本发明涉及一种产聚羟基丁酸羟基戊酸酯的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。
背景技术：
聚羟基丁酸羟基戊酸酯(PHBV)是微生物合成的能源储存性生物聚酯，是绿色环保、性能良好的医用及工业用生物材料，和仅由羟基丁酸单体组成的PHB材料的硬和脆相比，加入了羟基戊酸单体的PHBV材料更柔韧，更具有可塑性，对于其应用于医学和工程领域具有更大的优势，所以现在商品化的聚酯里大部分是PHBV。能够天然合成聚羟基脂肪酸酯(PHA)的微生物，因胞内丙酰辅酶A的缺乏而很少积累PHBV，绝大部分积累的是PHB。
为了实现PHBV在胞内的积累，需要两分子乙酰辅酶A经过PhaA、PhaB的两步催化产生3HB单体，一分子乙酰辅酶A和一分子丙酰辅酶A经过PhaA、PhaB的两步催化产生3HV单体，然后在PhaC的催化下聚合形成PHBV共聚物。由于丙酰辅酶A非常容易通过胞内三羧酸循环转化为乙酰辅酶A，因此丙酰辅酶A的胞内浓度会持续处于比较低的水平，进而影响到3HV单体的胞内合成和PHBV共聚物中3HV的摩尔分数，目前在不添加丙酸盐的微生物PHBV生产菌中，PHBV共聚物中的3HV的摩尔分数处于较低水平。
目前有通过基因工程改造实现PHBV合成的出发菌多为革兰氏阴性菌，如假单胞菌，大肠杆菌等，但应用于食品和医药领域有一定的安全隐患。谷氨酸棒杆菌为食品安全菌，多用来生产氨基酸，较革兰氏阴性菌的安全性较为有保障。此外，目前无论是革兰氏阴性菌，还是谷氨酸棒杆菌，绝大多数是通过添加丙酸盐而实现PHBV的生产，否则在不添加相关碳源的情况下，其产物是PHB而不是PHBV，这会使发酵生产的成本增加，且PHBV中3HV的摩尔分数仍然处于较低水平。
技术实现要素：
本发明目的是构建一株不需要外源添加丙酸盐即可生产PHBV的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，并使得PHBV中HV比例高于50％。
为此，本发明提供了一种构建谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002的方法，是将来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，在谷氨酸棒杆菌WM001进行重组表达。所述谷氨酸棒杆菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016303，保藏地址为中国武汉武汉大学。
在本发明的一种实施方式中，是以罗氏真养菌基因组GenBank NC_008313.1为模板，PCR得到phaCAB基因簇，以pDXW-8为表达载体，构建重组质粒，转化入谷氨酸棒杆菌WM001，得到正确转化子，即为可以积累PHBV的谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002。
本发明还提供了一种应用谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002摇瓶发酵生产PHBV的方法，是将谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002的种子接入发酵培养基，培养一段时间后诱导基因的表达，使菌体内部积累PHBV。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养基配方为(g/100mL)：玉米浆1-2，硫酸铵3.5，硫酸镁0.05-0.2，磷酸二氢钾0.1-0.2，葡萄糖13-15，碳酸钙2，pH为7.2。
在本发明的一种实施方式中，种子培养基配方为(g/100mL)：玉米浆3-4，硫酸铵0.5-1，硫酸镁0.05-0.2，磷酸二氢钾0.1-0.2，葡萄糖3-5，pH为7.2。
在本发明的一种实施方式中，将种子以5-10％的接种量转入发酵培养基，于28-32℃、200-230rpm条件下培养菌株至OD600达到10-15，添加IPTG诱导phaCAB基因簇的表达。
在本发明的一种实施方式中，将种子以5-10％的接种量转入装有补料分批发酵培养基的发酵罐，装液量为50-70％，pH用50％氨水控制在7.2-7.4之间，通气量为0.8-1.0L/min，于31℃下培养，前24h相对溶氧控制在30％，24h至发酵结束溶氧控制在15％；于31℃下培养6-8h，添加终浓度为0.5mM的IPTG，然后继续培养至130h，期间当培养基中剩余葡萄糖浓度低于40g/L时，流加含终浓度为0.5mM的IPTG的70％葡萄糖溶液。补料分批发酵培养基配方为(g/100mL)：玉米浆1-3，硫酸铵0.5-1，硫酸镁0.1-0.2，磷酸二氢钾0.1-0.2，葡萄糖10-15，初始pH为7.2。
本发明提供的谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002，可以在无外源添加丙酸的条件下生产PHBV，其产量达到细胞干重的20％，且3HV的比例高达66％，既有一定的食品安全保障，又降低了生产成本。
生物材料保藏
谷氨酸棒杆菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016303，保藏地址为中国武汉武汉大学。
附图说明
图1甲酯化气相色谱检测结果
A商品化PHB
B商品化PHBV
C ATCC13869/pDXW-8-phaCAB中积累的PHB
D ATCC13869/pDXW-8对照
E WM002中积累的PHBV
F WM001/pDXW-8对照
具体实施方式
气相色谱检测PHBV产量和3HV比例的方法：
将摇瓶发酵结束后的菌液收集，10,000rpm离心5分钟收集菌体，用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤两次，将洗涤后的菌体冷冻干燥两天。称取适量菌体，加入酯化液，酯化液含有2mL甲醇，2mL氯仿，120μL浓硫酸。在沸水浴中保持6小时，冷却至室温，加入1mL水，充分震荡后分层，提取下相进行气相色谱分析。PHBV标样也按如上所述的步骤进行处理，提取下相进行气相色谱分析。
PHBV产量和3HV比例的计算方法：
PHBV的产量和3HV占PHBV共聚物的比例由气相色谱法，通过比对标准样品聚羟基丁酸和羟基戊酸单体的峰面积得到。
实施例1重组菌WM002的构建
(1)以罗氏真养菌基因组NC_008313.1为模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R扩增phaCAB基因簇，扩增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列为
phaCAB-F：5’-CTGGAATTCAGAAGGAGAATCAAATCATGGCGACCGG-3’
phaCAB-R：5’-CCGCTCGAGAGGTCAGCCCATATGCAGG-3’
(2)用限制性内切酶EcoRI和XhoI消化PCR产物，载体pDXW-8(载体pDXW-8的构建方法参见申请号为200910233618.1，发明名称为一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭型诱导表达载体PDXW-8及其构建方法的专利申请)用EcoRI和XhoI消化处理，酶切产物纯化后，使用T4连接酶22℃过夜处理，转化至大肠杆菌DH5α，筛选正确转化子，对于得到的正确转化子，提取质粒后用1.8kV，5ms电转化入谷氨酸棒杆菌WM001感受态，再次筛选正确的基因工程重组菌WM001/pDXW-8-phaCAB转化子，命名为WM002。
(3)提取pDXW-8质粒后直接电转化入WM001，获得正确转化子，命名为WM001/pDXW-8，作为无异源表达phaCAB基因的空载质粒对照菌株。
实施例2应用谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002摇瓶发酵生产PHBV
(1)重组基因工程菌的摇瓶发酵
培养基(g/100mL)：玉米浆1.5，硫酸铵3.5，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.1，葡萄糖13，碳酸钙2，pH为7.2.；
培养方法：31℃，230rpm，培养96h。
诱导条件：6小时时加入终浓度为0.5mM的IPTG。
(2)实施例1中的基因工程菌WM002和WM001/pDXW-8胞内聚羟基脂肪酸酯的酯化：将所得发酵液中的菌体离心后，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，在真空冷冻干燥机中过夜冻干，称取20mg左右(质量记为Wt)的干菌体，加入到酯化管中，再加入2mL氯仿和2mL甲醇溶液，其中甲醇溶液是在甲醇中加入了3％的浓硫酸，将酯化管置于100℃的水浴锅中，酯化6小时，置于室温下半个小时，加入1mL水，充分震荡后分层，吸取下相；
(3)标样PHB和PHBV的酯化：分别称取约5mg的PHB和PHBV标样(质量分别记为WtB和WtBV)加入酯化管中进行酯化，之后步骤同上述(2)；
(4)实施例1中基因工程菌的聚羟基脂肪酸酯的结构分析
得出基因工程菌WM002的酯化产物有两个特征峰(如图1E所示)，可对应标样的PHBV特征峰(如图1B)，而WM001/pDXW-8酯化产物无对应特征峰(如图1F所示)，说明WM002胞内合成聚脂肪酸酯产物为PHBV；
(5)胞内PHBV产量计算及HV比例计算
得出基因工程菌WM002的酯化产物有两个特征峰，分别记为A和B，其面积记为As和Bs，对应标样PHBV也有两个特征峰，标样两个特征峰的面积记为A0s和B0s；那么所合成的PHBV占细胞干重比为Wt％＝(As/A0s*88％WtBV+Bs/B0s*12％WtBV)/Wt；PHV的摩尔比例为
HV％＝Bs/B0s*12％WtBV/(As/A0s*88％WtBV/104.1+Bs/B0s*12％WtBV/118.1)/118.1；发酵96小时后，PHBV占细胞干重的28％，3HV摩尔分数为58.1％。
实施例3谷氨酸棒杆菌基因工程菌ATCC13869/pDXW-8-phaCAB摇瓶发酵在胞内积累的是PHB而非PHBV
(1)重组基因工程菌的摇瓶发酵
重组菌ATCC3869/pDXW-8-phaCAB和ATCC3869/pDXW-8的构建方法参照实施例2中(1)；
(2)同实施例2中(2)；
(3)同实施例2中(3)；
(4)同实施例2中(4)；得出基因工程菌ATCC3869/pDXW-8-phaCAB的酯化产物只有1个特征峰(如图1C所示)，可对应标样PHB特征峰(如图1A所示)，无PHBV标样中的PHV特征峰(如图1B所示)，ATCC3869/pDXW-8的酯化产物无特征峰(如图1D所示)说明其胞内合成聚羟基脂肪酸酯结构为PHB。
(5)胞内PHBV产量计算及PHV比例计算
计算方法及步骤同实施例2中(5)；但发酵96小时后，ATCC3869/pDXW-8-phaCAB只可以在胞内积累PHB，而无PHBV的积累，即3HV摩尔分数为0％。
实施例4应用谷氨酸棒杆菌基因工程菌WM002补料分批发酵生产PHBV
(1)重组基因工程菌的补料分批发酵
培养基(g/100mL)：玉米浆1.5，硫酸铵0.5，硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.1，葡萄糖13，碳酸钙2，pH为7.2.；
培养方法：31℃，pH为7.2，溶氧前24h为30％，其后调整为15％，装液量为1.2L，pH用50％氨水控制在7.2-7.4之间，培养基中剩余葡萄糖浓度低于40g/L时，流加70％葡萄糖溶液(内含终浓度为0.5mM的IPTG)。
诱导条件：6小时时加入终浓度为0.5mM的IPTG，随补料液添加终浓度为0.5mM的IPTG。
(2)PHBV产量检测
收集96h发酵液，同实施例2中(2)所述步骤进行胞内产物酯化，再通过实施例2中(5)所述步骤进行PHBV产量及HV比例计算。得到在发酵96h后，可积累PHBV产量占细胞干重的20％，HV比例达到66％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。