含有4－羟基丁酸酯单元的聚酯的制作方法

本发明涉及含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元且具有高分子量的聚酯。

背景技术：

大多微生物在其生物体内积累聚羟基脂肪酸酯(pha)作为能量来源、碳源储藏物质。已知在碳源充足而氮、磷、硫、氧、镁等营养元素受限时，会发生pha的积累。pha是热塑性的聚酯，作为生物分解性、生物体适应性的塑料受到瞩目，进行着大量的研究(非专利文献1)。构成pha的单体单元已知有100种以上，最有代表性的物质为由(r)－3－羟基丁酸酯(以下，简称为3hb)构成的聚－3－羟基丁酸酯(以下，简称为p(3hb))(非专利文献1)。

p(3hb)具有与聚丙烯(以下，简称为pp)相同程度的高熔点，破坏强度也与pp为相同程度，但是断裂伸长率为5％以下，结晶性高，是硬而脆的材料。想要在工业上利用pha时，作为提高其物性的方法，有导入第二成分单体单元来共聚物化的方法、增大分子量的方法。

作为导入第二成分单体单元来共聚物化的方法，可以列举导入了4－羟基丁酸酯(以下、4hb)的共聚物(以下，简称为p(3hb－co－4hb))(非专利文献2)作为一例。

另外，作为增大分子量的方法，有如下方法，即向不具有pha合成系统、分解系统的大肠杆菌escherichiacolixl1－blue导入取自p(3hb)合成细菌杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)的p(3hb)生物合成基因(phacab)，将该基因重组菌在ph6培养来制造超高分子量p(3hb)(非专利文献3)。

生产p(3hb)的野生株的p(3hb)的重均分子量mw据说通常有50万～150万左右，也有20万～200万左右，还有1万～300万左右，野生型的微生物由于在菌体内具有大量的分解酶，因此难以合成mw为300万以上的超高分子量体p(3hb)。另外研究发现p(3hb)被微生物作为能量来源、碳源储藏物质积累，因此，在大量微生物中在碳源耗尽时被分解使用。但是，也举出了显示同时发生pha的合成和分解的例子。同时发生pha的合成和分解的生理学意义尚未阐明。另外，生产pha的野生株中由于这样同时发生pha的合成和分解，因此，成为难以合成超高分子量体pha的原因之一。

还大量进行了p(3hb－co－4hb)的制造研究，通过对作为生产p(3hb)的野生株的杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)，添加4－羟基丁酸(4hb)、γ－丁内酯、1,4－丁二醇、1,6－己二醇、1,8－辛二醇、1,10－癸二醇、1,12－十二烷二醇等的碳源进行培养，生产p(3hb－co－4hb)。

还报道了将不是p(3hb)生产野生株的不生产p(3hb)的菌株的大肠杆菌基因重组来生产p(3hb－co－4hb)、p(4hb)的方法。最初，导入从乙酰coa生产p(3hb)所必需的来自杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)的β－酮硫解酶(phaa)、乙酰乙酰coa还原酶(phab)、pha聚合酶(phac)的各基因phaa、phab、phac，并且导入来自克氏梭菌(clostridiumkluyveri)的琥珀酸分解途径的基因(sucd、4hbd、orfz)，由此，能够从琥珀酸提供4hb－coa，在大肠杆菌中以葡萄糖为碳源生产分子量mw为约180万的p(3hb－co－4hb)，但是，pha中的4hb比率低至1.3～1.5％(非专利文献4)。

另外，也报道了在p(3hb－co－4hb)的生产中利用了ε－己内酯或作为其皂化物的6－羟基己酸酯(或其盐)。报道了在将ε－己内酯作为碳源培养杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)时，积累了pha含量为26％至38％，4hb比率为30％至36％的p(3hb－co－4hb)(非专利文献5)，但是没有分子量和力学试验的记载。

另外，报道了高分子量且高弹性的p(3hb－co－4hb)的制造(非专利文献6)，但是破坏强度不充分。

另外，在专利文献1中，记载了一种脂肪族聚酯树脂组合物，其含有聚羟基脂肪酸酯(a)、包含乙酸乙烯酯的共聚物(b)和季戊四醇(c)，其中，聚羟基脂肪酸酯(a)与包含乙酸乙烯酯的共聚物(b)不相容。专利文献1所述的脂肪族聚酯树脂组合物的目的在于改善作为聚羟基脂肪酸酯的缺点的结晶化慢，改善注射成型等成型加工时的加工性，提高加工速度，并且抑制来自所得到的成型体的起霜白化。在专利文献1中，通过配合含有乙酸乙烯酯的共聚物(b)和季戊四醇(c)，并且使聚羟基脂肪酸酯(a)和含有乙酸乙烯酯的共聚物(b)不相容，来实现上述目的。专利文献1中，对于用于提供能够制造破坏强度高且断裂伸长率高的膜的含有4hb的pha的条件没有进行研究。

在专利文献2中，记载了由纤维集合体和具有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元的聚酯共聚物构成的软组织用医疗用材料。在专利文献2中，记载了3hb-4hb聚酯共聚物的4hb单元含量通常为30～99摩尔％、优选为40～98摩尔％、特别优选为60～95摩尔％。另外，在专利文献3中，在产碱菌属菌的存在下制造由3－羟基丁酸酯单元97～80摩尔％和4－羟基丁酸酯单元3～20摩尔％构成的聚酯共聚物的方法。在专利文献2和3中，也对用于提供能够制造破坏强度高且断裂伸长率高的膜的含有4hb的pha的条件没有进行研究。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开wo2015/098001号

专利文献2：日本特开平7－275344号公报

专利文献3：日本特开平6－181784号公报

非专利文献

非专利文献1：alistairj.andersonetal.，microbiologicalreviews，vol.54，no.4，450－472，1990

非专利文献2：masaokuniokaetal.，macromolecules，vol.22，694－697，1989

非专利文献3：s.kusakaetal.，appliedmicrobiologyandbiotechnology，vol.47，140－143，1997

非专利文献4：henrye.valentinetal.，journalofbiotechnologyvol.58，33－38，1997

非专利文献5：sungchulyoonetal.，koreanjournalofappliedmicrobiologyandbiotechnology，vol.28，no.2，71－79，2000

非专利文献6：kai－heehuongetal.，journalofbioscienceandbioengineering，vol.124，no.1,76－83，2017

技术实现要素：

发明所要解决的技术问题

能够期待pha的共聚物化和高分子量化改善pha的物性。p(3hb)具有硬且脆的物性，即使与3－羟基戊酸酯(3hv)单元共聚化也发生共结晶化，因此，几乎无法期待物性的改善。但是，包含4hb单元、3－羟基己酸酯(3hh)单元等与3hb单元不共结晶化的第二成分单元的共聚pha通过使其第二单元成分的比率发生变化则可以预期大幅改善物性。特别是，包含具有侧链的3hb单元、其它的3－羟基脂肪酸酯的pha不显示脂肪酶降解性，相对于此，使与3hb相比不具有侧链的4hb单元共聚物化得到的p(3hb－co－4hb)已知不仅被pha分解酶酶解而且也被脂肪酶酶解，被期待在生物体内的降解性的提高，作为医疗材料备受期待。但是，仍不知道通过作为使用了一直以来所使用的4hb单元前体的1,4－丁二醇、γ－丁内酯、4hb的利用生产pha的野生株的制造方法，得到4hb比率为14摩尔％～40摩尔％并且重均分子量mw为125万以上的p(3hb－co－4hb)共聚物的方法。使用基因重组菌(delftiaacidovorans，食酸戴尔福特菌)时，报道了生产重均分子量mw247万、数均分子量mn48万的p(4hb)。也有用基因重组大肠杆菌生产分子量180万的p(3hb－co－4hb)的报道，但是4hb比率仅为1.3～1.5％。

如上所述，仍未知可以期待大幅改善物性的例如4hb比率为14摩尔％～40摩尔％并且重均分子量mw为125万以上的p(3hb－co－4hb)共聚物的制造方法。

生产pha的野生株根据需要分解利用所积累的pha，在细胞内具有pha分解酶，因此，被认为难以合成超高分子量pha，另外，可以理解，经过培养期间，pha的分子量逐渐减少是一般的现象。

在将pha用作医疗材料时，使用以除去内毒素为代表的高度纯化技术，但是一般越高度进行纯化则存在pha越分解、分子量越低的趋势。另外，通过施加加热熔融等热处理，也会发生分子量降低，因此，在纯化后或制品化后pha的分子量需要为高分子量的情况下，要求在纯化前的培养阶段中具有充分高的分子量。即使不作为医疗材料而用作一般工业品，也必须要进行某种程度的纯化工序，为了提高纯化后pha的物性也要求具有更高的分子量。因此，要求在培养阶段得到比现有分子量高的pha的方法。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种破坏强度高、断裂伸长率高的高分子量体的含有4hb的pha。

用于解决技术问题的方法

本发明的发明人为了解决上述技术问题，进行了深入研究，结果发现，即使是不使用基因重组的生产pha的野生株也可以得到各种分子量的p(3hb－co－4hb)，特别是重均分子量125万以上且4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％的p(3hb－co－4hb)显示优异的物性。本发明是鉴于上述发现完成的。

即，根据本发明，提供以下的发明。

(1)一种聚酯，其中，通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为125万以上，作为聚合单元至少含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元，4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％。

(2)如(1)所述的聚酯，其中，通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为138万以上。

(3)如(1)或(2)所述的聚酯，其中，通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为180万以上。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的聚酯，其中，通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量为30万以上。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的聚酯，其中，聚合单元仅由3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元构成。

(6)如(1)～(5)中任一项所述的聚酯，其为无规聚合物。

(7)含有(1)～(6)中任一项所述的聚酯的膜。

发明的效果

根据本发明所提供的重均分子量为125万以上、4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％的p(3hb－co－4hb)显示优异的物性。

附图说明

图1表示实施例8的pha的¹h－nmr图谱。

图2表示实施例8的pha的¹³c－nmr图谱。

图3表示实施例9的pha的¹h－nmr图谱。

图4表示实施例9的pha的¹³c－nmr图谱。

图5表示实施例8的含有pha的菌体的pha组成分析(gc－fid色谱)。

图6表示图5的色谱中所示的各峰的鉴定结果(gc－ms图谱)。

图7表示图5的色谱中所示的各峰的鉴定结果(gc－ms图谱)。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

[聚酯]

本发明的聚酯的通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为125万以上，作为聚合单元至少含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元，4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％。

如上所述，本发明的聚酯的特征之一在于，通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量(mw)为125万以上这样的高分子量。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量优选为138万以上，更优选为180万以上，进一步优选为190万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量可以为200万以上、210万以上、220万以上、230万以上、240万以上、250万以上、260万以上、270万以上、280万以上、290万以上、300万以上、310万以上、320万以上、330万以上、340万以上、350万以上、360万以上、370万以上、380万以上、390万以上或400万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量的上限没有特别限定，一般而言，为2000万以下，可以为1000万以下、800万以下、700万以下、600万以下或500万以下。通过使聚酯的重均分子量为125万以上，能够制造具有高的破坏强度的膜。

p(3hb－co－4hb)已知具有伸长性且柔软，本发明发现，重均分子量为125万以上的情况下、优选重均分子量超过300万的超高分子量体的情况下，在具有伸长性的同时，破坏强度也提高。

本发明的聚酯优选通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量(mn)为30万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量可以为35万以上、40万以上、45万以上、50万以上、55万以上、60万以上、65万以上、70万以上、75万以上、80万以上、85万以上、90万以上、95万以上或100万以上。通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的数均分子量的上限没有特别限定，一般而言，为1000万以下，可以为500万以下、400以下、300万以下或200万以下。

mw相对于mn的比率(mw/mn)没有特别限定，优选为1.0～10.0，更优选为1.0～8.0，进一步优选为1.0～7.0、1.0～6.0、1.0～5.0，更进一步优选为1.0～4.0。

通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量的测定能够与后述的实施例记载的方法同样地进行。

本发明的聚酯中至少含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元作为聚合单元。即，本发明的聚酯可以是仅含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元作为聚合单元的聚酯(即，聚合单元仅由3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元构成)，或者，也可以含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元作为聚合单元，进一步含有上述以外的其他聚合单元。作为上述的其他聚合单元，能够列举乳酸酯(la)、乙醇酸酯(ga)、3－羟基丙酸酯(3hp)、3－羟基戊酸酯(3hv)、5－羟基戊酸酯(5hv)、5－羟基己酸酯(5hh)、6－羟基己酸酯(6hh)或3－羟基己酸酯(3hh)、或者碳原子数7以上的羟基脂肪酸酯等。

在本发明中，3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元分别由下式表示。

3－羟基丁酸酯单元：－och(ch3)ch2c(＝o)－

4－羟基丁酸酯单元：－och2ch2ch2c(＝o)－

本发明的聚酯的特征之一在于4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％。

4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例可以为15摩尔％以上、16摩尔％以上、17摩尔％以上、18摩尔％以上、19摩尔％以上或20摩尔％以上，也可以为20.2摩尔％以上、20.6摩尔％上、21摩尔％以上、22摩尔％以上、23摩尔％以上、24摩尔％以上、25摩尔％以上、26摩尔％以上、27摩尔％以上或28摩尔％以上。

4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例可以为35摩尔％以下、34摩尔％以下、33摩尔％以下、32摩尔％以下、31摩尔％以下、30摩尔％以下、29.9摩尔％以下、29.8摩尔％以下、29摩尔％以下、28摩尔％以下、27摩尔％以下、26摩尔％以下或25摩尔％以下。

4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例优选为20.2摩尔％以上、20.6摩尔％上、21摩尔％以上、22摩尔％以上、23摩尔％以上、24摩尔％以上或25摩尔％以上，并且为29.9摩尔％以下、29.8摩尔％以下、29摩尔％以下、28摩尔％以下或27摩尔％以下。作为4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例的一例，为21摩尔％以上29摩尔％以下。

在使聚酯的重均分子量为125万以上时，在4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％这样的范围中，确认到伴随着4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例增加，所制造的膜的断裂伸长率也增大的趋势。在本发明中，通过组合使聚酯的重均分子量为125万以上这样的特征与4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％这样的特征，能够实现兼顾高的破坏强度和高的断裂伸长率。

4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例能够根据后述实施例中记载的方法进行测定。

本发明的聚酯可以为无规聚合物、嵌段聚合物、交替聚合物或接枝共聚物的任一种，优选为无规聚合物。

[聚酯的制造方法]

本发明的聚酯能够通过在作为碳源的ε－己内酯(别名6－己内酯)、或其皂化物的6－羟基己酸酯或其盐的存在下培养具有p(3hb)生产能力的微生物来制造。

作为具有p(3hb)生产能力的微生物，能够使用属于贪铜菌属(cupriavidus属)、产碱菌属(alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(ralstonia属)、戴尔福特菌属(delftia属)、丛毛单胞菌属(comamonas属)、氢噬胞菌属(hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(burkholderia属)、埃希氏菌属(escherichia属)、固氮菌属(azotobacter属)、甲基杆菌属(methylobacterium属)或副球菌属(paracoccus属)、不动杆菌属(acinetobacter属)、气单胞菌属(aeromonas属)、异着色菌属(allochromatium属)、固氮根瘤菌属(azorhizobium属)、芽孢杆菌属(bacillus属)、柄杆菌属(caulobacter属)、色杆菌属(chromobacterium属)、外硫红螺菌属(ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(klebsiella属)、诺卡氏菌属(nocardia属)、假单胞菌属(pseudomonas属)、红细菌属(rhodobacter属)、红球菌属(rhodococcus属)、红螺菌属(rhodospirillum属)、立克次氏体属(rickettsia属)、中华根瘤菌属(sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas属)、集胞藻菌属(synechocystis属)、硫球菌属(thiococcus属)、囊硫菌属(thiocystis属)、弧菌属(vibrio属)和沃特氏菌属(wautersia属)的微生物。上述之中，优选贪铜菌属(cupriavidus属)，更优选杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)。作为一例，能够使用杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)h16株(atcc17699)。

此外，杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)h16株野生株中，3hb、3hv、4hb、5hv等能够充分组合入pha中，但如果使用导入了底物特异性不同的pha聚合酶基因的基因重组菌，其它的羟基酸也能够与pha聚合。因此，不仅是杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)h16株，也能够使用其它的基因重组株、如上所述的其它的贪铜菌属(cupriavidus属)、产碱菌属(alcaligenes属)、罗尔斯通氏菌属(ralstonia属)、戴尔福特菌属(delftia属)、丛毛单胞菌属(comamonas属)、氢噬胞菌属(hydrogenophaga属)、伯克氏菌属(burkholderia属)、埃希氏菌属(escherichia属)、固氮菌属(azotobacter属)、甲基杆菌属(methylobacterium属)、副球菌属(paracoccus属)、不动杆菌属(acinetobacter属)、气单胞菌属(aeromonas属)、异着色菌属(allochromatium属)、固氮根瘤菌属(azorhizobium属)、芽孢杆菌属(bacillus属)、柄杆菌属(caulobacter属)、色杆菌属(chromobacterium属)、外硫红螺菌属(ectothiorhodospira属)、克雷伯氏菌属(klebsiella属)、诺卡氏菌属(nocardia属)、假单胞菌属(pseudomonas属)、红细菌属(rhodobacter属)、红球菌属(rhodococcus属)、红螺菌属(rhodospirillum属)、立克次氏体属(rickettsia属)、中华根瘤菌属(sinorhizobium属)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas属)、集胞藻菌属(synechocystis属)、硫球菌属(thiococcus属)、囊硫菌属(thiocystis属)、弧菌属(vibrio属)和沃特氏菌属(wautersia属)等具有聚合pha的能力、或者赋予聚合pha能力的微生物。

培养液的ph一般而言为约4～约10，优选为约5～约8，更优选为约5.8～约7.5。

培养温度一般而言为15℃～45℃，优选为20℃～40℃，更优选为25℃～38℃。

培养方式可以为分批培养、流加培养或连续培养的任意一种。

培养基成分只要是使用的微生物能够利用(同化)的物质即可，没有特别限制。

作为碳源，例如，能够使用甲醇、乙醇、丁醇、乙酸或丁酸等有机碳源、二氧化碳等无机碳源、酵母提取物、糖蜜、蛋白胨和肉提取物等的天然物、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖等的糖类、或山梨糖醇、甘露醇和肌醇等。

作为氮源，例如，能够使用氨、铵盐(氯化铵、硫酸铵、磷酸铵)、硝酸盐等的无机氮化合物和/或例如尿素、玉米浆、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、肉提取物等有机含氮物。

作为无机成分，例如，可以分别选自钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐、镍盐、铬盐、硼化合物和碘化合物等，更具体而言，可以列举磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。

作为除此以外的有机营养源，例如，可以列举甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸；维生素b1、维生素b12、维生素c等维生素等。

作为制造含有4hb的pha的方法，有：对生产pha的野生株添加能够成为4hb－coa的前体进行培养的方法；以及通过基因重组导入4hb－coa的供给路径的方法。在本发明中，在采用对生产pha的野生株添加能够成为4hb－coa的前体进行培养的方法时，优选使用目前周知的4hb、γ－丁内酯、不为碳原子数4以上的偶数二元醇的ε－己内酯或6－羟基己酸酯或其盐(例如，6－羟基己酸钠、6－羟基己酸钾)。

3hb－coa利用β酮硫解酶(phaa)从2个乙酰coa转变为乙酰乙酰coa，进一步利用乙酰乙酰coa还原酶(phab)转变为3hb－coa，3hb－coa利用pha聚合酶(phac)聚合为p(3hb)。合成由短链单元(碳原子数3～5)构成的pha的大多细菌具有针对这3种酶的基因phaa、phab、phac，具有从糖、油脂类、醇等碳源的代谢所产生的乙酰coa合成p(3hb)的能力。这样的细菌在存在丙酸时，从乙酰coa和丙酰coa缩合还原而供给3hv－coa，从而3hb－coa和3hv－coa同时存在，积累p(3hb－co－3hv)。也从戊酸(吉草酸)或戊醇供给3hv－coa，作为3hv单元组合入pha。

另外，在存在成为4hb－coa的前体的4hb本身、γ－丁内酯、1,4－丁二醇、1,6－己二醇、1,8－辛二醇、1,10－癸二醇等时，供给4hb－coa，则3hb－coa和4hb－coa同时存在，积累p(3hb－co－4hb)。

碳原子数6以上的偶数二元醇通过β氧化系生成乙酰coa，同时也生成4hb－coa。

使用4hb、γ－丁内酯、1,4－丁二醇、1,6－己二醇、1,8－辛二醇、1,10－癸二醇等的目前的p(3hb－co－4hb)的合成(appl.microbiol.biotechnol.(1989)，30，569－573、以及polymerinternationalvolume39，issue3，pages169－174，march1996)时无法得到高分子量体，在确保良好物性的情况下工业化时存在问题。

在培养中添加ε－己内酯时，ε－己内酯开环，成为6－羟基己酸酯(6hh)，加成coa成为6hh－coa，通过β氧化系脱除乙酰coa剩下4hb－coa，组合入pha则成为4hb单元。由于pha聚合酶的底物特异性，6hh－coa难以被组合入pha中，而积累p(3hb－co－4hb)。

如果4hb－coa也受到β氧化，则也生成乙酰coa。

在伸长中的pha聚合酶的酶－s－pha复合体中进入具有羟基的化合物，将酶与pha聚合物链间的硫酯键切断，pha聚合物链从酶移动到链转移剂，pha聚合停止，这样的反应称为仿效自由基聚合的链转移反应。4hb、二元醇类是具有羟基的化合物，γ－丁内酯也开环成为4hb，因此，这些具有羟基的化合物发挥作为pha聚合时的链转移剂的作用，有可能导致pha的聚合停止。特别是二元醇类的末端的2个羟基的任一个均能够参与链转移，特别容易引发pha聚合的停止，由此认为难以得到高分子量体pha。

ε－己内酯开环则生成6hh，也会最终成为具有羟基的化合物。pha聚合酶的底物中4hb－coa还可以使用，但6hh－coa难以成为底物，就像这样一样，6hh与4hb相比更难以作为链转移剂发挥作用，因此可以认为，在使用ε－己内酯时可以得到更高分子量的pha。

在利用微生物的物质生产中，有增殖联动生产和非增殖联动生产。

增殖联动的pha生产中，pha以外的菌体成分增殖，同时也积累pha。增殖联动的pha生产中，乙酰coa被pha合成和菌体增殖的双方争夺，乙酰coa不易剩余。增殖联动的pha生产期间，也抑制由于pha的分解产生游离的羟基酸，推测不易发生链转移反应，推测分子量变得相对较高。

非增殖联动的pha生产中，在菌体成分的增殖停止之后，发生pha的积累，pha含量增加。由于菌体增殖停止，过剩的乙酰coa用于pha生产。非增殖联动的pha生产期间，暂时组合入pha的成分再度分化，将游离的羟基酸排到菌体内外。在培养的后期，在氮源耗尽时，从增殖联动生产转移至非增殖联动生产，链转移反应也频繁发生，推测成为容易同时发生合成和分解的状态(分子量容易降低的状态)。

在本发明中发现，增殖联动地积累pha时，与在营养限制状态下非增殖联动地积累pha时相比，优先积累高分子量的pha。即，在本发明的聚酯的制造中，期望不是分为菌体的增殖和pha的积累的营养限制下的非增殖联动的pha生产，而是同时发生菌体的增殖和pha的积累的增殖联动的pha生产。

从根据本发明的方法进行培养得到的培养液通过过滤和离心分离等通常的固液分离方法分离回收菌体，清洗该菌体，进行干燥，能够得到干燥菌体。能够从该干燥菌体通过常规方法例如用氯仿这样的有机溶剂提取生成的聚酯，在该提取液中，例如，通过添加己烷这样的贫溶剂，使本发明的聚酯沉淀，进行回收。

[膜]

根据本发明，还提供含有上述的本发明的聚酯的膜。

本发明的膜的制造方法没有特别限定，能够通过溶液浇铸法、熔融挤出成型法等的常规方法进行造膜来制造膜。

本发明的膜的破坏强度优选为18n/mm²以上，可以为19n/mm²以上、20n/mm²以上、21n/mm²以上、22n/mm²以上、23n/mm²以上、24n/mm²以上、25n/mm²以上、26n/mm²以上、27n/mm²以上、28n/mm²以上、29n/mm²以上或30n/mm²以上。破坏强度的上限没有特别限定，一般而言，为100n/mm²以下，可以为50n/mm²以下。

破坏强度根据iso527－1、jisk7161进行测定。

本发明的膜的断裂伸长率优选为300％以上，可以为400％以上、460％以上、470％以上，为480％以上、490％以上或500％以上。断裂伸长率的上限没有特别限定，一般而言，为1000％以下，可以为900％以下、800％以下或700％以下。

断裂伸长率根据iso527－1、jisk7161进行测定。

本发明的膜的弹性率优选为240n/mm²以上，可以为250n/mm²以上、270n/mm²以上、300n/mm²以上、350n/mm²以上、400n/mm²以上、450n/mm²以上或500n/mm²以上。弹性率的上限没有特别限定，一般而言，为1000n/mm²以下，可以为900n/mm²以下或800n/mm²以下。

弹性率根据iso527－1、jisk7161进行测定。

使聚酯的重均分子量为125万以上时，具有弹性率容易受4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例影响的趋势。即，在4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％这样的范围中，确认到伴随4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例增加，所制造的膜的弹性率降低的趋势。

具有上述物性的膜能够通过将由本发明提供的“通过凝胶渗透色谱分析测得的以聚苯乙烯换算的重均分子量为125万以上且至少含有3－羟基丁酸酯单元和4－羟基丁酸酯单元作为聚合单元、4－羟基丁酸酯单元相对于全部单体单元的比例为14摩尔％～40摩尔％的聚酯”进行造膜来得到。

在制造本发明的膜时，将由本发明提供的聚酯进行造膜即可，不需要配合包含乙酸乙烯酯的共聚物和/或季戊四醇。即，作为本发明的膜的一个实施方式，能够列举含有由本发明提供的聚酯、不含包含乙酸乙烯酯的共聚物、并且不含季戊四醇的膜。

本发明的膜具有上述优异的物性，并且由生物分解性和生物体适应性优异的p(3hb－co－4hb)构成，在医疗用器具、食品及其它的包装材料、农业用塑料片材、育苗用的盆、建设土木用片材等中有用。

利用以下的实施例对本发明进一步具体说明，但是，本发明不特别限定于以下实施例。

实施例

[聚合物的制造(发酵罐培养)]

＜实施例1＞

使用杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)h16株(atcc17699)制造pha。

在含有kh2po42.72g/l、na2hpo44.26g/l、nahco30.3g/l、(nh4)2so42g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、酵母提取物0.2g/l、下述矿物质溶液3.5ml的灭菌后的培养基1中，添加果糖14.24g/l，用所得到的培养基在30℃进行24小时试管振动培养，得到前前培养液。

矿物质溶液：在水中溶解有fec6h5o7·xh2o6g/l、znso4·7h2o2g/l、cuso4·5h2o0.1g/l、mncl2·4h2o1g/l、ki0.1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.1g/l、cocl2·6h2o0.1g/l、h3bo30.2g/l、nacl5g/l、cacl2·2h2o4g/l。

在加入有在上述培养基1中添加有果糖14.24g/l的培养基、或者添加有果糖8.86g/l和ε－己内酯5.38g/l的培养基100ml的500ml容积的三角烧瓶中，接种上述前前培养液1ml，在30℃、150rpm培养48小时至96小时培养，得到培养主母(前培养液)。

将上述培养基1的(nh4)2so4变更为12.5g/l后的培养基在3l容积发酵罐中准备2l并灭菌，接种培养主母100ml，经由灭菌过滤器(ptfe0.2μm孔)将42质量％果糖和ε－己内酯无菌地开始流加。碳源的流加速度和流加比率能够任意设定，但是如果碳源被菌体消耗不完就会在培养槽内过剩残留，菌体增殖会停止，为了避免这样的情况，以42质量％果糖的流加速度为1～2g/h左右(0.5～1g/h·l)、ε－己内酯的流加速度为0.2～0.5g/h(0.1～0.25g/h·l)左右这样的低流速开始培养，根据菌体的增殖，阶段性或者连续性地增加流加速度。控制通气量为0.2～0.3l/min、搅拌速度为500～700rpm、培养温度为36℃、培养ph下限为6.0，使用12.5％氨水作为ph调整用碱。ε－己内酯：果糖的比率为约0.5。在培养开始后100小时结束培养。

培养后，通过离心分离回收菌体，在－20℃冻结后，供于冻结干燥。

从菌体提取纯化pha的方法如下所述进行。在带有螺纹盖的玻璃制三角烧瓶中，使冻结干燥菌体4～10g左右悬浮在400ml氯仿中，在30℃提取24～48小时。将得到的粘稠的溶液用滤纸过滤，除去菌体残渣。将所得到的澄清液用蒸发器浓缩为100～200ml左右，用5倍量的作为贫溶剂的己烷使pha析出。用乙醇清洗所得到的白色沉淀物之后，使其真空干燥，得到纯化pha。

＜实施例2＞

使发酵罐培养中的培养温度为34℃、培养时间为112.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例3＞

使发酵罐培养中的培养温度为30℃，使用将(nh4)2so4变更为15g/l的培养基，培养时间为149小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例4＞

使用将发酵罐培养中的(nh4)2so4变更为10g/l的培养基，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例5＞

使用发酵罐培养中的(nh4)2so4变更为15g/l的培养基，使培养时间为184.8小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例6＞

使发酵罐培养中的ε－己内酯：果糖的比率为0.7、培养时间为113.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例7＞

使发酵罐培养中的培养时间为112小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例8＞

使用将发酵罐培养中的(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，作为ph调整用碱使用4nnaoh溶液，使培养时间为122.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例9＞

使发酵罐培养中的培养温度为37℃，使用将(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，作为ph调整用碱使用4nnaoh溶液，使培养时间为102.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例10＞

使发酵罐培养中的ε－己内酯：果糖的比率为0.4、培养时间为94.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例11＞

使发酵罐培养中的培养温度为37℃，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例12＞

使发酵罐培养中的培养温度为38℃，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例13＞

使发酵罐培养中的培养温度为38℃，使用将(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，使培养时间为114.3小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例14＞

使发酵罐培养中的培养温度为38℃，使用将(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，作为ph调整用碱使用4nnaoh溶液，使培养时间为114.3小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例15＞

使用将发酵罐培养中的(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，对42质量％果糖溶液添加25g/l的乙酸钠，使培养时间为122.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例16＞

使用将发酵罐培养中的(nh4)2so4变更为17.5g/l的培养基，代替ε－己内酯，使用γ－丁内酯，使培养时间为185.8小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜实施例17＞

在将培养基1的(nh4)2so4变更为2.5g/l且添加有nacl3g/l的培养基中，添加果糖8.86g/l和ε－己内酯5.38g/l，将所得到的培养基125ml加入500ml容积的三角烧瓶，在该三角烧瓶中，接种试管培养前培养液1ml，在30℃、150rpm培养96小时。与实施例1同样进行菌体的回收、pha的提取纯化。

＜比较例1＞

使发酵罐培养中的培养温度为30℃，使用将(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，使培养时间为136.5小时，除此以外，与实施例1同样进行。

＜比较例2＞

使发酵罐培养中的培养温度为36℃，使用将(nh4)2so4变更为7.5g/l的培养基，使用γ－丁内酯代替ε－己内酯，作为ph调整用碱使用2nnaoh溶液，使培养时间为108小时，除此以外，与实施例1同样进行，将提取得到的pha在脱湿脱氧状态(三菱瓦斯化学制rp袋)中在25℃保存6个月。

＜比较例3＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在湿度100％、40℃，保存1个月。

＜比较例4＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在湿度100％、25℃保存6个月。

＜比较例5＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在脱湿脱氧状态(三菱瓦斯化学制rp袋)下在60℃保存3个月。

＜比较例6＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在脱湿脱氧状态(三菱瓦斯化学制rp袋)下在60℃保存6个月。

＜比较例7＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在湿度100％、40℃保存6个月。

＜比较例8＞

将比较例2中培养提取而制得的pha样品在湿度100％、60℃保存1个月。

[聚合物的分析]

＜1h－nmr和13c－nmr＞

各实施例和比较例中制造的纯化pha的组成分析和链分析使用核磁共振分光装置(日本分光eca500)来确定。将纯化的pha以1.5质量％浓度溶解于cdcl3，制成测定样品。¹h－nmr图谱以500mhz、¹³c－nmr图谱以125mhz在室温测量。

在下述表3表示对各实施例和比较例的pha利用nmr测得的4hb比率。

在图1和图2中表示实施例8的pha的¹h－nmr和¹³c－nmr。

在图3和图4中表示实施例9的pha的¹h－nmr和¹³c－nmr。

在下述表1中表示由¹h－nmr分析结果得到的pha的组成分析的结果。

在下述表2中表示由¹³c－nmr分析结果得到的链分析结果。

实施例中制造的聚合物为无规聚合物。

[表1]

[表2]

＜pha组成分析(gc法)＞

菌体中所含的pha如下所述进行利用gc法的组成分析。在带有螺纹盖的试管中量取所得到的干燥菌体约10mg，混合氯仿2ml和加有内部标准的甲醇硫酸混合液(内部标准：苯甲酸0.5g/l、硫酸3.7质量％)2ml，在121℃进行90分钟加热处理，冷却至室温，将pha甲酯化。反应结束后添加1ml纯水，剧烈搅拌后，进行离心分离，得到有机溶剂层。将该有机溶剂层用硫酸钠在脱水后气相色谱层析进行分析，算出pha成分含量。gc条件如下所述。

气相色谱分析条件

装置：岛津gc－2025

毛细管柱：db－1(0.25mm(id)×60m、膜厚1μm)

载气：he(3.23ml/min)

柱温：125℃6.5min－rate25℃/min－260℃

尾吹气流量：30ml/min

h2流量：40ml/min

空气流量：400ml/min

进样温度：250℃

检测器：fid(260℃)

分流：1：20

进样量：1μl

分析时间：21.5分钟

在图5表示gc－fid中典型的色谱(实施例8中制造的pha)。

将含有4hb的pha或者含有该pha的干燥菌体甲酯化，进行使用高分辨率的毛细管柱的gc－fid分析时，产生多个来自3hb和4hb的峰。因此，使用gc－ms(岛津制作所制gcms－qp2010plus)进行各峰的鉴定。gc条件与之前的gc－fid相同。在图6和图7中表示各峰的鉴定结果。

＜pha分子量测定(凝胶渗透色谱(gpc)法)＞

pha分子量的测定如下所述利用凝胶渗透色谱法进行。在下述表3中表示对于各实施例和比较例的pha测定分子量的结果。

对纯化的pha添加氯仿使其为约0.5mg/ml，在60℃溶解4小时后，恢复至室温，用孔径0.2μm的ptfe过滤器过滤，除去不溶物，作为测定样品。gpc条件如下所述。

装置：岛津制作所制hplcprominence系统

色谱柱：昭和电工制shodexk－806l(2根串联)

柱温：40℃

流动相：氯仿(1ml/min)

检测器：ri(40℃)

标准：shodex聚苯乙烯分子量标准(687万～1270)

进样量：60μl

分析时间：30分钟

[pha膜的制作(溶液浇铸法)]

在200ml的氯仿中溶解5g的pha(各实施例和各比较例的pha)，流入18cm见方的玻璃底的平坦容器中，使氯仿缓慢蒸发，制作溶液浇铸膜。制得厚度约0.1～0.2mm的膜。氯仿蒸发后，从容器剥离膜，真空干燥2周以上，用于拉伸试验。

[拉伸试验方法]

溶液浇铸膜冲裁为jisk7127类型5的形状的试验用哑铃，使用autographags－x(株式会社岛津制作所制)，以温度23℃、试验速度100mm/分钟的条件测定膜的破坏强度、断裂伸长率和弹性率。在下述表3中表示测定结果。

[表3]

[聚合物的制造(烧瓶培养)]

＜实施例18～31＞

使用杀虫贪铜菌(cupriavidusnecator)h16株(atcc17699)制造pha。

在含有kh2po42.72g/l、na2hpo44.26g/l、nahco30.3g/l、(nh4)2so42g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、酵母提取物0.2g/l、与实施例1同样的矿物质溶液3.5ml的灭菌后的培养基1中添加果糖14.24g/l，用得到的培养基在30℃进行试管培养24小时，得到前培养液。

将在上述培养基1中添加有果糖8.86g/l和ε－己内酯5.38g/l的培养基(实施例21～33，其中，硫酸铵浓度为表中记载的量)100ml、或者添加有果糖8.86g/l和ε－己内酯6.46g/l的培养基(实施例34，其中，硫酸铵浓度为表中记载的量)100ml加入到500ml容积的三角烧瓶中，在该三角烧瓶中接种上述前培养培养基1ml，以30℃、150rpm培养表中记载的时间。培养开始前的ph为6.8～7.5左右。培养结束后，通过离心分离回收菌体，冻结干燥，测定干燥菌体重量。另外，在下述表4中还一并表示了利用甲酯化后的gc分析得到的pha含量和组成、利用凝胶渗透色谱(gpc法)得到的分子量测定的结果。利用gc法的pha组成分析与实施例1～17和比较例1～8时同样进行。

＜pha分子量测定(gpc法)＞

使用冻结干燥菌体来代替使用纯化的pha，除此以外，与实施例1～17和比较例1～8时同样操作，利用凝胶渗透色谱法进行pha分子量的测定。