陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C基因GhPIPLC2-2及其应用的制作方法

本发明涉及陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2及其在提高植物耐盐性中的应用。属于植物基因工程领域。

背景技术：

人口增长和农业生态环境变化影响着人们的粮食安全。高盐胁迫将导致农作物减产。为了减轻高盐胁迫对粮食生产安全的影响，人们需要培育新的适应“高盐环境”的农作物品种，以期待这些品种可以承受在高盐胁迫下具有良好的生长发育，实现在盐碱地高产丰产，以满足人们对农产品日益增长的需求。因此，培育耐盐植物具有重要意义。

磷脂是生物膜的一个重要的成分，磷脂中的一些成员具有重要的信号传导等生物学功能。磷脂酶可切割磷脂中的相关化学键以维持膜脂质的稳态和稳定。磷脂酶c(phospholipasec，plc)是水解磷脂甘油侧的磷酸二酯键，生成二脂酰甘油(diacylglycerol，dag)和磷酸化的头部基团的酶类。根据底物特异性，植物中的plc可分为三类：作用于常见磷脂(如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)的非特异性plc(non-specificplc，npc)，水解磷酸肌醇的磷酸肌醇特异性plc(phosphoinositide-specificplc；pi-plc)和水解糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，gpi)-锚定蛋白的gpi-plc等。研究表明一些磷脂酶参与了植物应对一些生物或非生物胁迫，诸如干旱、低温、高热、高盐、高渗、重金属胁迫、磷缺乏、病原体侵染等。此外某些类型磷脂酶还能调节植物的发育过程，诸如参与调解花粉管的生长、胚胎发生以及根和叶的发育等。越来越多的结果表明，磷脂酶在植物生长，发育以及应对非生物和生物胁迫中起着重要作用。

pi-plc可水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,pip2)产生二酰基甘油(diacylglycerol，dag)和肌醇1,4,5-三磷酸(inositol1,4,5-triphosphate，ip3)。pi-plc在植物不同的发育阶段和各种组织如叶、根、茎、花和果实中表达。在拟南芥、水稻等多种植物中，干旱、寒冷、盐、热、aba和水杨酸(sa)等显著诱导pi-plc的表达，pi-plc可在植物生长发育和应激反应中发挥重要作用。尽管pi-plc的信号传导功能已在动物系统中得到了较为明确的阐述，但pi-plc在植物中的作用机理仍有待进一步探究。为了更好地了解植物pi-plc的功能，在棉花中探讨pi-plc并研究其功能也是非常必要的。然而检索发现有关陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2及其在提高植物耐盐性中的应用尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2及其在提高植物耐盐性中的应用。

本发明所述的陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因，其特征在于：所述基因命名为陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2，该基因cdna的核苷酸序列如seqidno.1所示，为1737bp。进一步的，所述ghpiplc2-2基因含有9个外显子，8个内含子。

本发明还公开了所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因编码的氨基酸序列，其特征在于：所述氨基酸序列如seqidno.2所示，编码578个氨基酸。进一步的，所述ghpiplc2-2基因编码的蛋白含有氨基酸数578个，理论等电点6.02，分子量为66126.45da。

本发明还提供了含有上述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2的表达载体。所述表达载体为重组原核表达载体或重组植物表达载体。

任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，诸如：pcambia1300-gfp、pcambia1302、pcambia1303、px-yfp、pbi121等载体，本发明优选的是px-yfp载体。

上述pcambia1300-gfp等载体可从biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心等机构(公司)获取。本发明涉及的px-yfp载体及其应用见相关文献(tiany,fanm,qinz,etal.hydrogenperoxidepositivelyregulatesbrassinosteroidsignalingthroughoxidationofthebrassinazole-resistant1transcriptionfactor[j].naturecommunications,2018,9(1):1063.)。

本发明所述含有陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是px-bar-ghpiplc2-2-yfp。

本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2在提高植物耐盐性中的应用。

本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2在培育耐盐性植物中的应用。

上述的应用中：所述植物优选是拟南芥或棉花。进一步优选所述拟南芥是col-0野生型，所述棉花品种是中9807。

本发明所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因的植物表达载体px-bar-ghpiplc2-2-yfp在提高拟南芥或棉花耐盐性中的应用。

本发明所述含陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因的植物表达载体px-bar-ghpiplc2-2-yfp在培育耐盐性拟南芥或棉花中的应用。

本发明中首先在棉花9807植株中克隆到磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2；实验发现在200mmnacl盐胁迫3h和6h的条件下，四叶期叶片中的ghpiplc2-2均表现出ghpiplc2-2基因表达水平的上调，体现在高盐胁迫3h时ghpiplc2-2表达水平上调3.96倍，高盐胁迫6h时ghpiplc2-2表达水平上调7.89倍。利用gateway系统将ghpiplc-2-2基因通过bp反应连接到pdonr221载体上(thermofisherscientific，货号12536017)，cloningvectorspdonr221图谱参见图1。通过转化的方法该质粒在大肠杆菌transt5α中得到大量克隆，进行lr反应把ghpiplc2-2基因连接到表达载体px-yfp中获得植物表达载体px-ghpiplc2-2-yfp，其在大肠杆菌transt5α中表达后提取质粒，将质粒转入农杆菌菌株gv3101中，利用农杆菌介导法将ghpiplc2-2基因导入拟南芥(col-0)中，对ghpiplc2-2基因的抗逆功能进行了验证。结果显示：本发明所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2的表达受高盐胁迫诱导。通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过研究发现转基因植株的对高盐更敏感，敲除或rnai该基因将显著提高植物的盐抗性，预示ghpiplc2-2基因应用于培育耐盐植物或在提高植物耐盐性中具有重要作用。因此，可通过基因编辑或rnai方法，下调陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2基因的表达，通过分子检测和植株抗逆性测定选出抗性明显提高的转基因植株。在进一步通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，即可筛选出耐盐性明显提高的转基因材料。

本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明首次在棉花9807植株中克隆到磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2，并通过实验证实过表达ghpplc2-2基因的拟南芥中对盐敏感，敲除或rnai该基因将显著提高植物的盐抗性，预示ghpiplc2-2基因在应用于培育耐盐植物在提高植物耐盐性中具有重要作用。

附图说明

图1、cloningvectorspdonr221图谱。

图2、盐胁迫下棉花ghpiplc2-2基因在叶片中的表达模式。

图3、大肠杆菌transt5α的菌落pcr鉴定

其中：泳道1为dnamarkerdl2000；泳道2～9号是菌落pcr结果。

图4、植物表达载体px-bar-ghpiplc2-2-yfp的t-dna区

图5、px-bar-ghpiplc2-2-yfp质粒转化大肠杆菌transt5α的菌落pcr鉴定

其中：泳道1为dnamarkerdl2000；泳道2～17号是菌落pcr结果。

图6、转ghpiplc2-2-yfp基因拟南芥的免疫印迹分析

使用anti-yfp抗体对不同转基因植物中yfp蛋白质水平的免疫印迹分析。其中anti-actin蛋白的抗体作为对照。oe1～oe17为转ghpiplc2-2-yfp基因拟南芥株系。m为蛋白质maker(themoscientific,#26616)。

图7、nacl胁迫下野生型和转ghpiplc2-2基因拟南芥种子的萌发率

其中：a、1/2ms培养基；b、150mmnacl的1/2ms培养基。

图8、nacl胁迫下拟南芥幼苗主根的根长。

图9、200mmnacl胁迫5d后拟南芥的表型。

图10、200mmnacl胁迫5d后拟南芥的生物量。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(sambrook和russell,2001)。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1:高保真pcr扩增ghpiplc2-2目的基因

取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照植物总rna提取试剂盒(tiangen，北京，rn38)说明书，提取植物总rna，用primescriptrtreagentkit(takara，大连，rr047a)反转录试剂盒反转录得到cdna。以特异引物进行高保真pcr扩增。

特异引物序列如下：

ghpiplc2-2-f：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatgtccaaacaaacttacaggg；

ghpiplc2-2-r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgatgaattcaaagtgcataaggagc。

下划线表示bp反应同源重组位点。

pcr反应总体积为50μl，反应体系为：10μl5×pfubuffer，1μldntp，1μl正向引物，1μl反向引物，1μlfastpfudnapolymerase，1μl稀释十倍的cdna模板，ddh2o补齐至50μl。

pcr扩增条件，预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec，最后72℃延伸10min。

将pcr产物经琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收(tiangen，北京)纯化后，连接到pdonr221载体上。然后转化大肠杆菌transt5α，进行测序分析。通过上述步骤，获得了陆地棉非特异性磷脂酶c基因ghpiplc2-2的cdna的核苷酸序列。

具体的，通过高保真酶扩增获得陆地棉非特异性磷脂酶c基因ghpiplc2-2的cdna的核苷酸序列如seqidno.1所示，为1737bp。所述陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因编码的氨基酸序列如seqidno.2所示，编码578个氨基酸。

实施例2：ghpiplc2基因在盐胁迫下的表达模式分析

陆地棉中9807(gossypiumhirsutuml.var.zhong9807)种子经消毒后种植在温室中，生长条件为：30℃/25℃，相对湿度为60～70％，光照14h，黑暗10h，光子通量密度为800μmolm^-2s^-1。生长至四叶期时，进行盐(200mmnacl)处理，处理时间分别是3h和6h。提取总rna并反转为cdna，稀释10倍后用于实时荧光定量pcr分析。陆地棉histone基因(genbankaccessionnumbernc_006639)为内标。荧光定量pcr反应试剂盒为takara的sybrpremixextaqⅱ试剂盒，反应在96system荧光定量仪中进行，进行3次生物学重复，实验结果用相对定量2^-δδct法计算ghpiplc2-2基因的表达量。

其中涉及引物序列为：

ghpiplc2-2-qrt-f：agaggatgattcacaacgggg；

ghpiplc2-2-qrt-r：gctgcgacttttctccatcatc；

所设pcr程序为预变性95℃5min，39个循环：95℃，20sec；60℃，20sec；72℃，20sec。

结果表明，在盐胁迫3h和6h后，ghpiplc2-2均表现出基因表达水平上调，在盐胁迫3h时表达水平上调3.96倍，在盐胁迫6h时表达水平上调7.89倍(图2)。因此，ghpiplc2-2基因的表达受高盐诱导。

实施例3：ghpiplc2-2基因功能的验证

1、拟南芥表达载体的构建

取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照植物总rna提取试剂盒(tiangen，北京，dp432)说明书，提取植物总rna，用primescriptrtreagentkit(tiangen，北京，rn38)反转录试剂盒反转录得到cdna。以特异引物进行高保真pcr扩增。特异引物序列如下：

ghpiplc2-2-f：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaatgtccaaacaaacttacaggg；

ghpiplc2-2-r：ggggaccactttgtacaagaaagctgggttgatgaattcaaagtgcataaggagc(下划线表示bp同源重组位点)

pcr反应总体积为50μl，反应体系为：10μl5×pfubuffer，1μldntp，1μl正向引物，1μl反向引物，1μlfastpfudnapolymerase，1μl稀释十倍的cdna模板，ddh2o补齐至50μl。pcr扩增条件为：预变性94℃5min，35个循环：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec，最后72℃延伸10min。

将pcr产物经琼脂糖凝胶dna回收试剂盒回收(tiangen，北京，dp209)纯化后连接到cloningvectorspdonr221载体上(图1)，然后转化大肠杆菌感受态细胞transt5α，进行菌落pcr验证。菌落pcr鉴定所用引物序列是：m13f，tgtaaaacgacggccagt；ghpiplc2-2-r，gatgaattcaaagtgcataaggagc，菌落pcr预期大小为1737bp条带，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果参见图3，目的条带结果与预期相符，大小基本正确。挑取大小正确的菌落进行测序分析，结果表明ghpiplc2-2基因正确连接到pdonr221载体中。

测序正确的菌株提取质粒后，将所提取的质粒浓度稀释为70ng/μl，将px-yfp载体的浓度也稀释为70ng/μl，按照反应体系：1μlpdorn221-ghpiplc2-2，1μlpx-yfp,0.5μllr酶(invitrogen，#1993359)，25℃金属浴中反应1h。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞transt5α，获得用于拟南芥转化的植物表达载体：px-bar-ghpiplc2-2-yfp，植物表达载体t-dna区如图4所示。

菌落pcr鉴定所用引物序列是：

ghpiplc2-2-f:atgtccaaacaaacttacaggg；

cfp-n:cgtcgccgtccagctcgaccag；

菌落pcr预期大小为1737bp条带，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果参见图5，目的条带结果与预期相符，大小基本正确。大小正确的菌株提取质粒转化农杆菌gv3101后用于浸染野生型拟南芥col-0植株。

2、拟南芥转基因植株的获得

(1)在-80℃冰箱中取出已转化目的基因的农杆菌菌株(菌株名称：gv3101)，用接种环沾取菌液在yeb固体培养基(含50μg/mlrif，50μg/mlkm)上划线，28℃生化培养箱中培养2～3d。

(2)在yeb固体培养基上挑取单菌落，接种于30mlyeb液体培养基中(含50μg/mlrif，50μg/mlkm)，28℃220rpm摇床震荡培养24h，od600至0.8～1.5后备用。

(3)将摇好的农杆菌菌液加入50ml灭过菌的离心管中，25℃，4000rpm离心10min。弃掉上清液，收集菌体。用40ml灭菌重悬液(8μlsilwetl-77，2g蔗糖，40mlh2o)将收集菌体悬浮，用移液枪缓缓吹打使其混匀。

(4)野生型拟南芥在转化前一天需浇足水。转化前将拟南芥上的白色果荚全部剪掉，然后将拟南芥花序全部浸入农杆菌重悬液中，浸泡30sec。将侵染过的col-0拟南芥置于温室中培养，待种子成熟后将其收获得t1代种子。

3、拟南芥转基因植株的免疫印迹分析

将单株收取的t2代种子消毒后铺于1/2ms培养基上，置于光照培养箱生长一周左右，每种材料称取叶片约30mg，迅速冻于液氮里。将样品充分研磨破碎后，加入2倍体积的sdsloadingbufer，充分混匀后于离心机中4℃、15000rpm离心15分钟，取上清于新的离心管中，进行sds-page。

(1)上样

sds-page电泳浓缩胶浓度为5％，ph＝6.8；分离胶浓度为8％，ph＝8.8。加满新鲜的电泳缓冲液于电泳内槽，外槽中加电泳液至电泳槽中间凸起处，将蛋白样品上样。

(2)电泳

电泳仪电压设置：浓缩胶参数为100v，20min，分离胶参数为140v，1.5h。

(3)转膜

截取大小合适的nc膜及4张waterman滤纸，将切好的2张waterman滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放入半干转印槽中间位置(注意每层之间不要有气泡)，将切好的nc膜，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的两张waterman滤纸上(注意每层之间不要有气泡)，将切好的page胶，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的nc膜上(注意每层之间不要有气泡)，将切好的剩余2张waterman滤纸，放在盛有转膜液的方皿中静置5sec，拿出放在刚才的page胶上(注意每层之间不要有气泡)，将圆筒状50ml离心管放在waterman滤纸上，轻压滚动，驱赶气泡。然后盖上黑色盖板(注意方向，注意卡槽入槽)再盖上乳白色盖板。转膜条件设置为15v电压，进行15min电泳。

(4)免疫反应

转完膜后将膜直接放入10ml含有5％的脱脂奶粉的tbst液中(方皿中)，置于摇床上摇动封闭1h，1h后将封闭液倒掉，将一抗(proteinfindgoatanti-gfpmousemonoclonalantibody，ht801)用10ml含有5％的脱脂奶粉的tbst稀释至适当浓度(1/5000稀释)倒入刚才的方皿中，室温下孵育2h。然后用tbst在室温下在摇床上洗两次，每次10min。然后将1/5000稀释好的hrp标记的二抗稀释液(proteinfind^tmgoatanti-mouseigg(h+l)，hrpconjugate，hs201-01)倒入刚才的方皿中，室温下孵育1h，用tbs液t在室温下摇床上洗两次，每次10min；进行化学发光反应。

(5)化学发光成像

在干净的实验台面上铺一层透明包花玻璃纸，将nc膜正面朝上放在玻璃纸上，将化学发光液(tanon^tmhigh-sigeclwesternblottingsubstrate，天能180-501)等体积混匀后均匀撒在nc膜上，左右抖动铺纸10次左右(目的是将底物充分均匀分布在膜上)，盖上盖纸经化学发光底物显色液显色10min进行曝光成像分析。结果如图6所示。免疫印迹结果表明ghpiplc2-2-yfp基因在拟南芥中进行了表达。挑选出了蛋白表达水平较高的oe-11和oe-15株系用于后续实验分析。

4、转基因拟南芥的耐盐性

4.1盐胁迫下转基因拟南芥的萌发率

将转基因oe-11、oe-15株系种子与野生型(col-0)拟南芥种子经消毒液消毒后，分别播种于1/2ms培养基和含150mmnacl的1/2ms培养基中，春化3d，放置于光照培养箱内，分别于播种后的0、24、36、48、60、72、84h统计萌发率并进行统计分析。

结果表明，在1/2ms培养基中点播后60h，拟南芥各株系的萌发率接近100％，表明实验所用拟南芥的种子质量良好，均能萌发。在150mmnacl的1/2ms培养基中点播后84h后，拟南芥各株系的萌发率不再增加，株系oe-11、oe-15的萌发率分别只有野生型拟南芥的50.49％和29.83％，且过表达株系oe-11、oe-15拟南芥较野生型拟南芥相比萌发延迟1d(图7)。因此，ghpiplc2-2基因对盐胁迫敏感，敲除该基因将能显著提高植物的耐盐性。

4.2、盐胁迫下拟南芥根系的生长

将转基因oe-11、oe-15株系的拟南芥种子与野生型拟南芥(col-0)种子灭菌后，分别播种于1/2ms培养基和含150mmnacl的1/2ms培养基中，春化3d后，放置于光照培养箱内，竖直生长7d后，分别统计各株系拟南芥主根的长度。

结果表明，在1/2ms培养基中竖直生长7d后，株系oe-11、oe-15和野生型植株的主根长度在20.46～24.27mm之间，野生型对照与过表达株系主根长度差异不显著(图8)。在150mmnacl的1/2ms培养基中竖直生长7d后，株系oe-11、oe-15和野生型植株的主根长度在7.21～10.69mm之间，野生型对照与过表达株系主根长度差异显著，其中株系oe15的主根长度为野生型对照的82.51％，株系oe11的主根长度为野生型对照的67.45％(图8)。因此，转ghpiplc2-2基因拟南芥种子的主根长度显著低于与野生型拟南芥，ghpiplc2-2基因对盐敏感，推测敲除该基因将能显著提高拟南芥的耐盐性。

4.3盐胁迫下拟南芥的生物量

将野生型拟南芥种子与转基因oe-15株系种子经消毒液消毒后，播种于1/2ms培养基，光照培养箱萌发生长7d后移苗至蛭石中，置于温室中培养(培养条件：光照强度为120μmolm^-2s^-1、温度为22℃，相对湿度为40％，光周期为16h光照、8h黑暗)。拟南芥小苗生长至4周大时用200mmnacl进行盐胁迫处理，胁迫处理5d后测定植株生物量。

结果表明，在正常生长条件下，oe-15株系拟南芥单株鲜重为0.1933±0.0153g，野生型株系单株鲜重为0.2000±0.010g，二者生物量差异不显著。在200mmnacl处理5d后，oe-15株系叶片表现出明显的盐害症状，长势显著弱于野生型对照(图9)。oe-15株系拟南芥单株鲜重为0.0783±0.0044g，株系oe-15的单株生物量只有野生型对照的47.46％(图10)。因此，转ghpiplc2-2基因拟南芥对盐胁迫表现更为敏感，敲除该基因将能显著提高植物的盐抗性。

序列表

<110>山东大学

<120>陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2及其应用

<141>2019-11-20

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1737

<212>cdna

<213>棉花

<221>陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2的核苷酸序列

<400>1

atgtccaaacaaacttacagggtttgtttctgcttccagaggaggtttaggctggcagtt60

tcggaggcaccggaggatatcaagaaactgttcgaacaatactccgagaatgggataatg120

accattgatgggctgcagaggttcttggtcgaggttcagaaagaagataaggctaccaga180

gaagatgctcagaagattattgatagtgttaaacattttcatagaaagggtgtaaacctc240

gaagctttttttaagtacctctttggtgatattaatcctcctcttgcttctcttggggtt300

caccatgatatgagtgctcctttgtcacattatttcatatatactggtcacaattcttac360

cttactgggaaccaactcagtagtgagtgcagtgatgtccccatcataaatgctcttaag420

agaggtgtgcgggtgatagaattggatatatggccgaattcgacgaaagatgatgtcgat480

gttcttcatggagggacattgactactccggtggaactcatcaagtgtttgaggtctatt540

aaagagtatgcttttgtagcctcagaatatccggttgtcataactctggaagatcacctt600

acgccaaagcttcaggctaaagttgctgagatggtcactcaaacatttggagagatcttg660

ttttctcctggcccggaatgcttcaaagagttcccctgtccagaatcattgaagagacgc720

ataatcatatctacaaaaccgccaaaggaatacttggaggcgaaagaagttaaggataaa780

gaggatgattcacaacggggtaaggccagtgatgaagaagcttggggaaatgaagttccg840

gaccttaaaggcagtcatgtagccaattacaagaatgatttcgatgaagaagatgaggaa900

gatacagatgatggagaaaagtcgcagcattctctagccccagaatataaacatttaatc960

ggcattcttgccgggaagcccaagggtggatttgattcgtggctaagggtggatcctgat1020

aaagtgacacgtcttagcatgagtgagcaaaaatttgaaaaggctgtagtaactcatgga1080

aaacaaattgtaaggtttacgcggcagaatgttcttcgggtgtatccgaagagtactcgt1140

tttgactcgtcgaattacaacccactaattggctggatgcatggagttcaaatggttgca1200

tttaatatgcagggtcacggaagatccttatggttgatgcatggaatgttcaaagccaat1260

gggggatgtggttatgtgaaaaagccagattttctattgaactctatggaagtctttgat1320

ccgaaaatcaagttaccagtgaaaacaactttgaaggtgactgtgtatatgggagaagga1380

tggtattatgatttccatcacacccattttgatgcgtattcaccaccagacttttacacg1440

agggtggggattgcaggagttccagcagactcagtaatgaaaaaaacaaagattttagaa1500

gataactggttgccttcctggaatgaggtgtttgagttccctttaactgtccctgaactg1560

gctctacttcggattgaagttcatgaatacgacatgtctgaaaaggatgactttggaggc1620

caaacatgtcttccgatttccgagctaagaagtgggatccgagcagtgcccctttacagc1680

cggaagggtgaaaaatacaattccgttaagctccttatgcactttgaattcatctag1737

<210>2

<211>578

<212>prt

<213>人工序列

<221>陆地棉磷脂酰肌醇特异的磷脂酶c基因ghpiplc2-2编码的氨基酸序列

<400>2

mskqtyrvcfcfqrrfrlavseapedikklfeqysengimtidglqrflvevqkedkatr60

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