴细胞蛋白(mal))、igf2r、液泡型h+atp酶、白喉毒素受体、叶酸受体、谷氨酸受体、谷胱甘肽受体、瘦素受体、清道夫受体a1-5(scara1-5)、scarb1-3和cd36。
43.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中所述递送结构域结合内化效应物cd63。
44.根据权利要求35-43中任一项所述的方法，其中所述递送结构域包含seqidno:2的氨基酸序列，或选自表11中所示的hcvr的氨基酸序列、表11中所示的lcvr的氨基酸序列、表11中所示的hcdr1的氨基酸序列、表11中所示的hcdr2的氨基酸序列、表11中所示的hcdr3的氨基酸序列、表11中所示的lcdr1的氨基酸序列、表11中所示的lcdr2的氨基酸序列、表11中所示的lcdr3的氨基酸序列的氨基酸序列，如seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54或seqidno:62/70所示的hcvr/lcvr氨基酸对，任选地其中所述hcvr/lcvr氨基酸对从n末端到c末端包含：hcvr、任选的接头和lcvr，和/或任选地其中所述酶结构域附着至lcvr的c末端(例如，经由接头)及其任何组合。
45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含水解酶。
46.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含糖基化酶。
47.根据权利要求35-46中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含糖苷酶。
48.根据权利要求35-47中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含α-葡糖苷酶。
49.根据权利要求35-48中任一项所述的方法，其中所述酶结构域包含seqidno:1、seqidno:13、seqidno:78的氨基酸序列或其片段。
50.根据权利要求35-49中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含seqidno:11的核酸序列。
51.根据权利要求35-50中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
52.根据权利要求35-51中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
53.根据权利要求35-51中任一项所述的方法，其中所述细胞是小鼠细胞。
54.根据权利要求35-53中任一项所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
55.一种减少有此需要的患者中的组织中的糖原累积的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1-18中任一项所述的组合物或根据权利要求19-21中任一项所述的基因治疗载体。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述组织选自心脏、肝和骨骼肌。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述多结构域治疗性蛋白质包含抗cd63scfv-gaa，任选地其中所述抗cd63scfv包含如seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54或seqidno:62/70所示的hcvr/lcvr氨基酸对，任选地其中所述hcvr/lcvr氨基酸对从n末端到c末端包含：hcvr、任选的接头和lcvr，任选地其中所述酶结构域例如经由接头附着至lcvr的c末端，任选地其中所述gaa包含seqidno:1或seqidno:78的氨基酸序列，和/或任选地其中所述抗cd63scfv-gaa包含如seqidno:10或seqidno:79所示的序列。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中gaa的高血清水平维持至少12周。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中在12周时gaa的血清水平比施用包含编码不含所述抗cd63scfv递送结构域的gaa的多核苷酸的基因治疗载体的受试者中gaa的血清水平高约2.5-3倍。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，其中心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平减少至野生型水平。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的方法，其中在所述基因治疗载体施用后3个月，所述组织中的糖原水平维持在野生型水平下。
62.一种治疗有此需要的患者中的酶缺乏症和/或使患者对其缺乏的酶耐受的方法，其包括向所述患者施用根据权利要求19-22中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因治疗载体编码包含酶结构域和递送结构域的多结构域治疗性蛋白质。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述酶缺乏症是糖苷酶的缺乏症。
64.根据权利要求62或权利要求63所述的方法，其中所述酶缺乏症是α-葡糖苷酶的缺乏症。
65.根据权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述多结构域治疗性蛋白质是抗cd63scfv-gaa，任选地其中所述抗cd63scfv-gaa包含如seqidno:10或seqidno:79所示的氨基酸序列。
66.根据权利要求62-65中任一项所述的方法，其中在所述基因治疗载体施用后，gaa的高血清水平在所述患者中维持至少12周。
67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中在所述基因治疗载体施用后12周时，所述患者中的gaa的血清水平比施用包含编码不含所述抗cd63scfv递送结构域的gaa的多核苷酸的基因治疗载体的受试者中gaa的血清水平高约2.5-3倍。
68.根据权利要求62-67中任一项所述的方法，其中所述患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平减少至野生型水平。
69.根据权利要求62-68中任一项所述的方法，其中在所述基因治疗载体施用后3个月，所述患者的心脏、骨骼肌和肝组织中的糖原水平维持在野生型水平下。
70.根据权利要求62-69中任一项所述的方法，其中在治疗后所述患者的肌肉强度恢复到野生型水平。
71.根据权利要求62-70中任一项所述的方法，其中所述患者患有庞贝氏症。
72.根据权利要求62-71中任一项所述的方法，其中与在不存在所述递送结构域的情况下接受所述酶结构域的对照患者相比，所述患者具有减少的针对所述酶的抗体。
73.根据权利要求62-71中任一项所述的方法，其还包括用一种或多种免疫抑制剂对所述患者进行免疫抑制。
74.根据权利要求62-73中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用其缺乏的酶作为最后步骤。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述患者经由多结构域治疗性蛋白质施用其缺乏的酶，任选地其中所述多结构域治疗剂包含抗cd63抗体或其抗原结合部分。
76.根据权利要求35-75中任一项所述的方法，其中向所述患者施用治疗有效量的多核苷酸，所述多核苷酸使得无需向所述患者进一步施用gaa、其一部分、或者包含gaa或其一部分的多结构域治疗性多肽。
77.一种分离的抗cd63抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含如表11中所示的hcvr/lcvr氨基酸序列对的参考抗体竞争结合人cd63。
78.根据权利要求77所述的抗cd63抗体或抗原结合片段，其中所述参考抗体包含选自如seqidno:14/22、seqidno:30/38、seqidno:46/54或seqidno:62/70所示的hcvr/lcvr氨基酸序列对。
79.根据权利要求77或权利要求78所述的抗cd63抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合与参考抗体相同的人cd63上的表位，所述参考抗体包含如表11中所示的hcvr/lcvr氨基酸序列对。
80.一种药物组合物，其包含根据权利要求19-22中任一项所述的基因治疗载体和药学可接受的载体。
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