组织偏好性启动子和使用方法与流程

本公开涉及植物分子生物学领域，更具体地，涉及植物中基因表达的调节。

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年9月25日提交的美国临时申请号62/562,663的优先权，该临时申请通过引用以其全文结合在此。

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背景技术：

异源dna序列在植物宿主中的表达依赖于该植物宿主中存在可操作地连接的启动子，包括有功能的启动子。启动子序列的选择将决定生物内异源dna序列何时与在何处进行表达。如果期望在特定的组织或器官中表达，则可使用组织偏好性启动子。如果期望基因响应刺激而表达，则诱导型启动子是首选调控元件。相比之下，如果期望在植物各细胞中连续表达，则采用组成型启动子。可以在转化载体的表达构建体中包含来自核心启动子序列的上游和/或下游的附加调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中以不同水平表达。

经常，期望的是在植物的特定组织或器官中表达dna序列。例如，使用与促进细胞增殖的形态发生基因可操作地连接的组织偏好性启动子可用于在转化过程中有效恢复转基因事件。此类组织偏好性启动子也可用于在所需植物组织中表达性状基因和/或病原体抗性蛋白，以增强植物产量和对病原体的抗性。可替代地，可能需要抑制植物组织内天然dna序列的表达以实现所需的表型。在这种情况下，可采用下述方式实现这种抑制：转化植物，使植物包含可操作地连接至反义核苷酸序列的组织偏好性启动子，使得反义序列的表达产生干扰天然dna序列的mrna翻译的rna转录物。

另外地，可能希望在处于特定生长或发育阶段(诸如像细胞分裂或伸长)的植物组织中表达dna序列。这样的dna序列可用于促进或抑制植物生长过程，从而影响植物的生长速率或结构。

因此，需要分离和表征组织偏好性启动子，特别是可以用作生长刺激基因(包括形态发生基因)的受控表达的调控元件的启动子，所述启动子可在农杆菌介导的转化后立即提供这些基因的强烈表达，以刺激体外生长和形态发生，所述表达然后减少并在异位过度表达会导致异常生长和发育的植物组织中实际上“关闭”。

技术实现要素：

提供了用于调节植物中基因表达的组合物和方法。更特别地，本公开的启动子赋予在植物组织的表皮l1(外层)中的组织偏好性表达。本公开的某些方面包括核酸分子，所述核酸分子包含形态发生基因盒，该基因盒包含组织偏好性启动子，所述启动子具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体，其中所述核苷酸序列的片段或变体在植物细胞中起始转录；以及seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；其中所述组织偏好性启动子可操作地连接至形态发生基因。还包括表达盒，其包含形态发生基因盒。还包括包含表达盒的载体，所述表达盒包含形态发生基因盒。

此外，提供了包含表达盒的植物细胞和植物，所述表达盒包含形态发生基因盒，所述形态发生基因盒包含组织偏好性启动子，所述启动子具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体，其中所述核苷酸序列的片段或变体在植物细胞中起始转录；以及seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；其中所述组织偏好性启动子可操作地连接至形态发生基因。包含含有形态发生基因盒的表达盒的植物细胞和植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。提供了包含含有形态发生基因盒的表达盒的植物细胞和植物，所述植物细胞和植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物，包括但不限于玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属。本公开还提供了包含表达盒的植物细胞或植物，所述表达盒包含形态发生基因盒，其中所述形态发生基因盒的形态发生基因编码wus/wox同源盒多肽，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。还提供了包含表达盒的植物细胞或植物，所述表达盒包含形态发生基因盒，其中所述形态发生基因盒的形态发生基因编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育或其组合。

本公开还提供了包含表达盒的植物细胞和植物，所述表达盒包含形态发生基因盒，其中所述表达盒还包含性状基因盒，所述性状基因盒包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码的基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力。本公开还提供了包含表达盒的植物细胞和植物，所述表达盒包含形态发生基因盒，其中所述表达盒还包含性状基因盒(所述性状基因盒包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码的基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力)和位点特异性重组酶盒(所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153，其中所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接)。还提供了选自下组的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和受发育调控的启动子，该组由以下组成：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。还提供了植物细胞和植物，其中表达盒的形态发生基因盒和位点特异性重组酶盒在植物细胞和植物中瞬时表达，并且表达盒的性状基因盒被稳定地掺入植物细胞和植物的基因组中。还提供了植物细胞和植物，其中从植物细胞和植物切离表达盒的形态发生基因盒和位点特异性重组酶盒，并且表达盒的性状基因盒被稳定地掺入该植物细胞和植物的基因组中。还提供了植物的种子，其中所述种子包含表达盒的性状基因盒。

本公开进一步提供了表达盒，所述表达盒包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含能够在植物或植物细胞中起始转录的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列具有选自由以下组成的组的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述能够起始转录的核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因。

还提供了包含重组多核苷酸的表达盒，所述重组多核苷酸包含能够在植物或植物细胞中起始转录的功能片段或变体，其中所述功能片段或变体衍生自选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中能够起始转录的功能片段或变体可操作地连接至形态发生基因。

本公开还提供了表达盒，所述表达盒包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含能够在植物或植物细胞中起始转录的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与选自由以下组成的组的核苷酸序列具有至少70％同一性：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中能够起始转录的所述核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因。

还提供了表达盒，所述表达盒包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含能够在植物或植物细胞中起始转录的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与选自由以下组成的组的核苷酸序列具有至少95％同一性：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中能够起始转录的所述核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因。

提供了一种表达盒，其包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含能够在植物或植物细胞中起始转录的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中能够起始转录的核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因。

还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含(a)组织偏好性启动子盒，其中所述组织偏好性启动子盒包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；或作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录，其中所述核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因以及(b)性状基因盒，所述性状基因盒包含目的异源多核苷酸，所述目的异源多核苷酸编码基因产物，所述基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力；选择具有所述重组表达盒的转基因植物细胞；并从所述转基因植物细胞再生所述转基因植物。

还提供了在产生本公开的转基因植物的方法中有用的单子叶植物细胞、双子叶植物细胞和裸子植物细胞。还提供了在本公开方法中有用的植物细胞，所述植物细胞包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物，包括但不限于玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属。

本公开还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒，其中所述形态发生基因编码wus/wox同源盒多肽，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒，其中所述形态发生基因编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、加速的体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。

还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒，其中所述重组表达盒还包含位点特异性重组酶盒，所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153，其中所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接。还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒，其中组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子选自由以下组成的组：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。

还提供了产生转基因植物的方法，其中所述方法还包括从重组表达盒中切离组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒。还提供了通过本文公开的方法产生的转基因植物。还提供了从通过本文公开的方法产生的转基因植物产生的包含重组表达盒的性状基因盒的种子。

还提供了产生转基因植物的方法，其中组织偏好性启动子盒包含第一t-dna，并且性状基因盒包含第二t-dna。还提供了产生转基因植物的方法，其中第一t-dna和第二t-dna位于用于转化植物细胞的相同细菌菌株中。还提供了产生转基因植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因植物的方法，其中第一t-dna位于第一细菌菌株中，并且第二t-dna位于第二细菌菌株中，并且所述第一细菌菌株和所述第二细菌菌株以一定比例混合用于转化植物细胞。还提供了产生转基因植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

改善体细胞胚成熟效率的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含(a)组织偏好性启动子盒，其中所述组织偏好性启动子盒包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；或作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录，其中所述核苷酸序列可操作地连接至形态发生基因以及(b)性状基因盒，所述性状基因盒包含目的异源多核苷酸，所述目的异源多核苷酸编码基因产物，所述基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力；选择具有所述重组表达盒的转基因植物细胞；并从所述转基因植物细胞再生所述转基因植物，其中，与不包含所述重组表达盒的转基因植物细胞相比，所述重组表达盒导致改善的体细胞胚成熟效率。

还提供了在本公开的改善体细胞胚成熟效率的方法有用的单子叶植物细胞、双子叶植物细胞和裸子植物细胞。还提供了在本公开方法中有用的植物细胞，所述植物细胞包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物，包括但不限于玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属。

本公开还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，所述方法包括用包含本文公开的组织偏好性启动子盒的重组表达盒转化植物细胞，其中所述形态发生基因编码wus/wox同源盒多肽，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，所述方法包括用包含本文公开的组织偏好性启动子盒的重组表达盒转化植物细胞，其中所述形态发生基因编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、加速的体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。

还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒，其中所述重组表达盒还包含位点特异性重组酶盒，所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153，其中所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接。还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒，其中组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子选自由以下组成的组：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。

还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中所述方法还包括从重组表达盒中切离组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒。还提供了通过本文公开的方法产生的转基因植物。还提供了从通过本文公开的方法产生的转基因植物产生的包含重组表达盒的性状基因盒的种子。

还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中组织偏好性启动子盒包含第一t-dna，并且性状基因盒包含第二t-dna。还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中第一t-dna和第二t-dna位于用于转化植物细胞的相同细菌菌株中。还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中第一t-dna位于第一细菌菌株中，并且第二t-dna位于第二细菌菌株中，并且所述第一细菌菌株和所述第二细菌菌株以一定比例混合用于转化植物细胞。还提供了改善体细胞胚成熟效率的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞，所述重组表达盒包含(a)组织偏好性启动子盒，其中所述组织偏好性启动子盒包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录；或作为seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在所述植物细胞中起始转录，其中在植物细胞中起始转录的核苷酸序列与编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列可操作地连接以及(b)性状基因盒，所述性状基因盒包含目的异源多核苷酸，所述目的异源多核苷酸编码基因产物，所述基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力；使所述重组表达盒在每个转化的植物细胞中表达以形成体细胞胚或芽；并且使所述体细胞胚萌发或培养所述芽以形成转基因双子叶植物或转基因裸子植物，其中所述转基因双子叶植物或所述转基因裸子植物包含目的异源多核苷酸。所公开的方法还在转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞起始后约21至约28天内提供体细胞胚或芽的形成。

还提供了在产生本公开的转基因植物的方法中有用的裸子植物细胞。还提供了在本公开的方法中有用的裸子植物细胞，包括但不限于松树和道格拉斯冷杉。还提供了在产生本公开的转基因植物的方法中有用的双子叶植物细胞。还提供了在本发明方法中有用的双子叶植物细胞，所述双子叶植物细胞包括但不限于苜蓿、大豆、棉花、向日葵、亚麻、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、甜瓜或芸苔属。

本公开还提供了用于产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，所述方法包括用包含本文公开的组织偏好性启动子盒的重组表达盒转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。还提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含本文公开的组织偏好性启动子盒，其中编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、加速的体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，所述方法包括用包含本文公开的组织偏好性启动子盒的重组表达盒转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞，其中所述重组表达盒还包含位点特异性重组酶盒，所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153，其中所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，所述方法包括用包含本文公开的组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒的重组表达盒转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞，其中组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子选自由以下组成的组：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括从重组表达盒中切离组织偏好性启动子盒和位点特异性重组酶盒。还提供了通过本文公开的方法产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物。还提供了从通过本文公开的方法产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物产生的包含重组表达盒的性状基因盒的种子。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中组织偏好性启动子盒包含第一t-dna，并且性状基因盒包含第二t-dna。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中第一t-dna和第二t-dna位于用于转化植物细胞的相同细菌菌株中。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中第一t-dna位于第一细菌菌株中，并且第二t-dna位于第二细菌菌株中，并且所述第一细菌菌株和所述第二细菌菌株以一定比例混合用于转化所述双子叶植物细胞或所述裸子植物细胞。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，所述方法包括：(a)用重组表达盒转化双子叶植物外植体或裸子植物外植体的细胞，所述重组表达盒包含含有目的异源基因的性状基因盒和含有编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列的形态发生基因盒；(b)使(a)的重组表达盒在每个转化细胞中表达以形成体细胞胚或芽；并且(c)使所述体细胞胚萌发或培养所述芽以形成所述转基因双子叶植物或转基因裸子植物。所公开的方法还在转化双子叶植物细胞或裸子植物细胞起始后约21至约28天内提供体细胞胚或芽的形成。

还提供了在产生本发明的转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法中有用的双子叶植物细胞和裸子植物细胞。在本发明的方法有用的植物细胞包括双子叶植物和裸子植物，包括但不限于苜蓿、大豆、棉花、向日葵、亚麻、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、甜瓜或芸苔属。

本公开还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述wus/wox同源盒多肽由核苷酸编码，所述核苷酸编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、加速的体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中wus/wox同源盒多肽可操作地连接至启动子，所述启动子选自由以下组成的组：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子选自由以下组成的组：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a，lea-d34，seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体，或seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述目的异源多核苷酸编码赋予以下的基因产物：营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述重组表达盒还包含位点特异性重组酶盒，所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列，该组由以下组成：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxbl、tp907-1或u153，其中所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子选自由以下组成的组：ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括从重组表达盒中切离形态发生基因盒和位点特异性重组酶盒。还提供了通过本文公开的方法产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物。还提供了从通过本文公开的方法产生的转基因双子叶植物或转基因裸子植物产生的包含重组表达盒的性状基因盒的种子。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中形态发生基因盒包含第一t-dna，并且性状基因盒包含第二t-dna。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中第一t-dna和第二t-dna位于用于转化植物细胞的相同细菌菌株中。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因双子叶植物和转基因裸子植物。还提供了如此产生的转基因双子叶植物和转基因裸子植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中第一t-dna位于第一细菌菌株中，并且第二t-dna位于第二细菌菌株中，并且所述第一细菌菌株和所述第二细菌菌株以一定比例混合用于转化植物细胞。还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中所述方法还包括使第一t-dna与第二t-dna分离。还提供了如此产生的转基因植物。还提供了如此产生的转基因双子叶植物和转基因裸子植物的种子，其中所述种子包含重组表达盒的性状基因盒。

还提供了产生转基因双子叶植物或转基因裸子植物的方法，其中萌发包括将体细胞胚或芽转移到成熟培养基或萌发培养基中，并形成所述转基因双子叶植物或所述转基因裸子植物。

附图说明

图1显示了驱动wus表达(hbs2(php80734；seqidno：113)、hbs3(php81343；seqidno：116)、ltp3(php80730；seqidno：112)、mate1(php80736；seqidno：114)和ned1(php81060；seqidno：115))和tag-rfp对照(无wus基因)(php80728；seqidno：111)的以下启动子的中值体细胞胚成熟效率：gm-hbstart2(hbs2；seqidno：108)、gm-hbstart3(hbs3；seqidno：1)、gm-ltp3(ltp3；seqidno：124)、gm-mate1(mate1；seqidno：109)、gm-ned1(ned1；seqidno：110)。

图2a、图2b和图2c的图片是在白光下拍摄的。图2d、2e和图2f的图片是在荧光灯下拍摄的以显示转基因事件。图2a、图2b、图2c、图2d、图2e和图2f的图片是在相同时间(农杆菌感染后5-6周)拍摄。图2a和图2d中所示的体细胞胚(tag-rfp对照处理(对照tag-rfp；php80728；seqidno：111))很小并且发育不充分。图2b和图2e中所示的体细胞胚(ltp3pro::wus(php80730；seqidno：112)处理)比tag-rfp对照处理中的那些大约2倍。图2c和图2f中所示的体细胞胚(hbs3pro::wus(php81343；seqidno：116)处理)比tag-rfp对照处理中的那些大约5倍。

图3a和图3b示出了gm-hbs3pro::wus事件的正常发育和种子集。

具体实施方式

将在下文中参考附图更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。

所披露的组合物和方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所披露的许多修改和其他方面具有以下描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所披露的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了具体的术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。

还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并不旨在限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所披露的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考本文中所定义的若干术语。

可再生植物结构被定义为能够形成功能齐全的可育植物的多细胞结构，例如但不限于芽分生组织、芽、体细胞胚、胚性愈伤组织、体细胞分生组织和/或器官发生愈伤组织。

体细胞胚被定义为通过与合子胚的发育相似的发育阶段(包括球形和过渡阶段胚的形成、胚轴和盾片的形成以及脂质和淀粉的积累)进行的多细胞结构。衍生自合子胚的单个体细胞胚萌发以产生单个非嵌合植物，其可能最初衍生自单个细胞。

胚性愈伤组织被定义为未分化或部分未分化细胞的脆性或非脆性混合物，其包聚增殖的初级和次级体细胞胚，所述初级或次级体细胞胚能够再生为成熟可育植物。

体细胞分生组织被定义为与种子衍生胚的一部分的顶端分生组织类似的多细胞结构，其特征在于具有未分化的顶端穹顶，其侧翼为叶片原基并被脉管初始部分所包聚，所述顶端穹顶产生地上营养植物。这样的体细胞分生组织可以形成单个或融合的分生组织簇。

器官发生愈伤组织被定义为分化的正在生长的植物结构的紧密混合物，包括但不限于顶端分生组织、根分生组织、叶和根。

萌发是指可再生结构的生长，形成苗，然后继续生长以产生植物。

转基因植物被定义为含有转基因的成熟的可育植物。

本公开涉及用于核酸分子的组合物和方法，所述核酸分子包含与形态发生基因可操作地连接的组织偏好性启动子，以及涉及其使用方法。本公开的核酸分子组合物包含与形态发生基因可操作地连接的已知作为以下的组织偏好性启动子核苷酸序列：gm-hbstart3(seqidno：1)、gm-hbstart3(截短的)(seqidno：2)、at-ml1(seqidno：3)、gm-ml1样(seqidno：4)、gm-ml1样(截短的)(seqidno：5)、zm-hbstart3(seqidno：6)、os-hbstart3(seqidno：7)、at-pdf1p2(seqidno：8)、gm-pdf1(seqidno：9)、gm-pdf1(截短的)(seqidno：10)、sb-pdf1(seqidno：11)、os-pdf1(seqidno：12)、os-pdf1(截短的)(seqidno：13)、pt-pdf1(seqidno：14)、pt-pdf1(截短的)(seqidno：15)、si-pdf1(seqidno：16)、si-pdf1(截短的)(seqidno：17)、at-pdf2(seqidno：18)、gm-pdf2(seqidno：19)、gm-pdf2(截短的)(seqidno：20)、zm-gl1(seqidno：21)、at-pdf2a(seqidno：22)、at-pdf2a(截短的)(seqidno：23)、gm-pdf2a(seqidno：24)、gm-pdf2a(截短的)(seqidno：25)、os-pdf2(seqidno：26)、os-pdf2(截短的)(seqidno：27)、pt-pdf2(seqidno：28)、pt-pdf2(截短的)(seqidno：29)、vv-pdf2(seqidno：30)、vv-pdf2(截短的)(seqidno：31)、zm-pdf2(seqidno：32)、si-pdf2(seqidno：33)、si-pdf2(截短的)(seqidno：34)、vv-pdf2a(seqidno：35)、pt-pdf2a(seqidno：36)、pt-pdf2a(截短的)(seqidno：37)、mt-pdf2(seqidno：38)、mt-pdf2(截短的)(seqidno：39)、at-hdg2(seqidno：40)、gm-hdg2(seqidno：41)、gm-hdg2(截短的)(seqidno：42)、sb-hdg2(seqidno：43)、sb-hdg2(截短的)(seqidno：44)、at-cer6(seqidno：45)、at-cer60(seqidno：46)、at-cer60(截短的)(seqidno：47)、gm-cer6(seqidno：48)、gm-cer6(截短的)(seqidno：49)、pt-cer6(seqidno：50)、pt-cer6(截短的)(seqidno：51)、vv-cer6(seqidno：52)、vv-cer6(截短的)(seqidno：53)、sb-cer6(seqidno：54)、zm-cer6(seqidno：55)、si-cer6(seqidno：56)、si-cer6(截短的)(seqidno：57)、os-cer6(seqidno：58)、os-cer6(截短的)(seqidno：59)、gm-hbstart2(seqidno：108)、gm-mate1(seqidno：109)、gm-ned1(seqidno：110)、gm-ltp3(seqidno：124)、at-ml1(截短的)(seqidno：125)、at-cer6(截短型1)(seqidno：126)、at-pdf1(截短的)(seqidno：149)、at-pdf2(截短的)(seqidno：150)、at-hdg2(截短的)(seqidno：151)、at-anl2(seqidno：152)、和at-cer6(截短型2)(seqidno：189)。本公开提供了核酸分子，所述核酸分子包含可操作地连接至形态发生基因的seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189所示的核苷酸序列中的至少一个以及其片段和变体。组合物还包含表达盒、dna构建体和包含核酸分子的载体，所述核酸分子包含可操作地连接至形态发生基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列是seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189所示核苷酸序列中的至少一个。

如本文所用，术语“本文所公开的组织偏好性启动子”是指选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100-bp片段，其中所述核苷酸序列的所述至少100-bp片段在植物细胞中起始转录。

如本文所用，术语“形态发生基因”是指基因，所述基因当异位表达时刺激可产生植物的体细胞衍生结构的形成。更精确地，形态发生基因的异位表达刺激了可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(例如芽分生组织)的从头形成。这种刺激的从头形成发生在表达形态发生基因的细胞中或在邻近的细胞中。形态发生基因可以是调节其他基因表达的转录因子，也可以是影响植物组织中激素水平的基因，两者均可刺激形态发生变化。可以将形态发生基因稳定地掺入植物的基因组中或可以瞬时表达。本公开的组织偏好性启动子用于表达形态发生基因，所述形态发生基因参与植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育或其组合，如wus/wox基因(wus1、wus2、wus3、wox2a、wox4、wox5或wox9)，参见美国专利7348468和7256322及美国专利申请公开20170121722和20070271628；laux等人(1996)development[发育]122：87-96；以及mayer等人(1998)cell[细胞]95：805-815；vandergfaaff等人，2009，genomebiology[基因组生物学]10：248；dolzblasz等人，2016，mol.plant[分子植物学]19：1028-39。预期wus/wox的调节可调节植物和/或植物组织表型，包括植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、加速的体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。拟南芥wus的表达可以在营养组织中诱导干细胞，其可以分化为体细胞胚(zuo，等人(2002)plantj[植物杂志]30：349-359)。在这方面也有意义的是myb118基因(参见美国专利7，148，402)、myb115基因(参见wang等人(2008)cellresearch[细胞研究]224-235)、babyboom基因(bbm；参见boutilier等人(2002)plantcell[植物细胞]14：1737-1749)或clavata基因(例如，参见美国专利7,179,963)。

可用于本公开的形态发生基因包括但不限于本领域已知的wus/wox基因以及本文公开的那些。形态发生基因包括但不限于本文公开的wus/wox基因，包括at-wus(seqidno：60)、lj-w(seqidno：62)、gm-w(seqidno：64)、cs-wus(seqidno：66)、cr-wus(seqidno：68)、aa--wus(seqidno：70)、rs-wus(seqidno：72)、bn-wus(seqidno：74)、bo-wu(seqidno：76)、ha-wus(seqidno：78)、pt-wus(seqidno：80)、vv-wus(seqidno：82)、at-wus(大豆优化的)(seqidno：84)、lj-wus(大豆优化的)(seqidno：86)、mt-wus(大豆优化的)(seqidno：88)、py-wus(大豆优化的)(seqidno：90)、pv-wus(大豆优化的)(seqidno：92)、zm-wus1(seqidno：94)、zm-wus2(seqidno：96)、zm-wus3(seqidno：98)、zm-wox2a(seqidno：100)、zm-wox4(seqidno：102)、zm-wox5a(seqidno：104)、zm-wox9(seqidno：106)、gg-wus(seqidno：127)、md-wus(seqidno：129)、me-wus(seqidno：131)、kf-wus(seqidno：133)、gh-wus(seqidno：135)、zosma-wus(seqidno：137)、ambtr-wus(seqidno：139)、ac-wus(seqidno：141)、ah-wus(seqidno：143)、cucsa-wus(seqidno：145)和pinta-wus(seqidno：147)。

本文公开的wus/wox基因编码wus/wox同源盒多肽，包括at-wus(seqidno：61)、lj-w(seqidno：63)、gm-w(seqidno：65)、cs-wus(seqidno：67)、cr-wus(seqidno：69)、aa-wus(seqidno：71)、rs-wus(seqidno：73)、bn-wus(seqidno：75)、bo-wu(seqidno：77)、ha-wus(seqidno：79)、pt-wus(seqidno：81)、vv-wus(seqidno：83)、at-wus(seqidno：85)、lj-wus(seqidno：87)、mt-wus(seqidno：89)、py-wus(seqidno：91)、pv-wus(seqidno：93)、zm-wus1(seqidno：95)、zm-wus2(seqidno：97)、zm-wus3(seqidno：99)、zm-wox2a(seqidno：101)、zm-wox4(seqidno：103)、zm-wox5a(seqidno：105)、zm-wox9(seqidno：107)、gg-wus(seqidno：128)、md-wus(seqidno：130)、me-wus(seqidno：132)、kf-wus(seqidno：134)、gh-wus(seqidno：136)、zosma-wus(seqidno：138)、ambtr-wus(seqidno：130)、ac-wus(seqidno：142)、ah-wus(seqidno：144)、cucsa-wus(seqidno：146)和pinta-wus(seqidno：148)。

本文公开的wus/wox基因包括编码wus/wox同源盒多肽的那些，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任何。

可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于lec1(lotan等人，1998，cell[细胞]93：1195-1205)、lec2(stone等人，2008，pnas[美国国家科学院院刊]105：3151-3156；belide等人，2013，plantcelltiss.organcult[植物细胞组织与器官培养]113：543-553)、kn1/stm(sinha等人，1993.genesdev[基因与发育]7：787-795)、农杆菌的ipt基因(ebinuma和komamine，2001，invitrocell.devbiol-plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、monopteros-δ(ckurshumova等人，2014，newphytol.[新植物学家]204：556-566)、农杆菌av-6b基因(wabiko和minemura1996，plantphysiol.[植物生理学]112：939-951)、农杆菌iaa--h和iaa-m基因的组合(endo等人，2002，plantcellrep.[植物细胞报道]，20：923-928)、拟南芥serk基因(hecht等人，2001，plantphysiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥agl15基因(harding等人，2003，plantphysiol.[植物生理学]133：653-663)。

如本文所用，术语“转录因子”是指通过与启动子的dna序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发生基因)的实例包括ap2/erebp家族的成员(包括bbm(odp2)、多血(plethora)和aintegumenta亚家族、caat-盒结合蛋白(如lec1和hap3)以及myb的成员、bhlh、nac、mads、bzip和wrky家族。

在一个方面，重组表达盒或构建体包含编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列。在各个方面，编码wus/wox同源盒的核苷酸序列的表达在转化起始后持续发生约21至约28天。

在一个方面，编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列可以被位点特异性重组酶靶向切离。因此，可以在转化后的期望时间通过切离来控制编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列的表达。应当理解，当将位点特异性重组酶用于控制编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列的表达时，表达构建体包含合适的位点特异性切离位点，其位于待切离的多核苷酸序列的侧翼，例如，如果使用cre重组酶，则为crelox位点。不必将位点特异性重组酶共定位在包含编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列的表达构建体上。然而，在一个方面，表达构建体还包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。

用于控制编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列的表达的位点特异性重组酶可以选自多种合适的位点特异性重组酶。例如，在各个方面中，位点特异性重组酶是flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2(nern等人，(2011)pnas[美国国家科学院院刊]第108卷，第34期第14198-14203页)、b3(nern等人，(2011)pnas[美国国家科学院院刊]第108卷，第34期第14198-14203页)、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153。位点特异性重组酶可以是去稳定的融合多肽。去稳定的融合多肽可以是tetr(g17a)～cre或esr(g17a)～cre。

在一个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接。合适的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和受发育调控的启动子包括ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usb1zmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1，dr5，xve，glb1，ole，ltp2(kalla等人，1994.plantj.[植物杂志]6：849-860和us5525716)，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811，at-hsp811l，gm-hsp173b，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a或lea-d34。

在一个方面，与位点特异性重组酶可操作地连接的化学诱导型启动子是xve。化学诱导型启动子可以被四环素阻遏物(tetr)、乙苯磺隆阻遏物(esr)或氯磺隆阻遏物(cr)阻遏，并且在添加四环素相关配体或磺酰脲配体后会发生去阻遏作用。阻遏物可以是tetr，四环素相关的配体是强力霉素或脱水四环素。(gatz，c.，frohberg，c.和wendenburg，r.(1992)stringentrepressionandhomogeneousde-repressionbytetracyclineofamodifiedcamv35spromoterinintacttransgenictobaccoplants[完整转基因烟草植物中经修饰的camv35s启动子的四环素严格阻遏和均质去阻遏]，plantj.[植物杂志]2，397-404)。可替代地，阻遏物可以是esr，并且磺酰脲配体是乙磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘甲磺隆，氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲基二磺隆或氯吡嘧磺隆(us20110287936通过引用整体并入本文)。

在一个方面，当表达构建体包含位点特异性重组酶切离位点时，可将编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列可操作地连接至生长素诱导型启动子、受发育调控的启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。在这种情况下有用的示例性生长素诱导型启动子、受发育调控的启动子、组织特异性启动子和组成型启动子包括ubi，lldav，evcv，dmmv，bsv(ay)pro，cymvprofl，ubizmpro，si-ub3pro，sb-ubipro(alt1)，usblzmpro，zm-gos2pro，zm-h1bpro(1.2kb)，in2-2，nos，35s的-135形式，zm-adfpro(alt2)，axig1(us6,838,593，通过引用以其全文结合在此)，dr5，xve，glb1，ole，ltp2，hsp17.7，hsp26，hsp18a，at-hsp811(takahashi，t，等人，(1992)plantphysiol.[植物生理学]99(2)：383-390)，at-hsp811l(takahashi，t，等人，(1992)plantphysiol.[植物生理学]99(2)：383-390)，gm-hsp173b(f.，等人(1984)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]3(11)：2491-2497)，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，pltp，pltp1，pltp2，pltp3，sdr，lgl，lea-14a，lea-d34，seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体，或seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段。

可以通过使用本文公开的组织偏好性启动子来实现编码wus/wox同源盒多肽的核苷酸序列表达合适的持续时间，所述组织偏好性启动子包括但不限于：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的片段或变体，或seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的至少100-bp片段。当使用形态发生基因盒和性状基因盒来产生转基因植物时，希望具有在共转化的植物中将形态发生基因位点与性状基因位点分离的能力，以提供仅含有性状基因的转基因植物。这可以使用根癌农杆菌两t-dna二元系统来实现，其中通用主题具有两个变型(参见miller等人，2002)。例如，在最初的两t-dna载体中，用于形态发生基因和除草剂选择(即hra)的表达盒包含在第一t-dna中，并且性状基因表达盒包含在第二t-dna中，其中两个t-dna都存在于单个二元载体上。当用含有两t-dna质粒的农杆菌转化植物细胞时，高百分比的转化的细胞含有两个t-dna，所述两个t-dna已经整合到不同基因组位置(例如，在不同染色体上)。在第二方法中，例如，将两个农杆菌菌株(每个菌株均含有两个t-dna(形态发生基因t-dna或性状基因t-dna)之一)按比例混合在一起，并将混合物用于转化。使用这种混合农杆菌方法转化后，高频率观察到回收的转基因事件同时包含两个t-dna，通常位于不同的基因组位置。对于两种共转化方法，观察到在大部分产生的转基因事件中，这两个t-dna基因座独立地分离，并且可以很容易地鉴定出子代t1植物，其中t-dna基因座彼此分离，从而导致子代种子的恢复，所述子代种子含有无形态发生基因/除草剂基因的性状基因。参见miller等人transgenicres[转基因研究]11(4)：381-96。

本文提供的方法依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移来产生具有掺入的目标核苷酸序列的可再生植物细胞。可用于本公开的方法的细菌菌株包括但不限于解毒的农杆菌、苍白杆菌属细菌或根瘤菌科细菌。在一个方面，不同的细菌菌株选自(i)解毒的农杆菌和苍白杆菌属细菌，(ii)解毒的农杆属和根瘤菌科细菌，和(iii)根瘤菌科细菌和苍白杆菌属细菌。

在本发明方法中有用的解毒的农杆菌包括但不限于agl-1、eha105、gv3101、lba4404和lba4404thy-。

在本方法中有用苍白杆菌属菌株包括但不限于，海沃德苍白杆菌(ochrobactrumhaywardense)h1nrrl保藏号b-67078、苏铁苍白杆菌(ochrobactrumcytisi)、大田苍白杆菌(ochrobactrumdaejeonense)、水稻苍白杆菌(ochrobactrumoryzae)、小麦苍白杆菌(ochrobactrumtritici)lbnl124-a-10、htg3-c-07、家畜苍白杆菌(ochrobactrumpecoris)、鹰嘴豆苍白杆菌(ochrobactrumciceri)、鸡油菌苍白杆菌(ochrobactrumgallinifaecis)、格里朗苍白杆菌(ochrobactrumgrignonense)、广州苍白杆菌(ochrobactrumguangzhouense)、嗜血苍白杆菌(ochrobactrumhaematophilum)、中间苍白杆菌(ochrobactrumintermedium)、羽扇豆苍白杆菌(ochrobactrumlupini)、垂体苍白杆菌(ochrobactrumpituitosum)、假中间苍白杆菌(ochrobactrumpseudintermedium)、假格里朗苍白杆菌(ochrobactrumpseudogrignonense)、根围苍白杆菌(ochrobactrumrhizosphaerae)、噻吩噻苍白杆菌(ochrobactrumthiophenivorans)、和小麦苍白杆菌。

在本方法中有用的根瘤菌科细菌菌株包括但不限于卢西坦根瘤菌(rhizobiumlusitanum)、发根根瘤菌(rhizobiumrhizogenes)、悬钩子农杆菌(agrobacteriumrubi)、多医院根瘤菌(rhizobiummultihospitium)、热带根瘤菌(rhizobiumtropici)、米洛南根瘤菌(rhizobiummiluonense)、豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarum)、豌豆根瘤菌三叶草生物型(rhizobiumleguminosarumbv.trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物型(rhizobiumleguminosarumbv.phaseoli)、豌豆根瘤菌蚕豆生物型(rhizobiumleguminosarum.bv.viciae)、麦迪逊豌豆根瘤菌(rhizobiumleguminosarummadison)、豌豆根瘤菌usda2370(rhizobiumleguminosarumusda2370)、豌豆根瘤菌usda2408(rhizobiumleguminosarumusda2408)、豌豆根瘤菌usda2668(rhizobiumleguminosarumusda2668)、豌豆根瘤菌2370g(rhizobiumleguminosarum2370g)、豌豆根瘤菌2370lba(rhizobiumleguminosarum2370lba)、豌豆根瘤菌2048g(rhizobiumleguminosarum2048g)、豌豆根瘤菌2048lba(rhizobiumleguminosarum2048lba)、豌豆根瘤菌菜豆生物型2668g(rhizobiumleguminosarumbv.phaseoli2668g)、豌豆根瘤菌菜豆生物型2668lba(rhizobiumleguminosarumbv.phaseoli2668lba)、豌豆根瘤菌rl542c(rhizobiumleguminosarumrl542c)、菜豆根瘤菌usda9032(rhizobiumetliusda9032)、菜豆根瘤菌菜豆生物型(rhizobiumetlibv.phaseoli)、内生根瘤菌(rhizobiumendophyticum)、藏根瘤菌(rhizobiumtibeticum)、菜豆根瘤菌(rhizobiumetli)、皮西根瘤菌(rhizobiumpisi)、芸豆根瘤菌(rhizobiumphaseoli)、蚕豆根瘤菌(rhizobiumfabae)、海南根瘤菌(rhizobiumhainanense)、粘节杆菌(arthrobacterviscosus)、阿拉米根瘤菌(rhizobiumalamii)、中生根瘤菌(rhizobiummesosinicum)、苏拉根瘤菌(rhizobiumsullae)、靛蓝根瘤菌(rhizobiumindigoferae)、高卢根瘤菌(rhizobiumgallicum)、杨林根根瘤菌(rhizobiumyanglingense)、蒙古根瘤菌(rhizobiummongolense)、稻根瘤菌(rhizobiumoryzae)、罗森根瘤菌(rhizobiumloessense)、吐蕃根瘤菌(rhizobiumtubonense)、解纤维素根瘤菌(rhizobiumcellulosilyticum)、土壤根瘤菌(rhizobiumsoli)、方铅矿新根瘤菌(neorhizobiumgalegae)、维格纳新根瘤菌(neorhizobiumvignae)、华氏新根瘤菌(neorhizobiumhuautlense)、碱性新根瘤菌(neorhizobiumalkalisoli)、阿尔塔米拉金色单胞菌(aureimonasaltamirensis)、冷冻性金黄色葡萄球菌(aureimonasfrigidaquae)、解脲金黄色葡萄球菌(aureimonasureilytica)、珊瑚金单胞菌(aurantimonascoralicida)、远洋黄腐菌(fulvimarinapelagi)、地中海马特尔氏菌(martelellamediterranea)、无核异根瘤菌(allorhizobiumundicola)、葡萄异根瘤菌(allorhizobiumvitis)、鲍伯异根瘤菌(allorhizobiumborbor)、白花拜叶林克氏菌(beijerinckiafluminensis)、落叶松农杆菌(agrobacteriumlarrymoorei)、放射形农杆菌(agrobacteriumradiobacter)、硒还原根瘤菌(rhizobiumselenitireducenscorrig.)、蔷薇根瘤菌(rhizobiumrosettiformans)、大田根瘤菌(rhizobiumdaejeonense)、聚集根瘤菌(rhizobiumaggregatum)、荚膜副根瘤菌(pararhizobiumcapsulatum)、贾第虫副根瘤菌(pararhizobiumgiardinii)、墨西哥剑菌(ensifermexicanus)、特兰加剑菌(ensiferterangae)、萨赫利剑菌(ensifersaheli)、科斯蒂恩斯剑菌(ensiferkostiensis)、库默罗维亚剑菌(ensiferkummerowiae)、弗雷迪剑菌(ensiferfredii)、美洲中华根瘤菌(sinorhizobiumamericanum)、乔木剑菌(ensiferarboris)、加拉曼提库剑菌(ensifergaramanticus)、草木栖剑菌剑菌(ensifermeliloti)、努米迪克斯剑菌(ensifernumidicus)、粘着剑菌(ensiferadhaerens)、中华根瘤菌属物种(sinorhizobiumsp.)、苜蓿中华根瘤菌sd630(sinorhizobiummelilotisd630)、苜蓿中华根瘤菌usda1002(sinorhizobiummelilotiusda1002)、费氏中华根瘤菌usda205(sinorhizobiumfrediiusda205)、费氏中华根瘤菌sf542g(sinorhizobiumfrediisf542g)、费氏中华根瘤菌sf4404(sinorhizobiumfrediisf4404)、和费氏中华根瘤菌sm542c(sinorhizobiumfrediism542c)。参见通过引用以其全文结合在此的us9,365,859。

在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以50∶50的比例存在。在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以25∶75的比例存在。在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以10∶90的比例存在。在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以5∶95的比例存在。在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株以1∶99的比例存在。在一个方面，第一细菌菌株和第二细菌菌株是不同的细菌菌株。

本公开的启动子包括允许在植物中起始转录的核苷酸序列。在特定方面，启动子允许以组织偏好性方式起始转录。本公开的构建体包含可操作地连接至形态发生基因的本文公开的组织偏好性启动子。

本文公开的组织偏好性启动子也可用于表达盒或载体的构建，所述表达盒或载体用于随后在目的植物中表达异源多核苷酸或目的多核苷酸或用作分离其他启动子的探针。本公开提供了分离的dna构建体，其包含seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个所示的、可操作地连接至形态发生基因的启动子核苷酸序列并且进一步任选地包含异源多核苷酸或目的多核苷酸。

本公开的方面包括包含启动子的核酸分子，所述启动子的核苷酸序列选自由以下组成的组：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体，其中所述片段或变体在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100-bp片段，其中所述核苷酸序列的所述至少100-bp片段在植物细胞中起始转录；其中所述启动子可操作地连接至形态发生基因，并且任选地还包含异源多核苷酸或目的多核苷酸。还呈现了表达盒，其包含含有核酸的启动子，包含表达盒的载体和包含所述表达盒的植物细胞。另外的方面包括植物细胞或植物，其中表达盒瞬时表达或稳定整合到植物细胞或植物(无论是单子叶还是双子叶植物细胞或植物)以及包含所述表达盒的植物(无论是单子叶植物还是双子叶植物)的基因组中，所述单子叶或双子叶植物细胞或植物包括玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属。

还呈现了具有所述表达盒的植物，所述表达盒被稳定地掺入到所述植物、所述植物的种子的基因组中，其中所述种子包含所述表达盒。进一步呈现的是植物，其中异源多核苷酸或目的多核苷酸的基因或基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力。还呈现了一种植物，其中异源多核苷酸或目的多核苷酸的表达改变了所述植物的表型。还呈现的是表达盒，其包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含具有启动子活性的功能片段，其中所述片段衍生自选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidnos：1-59、108-110、124-126、149-152和189，其中具有启动子活性的功能片段可操作地连接至形态发生基因。

本公开涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分当通过重组技术产生时不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。“分离的”核酸基本上不含在衍生出该核酸的生物体的基因组dna中天然地位于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(包括蛋白质编码序列)。例如，在多个方面中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在衍生该核酸的细胞的基因组dna中天然地位于该核酸分子的侧翼。本披露的序列可从处于它们各自的转录起始位点旁侧的5′非翻译区分离。

本披露还涵盖所披露的启动子核苷酸序列的片段和变体。seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的启动子序列的片段和变体可以用于本公开的dna构建体中。如本文所使用的，术语“片段”是指核酸序列的一部分。启动子序列的片段保留了起始转录的生物学活性，例如以组成型方式驱动转录。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列的片段可以不必保留生物活性。本文公开的启动子的核苷酸序列的片段的范围可以是至少约20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875、1900、1925、1950、1975、2000、2025、2050、2075、2100、2125、2150、2175、2200、2225、2250、2275、2300、2325、2350、2375、2400、2425、2450、2475、2500、2525、2550、2575、2600、2625、2650、2675、2700、2725、2750、2775、2800、2825、2850、2875、2900、2925、2950、2975、3000、3025、3050、3075、3100、3125、3150、3175、3200、3225、3250、3275、3300、3325、3350、3375、3400、3425、3450、3475、3500、3525、3550、3575、3600、3625、3650、3675、3700、3725、3750、3775、3800、3825、3850、3875、3900、3925、3950、3975、4000、4025、4050、4075、4100、4125、4150、4175、4200、4225、4250、4275、4300、4325、4350、4375、4400、4425、4450、4475、4500、4525、4550、4575、4600、4625、4650、4675、4700、4725、4750、4775、4800、4825、4850、4875、4900、4925、4950、4975、5000、5025、5050、5075、5100、5125、5150、5175、5200、5225、5250、5275、5300、5325、5350、5375、5400、5425、5450、5475、5500、5525、5550、5575、5600、5625、5650、5675、5700、5725、5750、5775、5800、5825、5850、5875、5900、5925、5950、5975、6000、6025、6050、6075、6100、6125、6150、6175、6200或6225个核苷酸，并多达seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的全长。启动子的生物学活性部分可通过分离本公开的启动子序列的一部分并评估所述部分的转录活性来制备。

如本文所用，术语“变体”是指与本文所公开的启动子序列具有实质相似性的序列。变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的，“天然”核苷酸序列包括自然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链反应(pcr)和杂交技术来鉴定。

核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，本文公开的核苷酸序列的变体与如通过本文其他地方所述使用默认参数的序列比对程序所确定的核苷酸序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、至95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。还涵盖本文公开的核苷酸序列的生物活性变体。生物活性变体包括，例如，本文公开的核苷酸序列的天然启动子序列，其具有一个或多个核苷酸取代、缺失或插入。启动子活性可以通过使用技术来测量，所述技术是例如rna印迹分析、从转录融合体获得的报道基因活性测量，等。参见，例如，sambtook等人，(1989)molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册](第2版，coldspringharborlaboratorypress[冷泉港实验室出版社])，coldspringharbor[冷泉港]，n.y.[纽约])，在下文中称为“sambrook”，通过引用以其全文结合在此。可替代地，可以测量在启动子片段或变体的控制下产生的报告基因例如绿色荧光蛋白(gfp)或黄色荧光蛋白(yfp)等的水平。参见例如matz等人(1999)naturebiotechnology[自然生物技术]17：969-973；美国专利号6,072,050，通过引用以其全文结合在此；nagai，等人，(2002)naturebiotechnology[自然生物技术]20(1)：87-90。核苷酸序列变体还涵盖由诱变和重组发生程序(如dna改组)产生的序列。通过这种程序，可以操纵启动子的一个或多个不同的核苷酸序列以产生新的启动子。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，所述相关序列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。这种dna改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，stemmer，(1994)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]91：10747-10751；stemmer，(1994)nature[自然]370：389391；crameri等人，(1997)naturebiotech.[自然生物技术]15：436-438；moore等人，(1997)jmolbiol[分子生物学杂志]272：336-347；zhang等人，(1997)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]94：4504-4509；crameri，等人，(1998)nature[自然]391：288-291和美国专利号5,605,793和5,837,458，所述文献通过引用以其全文结合在此。

用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，kunkel，(1985)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]82：488-492；kunkel，等人，(1987)methodsinenzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；walker和gaastra编辑。(1983)techniquesinmolecularbiology[分子生物学技术](麦克米伦出版公司，纽约)及其中引用的参考文献，所述文献通过引用以其全文结合在此。

本公开的核苷酸序列可用于分离来自其他生物(特别是其他植物，更特别是其他单子叶植物或双子叶植物)的相应序列。以这种方式，可以使用如pcr、杂交等方法来鉴定此类序列(基于其与本文所示序列的序列同源性)。本公开涵盖了基于与本文所示的完整序列或者与完整序列的片段的序列同一性而分离的序列。

在pcr方法中，可以设计寡核苷酸引物用于pcr反应，以从由任何目的植物提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物与pcr克隆的方法是本领域普遍已知的并公开于sambrook(同上)中。还参见innis等人编辑(1990)pcrprotocols：aguidetomethodsandapplicatiohs[pcr方案：方法与应用指南](学术出版社，纽约)；innis和gelfand编辑(1995)pcrstrategies[pcr策略](学术出版社，纽约)；以及innis和gelfand编辑(1999)pcrmethodsmanual[pcr方法手册](学术出版社，纽约)；所述文献通过引用以其全文结合在此。已知的pcr方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，利用已知核苷酸序列的全部或部分作为探针，该探针选择性杂交来自所选生物体的一群克隆基因组dna片段或cdna片段(即基因组或cdna文库)中存在的其他相应核苷酸序列。这些杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如³²p或任何其他可检测标记物进行标记。因此，例如，可通过基于本公开的启动子标记合成的寡核苷酸来制得用于杂交的探针。用于制备杂交用探针和用于构建基因组文库的方法是本领域普遍已知的并且公开于sambrook(同上)中。

例如，本文所公开的完整启动子序列或其一个或多个部分可以用作能够与相应的启动子序列和信使rna特异性杂交的探针。要在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包含的序列是启动子序列中独特的，并且通常其长度为至少约10个核苷酸或者其长度为至少约20个核苷酸。可以使用此类探针通过pcr由选择的植物扩增相应的启动子序列。可以使用这种技术从所需的生物体中分离另外的编码序列，或作为用于确定生物体中存在编码序列的诊断测定。杂交技术包括杂交筛选铺板的dna文库(斑块或集落，参见例如sambrook，同上)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。术语“严格条件”或“严格杂交条件”意指探针与其靶序列杂交的程度比其与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如比背景高至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探测)。可替代地，可以调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探测)。探针长度通常小于约1000个核苷酸，最佳地，其长度小于500个核苷酸。

典型地，严格条件是以下条件，在这些条件下该盐浓度在ph7.0至8.3时是小于约1.5m钠离子、典型为约0.01至1.0m钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)的温度为至少约30℃，而对于长探针(例如，超过50个核苷酸)的温度为至少约60℃。添加去稳定剂如甲酰胺也可以实现严格条件。示例性低严格性条件包括在37℃使用30％至35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，并且在50℃至55℃在1倍至2倍ssc(20倍ssc＝3.0mnacl/0.3m柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中严格条件包括在37℃在40％至45％甲酰胺、1.0mnacl、1％sds中进行杂交，并且在55℃至60℃在0.5倍至1倍ssc中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并且在60℃至65℃在0.1倍ssc中最后洗涤至少30分钟的持续时间。杂交持续时间通常小于约24小时，通常为约4至约12小时。洗涤的持续时间将为至少足以达到平衡的时间长度。

特异性典型地取决于杂交后洗涤的功能，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于dna-dna杂交体，热熔点(tm)可以从meinkoth和wahl，(1984)anal.biochem[分析生物化学]138：267284的等式粗略估计tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m为单价阳离子的摩尔浓度，％gc为dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且l为杂合体的碱基对长度。tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在所限定的离子强度和ph下)。对于每1％的错配，tm减少大约1℃；因此，可以调整tm、杂交、和/或洗涤条件，以便与具有所希望的同一性的序列进行杂交。例如，如果寻找具有90％同一性的序列，则可将tm降低10℃。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在所限定的离子强度和ph下的tm低约5℃。然而，极严格条件可以利用比tm低1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比tm低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比tm低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。使用方程、杂交和洗涤组合物以及所需的tm，普通技术人员将理解，本质上描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化。如果所希望的错配程度导致tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加ssc浓度以使得可使用较高温度。有关核酸杂交的详尽指南见于tijssen，(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology--hybridizationwithnucleicacidprobes[生物化学与分子生物学技术-与核酸探针的杂交]，第i部分，第2章(爱思唯尔出版社(elsevier)，纽约)；以及ausubel等人编辑(1995)currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学当前方案]，第2章(格林出版与威利交叉科学出版社(greenepublishingandwiley-interscience)，纽约)中，所述文献通过引用以其全文结合在此。另见，sambrook同上。因此，本公开涵盖具有启动子活性的分离序列，这种分离序列在严格条件下与本文所公开的启动子序列或其片段杂交。

一般而言，具有启动子活性并且与本文所公开的启动子序列杂交的序列将与所公开的序列有至少40％至50％的同源性，约60％、70％、80％、85％、90％、95％至98％或更高的同源性。即，序列的序列相似性可以在一定范围内，共有至少约40％至50％，约60％至70％，以及约80％、85％、90％、95％至98％的序列相似性。

以下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“比较窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。

如本文使用的，“参比序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参比序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cdna或基因序列的区段、或完整的cdna或基因序列。

如本文使用的，“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续并指定的区段，其中与用于两个序列的最佳对齐的参比序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可能包含添加或缺失(即空位)。通常，比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，并且任选地可以是30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应当理解，由于多核苷酸序列中含有缺口，为了避免与参比序列的高相似性，典型地引入缺口罚分，并且将其从匹配数中减去。

用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的百分序列同一性的测定能够用一种数学算法进行。此类数学算法的非限制性实例是myers和miller，(1988)cabios4：11-17的算法；smith等人，(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2：482的算法；needleman和wunsch，(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志]48：443-453的算法；pearson和lipman，(1988)proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]85：2444-2448的算法；karlin和altschul，(1990)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]872：264的算法；如在karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90：5873-5877中修改的；所述文献通过引用以其全文结合在此。

这些数学算法的计算机实现可以用于序列比较，来确定序列同一性。这些实现方法包括，但不限于：pc/gene程序(可获自加利福尼亚州山景城的易达利遗传学公司(intelligenetics，mountainview，calif.))中的clustal；align程序(版本2.0)以及gcg威斯康辛遗传软件包版本10(可获自美国加利福尼亚州圣迭戈的斯克兰顿路9685号的accelrys公司(accelrysinc.，9685scrantonroad，sandiego，calif.，usa)获得)中的gap、bestfit、blast、fasta、以及tfasta。使用这些程序的对齐可以使用默认参数进行。以下充分描述了clustal程序：higgins等人(1988)gene[基因]73：237-244；higgins等人(1989)cabios5：151-153；corpet等人(1988)nucleicacidsres.[核酸研究]16：10881-90；huang等人(1992)cabios8：155-65；以及pearson等人(1994)meth.mol.biol.[分子生物学方法]24：307-331；所述文献通过引用以其全文结合在此。align程序是基于myers和miller(1988)(同上)的算法。当比较氨基酸序列时，align程序可以使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12、空位罚分为4。altschul等人，(1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215：403(通过引用以其全文结合在此)的blast程序是基于karlin和altschul(1990)(同上)的算法。blast核苷酸搜索可用blastn程序、得分＝100、字长＝12来进行，以获得与编码本公开的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用blastx程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本公开的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可以使用如altschul等人，(1997)nucleicacidsres.[核酸研究]25：3389(通过引用以其全文结合在此)中所述的缺口blast(在blast2.0中)。可替代地，psi-blast(在blast2.0中)可以用于进行检测分子之间远缘关系的迭代搜索。参见altschul等人，(1997)，同上。当使用blast、缺口blast、psi-blast时，可以使用各自程序的默认参数(例如，用于核苷酸序列的blastn、用于蛋白质的blastx)。参见美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网址www.ncbi.nlm.nih.gov。还可依靠手动检查，来进行比对。

除非另有说明，本文中提供的序列同一性/相似性值是指使用gap版本10使用以下参数获得的值：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用gap权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性和％相似性，使用gap权重8和长度权重2以及blosum62评分矩阵；或其任何等效程序。如本文所用，“等效程序”是任何序列比较程序，该程序对于任何两个所讨论的序列产生一个比对，当与gap版本10所产生的对应的比对相比较时，该比对具有相同的核苷酸或氨基酸残基配对以及相同的百分比序列同一性。

gap程序使用needleman和wunsch(同上)的算法来找到使匹配数目最大化并且使空位数目最小化的两个完整序列的比对。gap考虑所有可能的对齐和空位位置，并且产生具有最大匹配碱基数量和最少空位的对齐。它允许以匹配碱基单位提供空位产生罚分和空位延伸罚分。gap必须为它插入的每个空位获取空位产生罚分匹配数目的收益。如果选择大于零的空位延伸罚分，gap必须另外地为每个所插入空位获取空位长度乘以空位延伸罚分的收益。在gcg威斯康辛遗传软件包的版本10中，蛋白质序列默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生和空位延伸罚分可以表示为选自下组的整数，该组由0至200组成。因此，例如，空位产生和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

gap代表最佳对齐家族的一个成员。可以存在这个家族的许多成员，但是其他成员没有更好的品质。gap展示出用于对齐的四个性能因数：质量、比率、同一性和相似性。为了对齐序列，质量是最大化的度量。比率是质量除以更短区段中的碱基数。同一性百分比是实际匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。空位对面的符号被忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，相似性得分。gcg威斯康星遗传软件包版本10中所用的评分矩阵是blosum62(参见henikoff和henikoff，(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：10915，通过引用以其全文结合在此)。

如本文使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在指定比较窗口上对齐最大对应性时，两个序列中的相同残基。当使用关于蛋白质的序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常相差保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调节序列同一性百分比，以校正该取代的保守性质。相差这些保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的方法是本领域技术人员所熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，并且非保守取代的得分为零时，保守取代的得分在零和1之间。计算保守取代的评分，例如，如在程序pc/gene(易达利遗传学公司(intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州)中实现的。

如本文使用的，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)相比，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指，使用比对程序使用标准参数与参比序列比较时，多核苷酸包含具有至少70％序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％、和最优选至少95％序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，可以适当地调整这些值以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指至少60％、70％、80％、90％和至少95％的序列同一性。

核苷酸序列实质相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，严格条件被选择为在所限定的离子强度和ph下比特定序列的tm低约5℃。然而，严格条件涵盖比tm低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文其他部分所限制的所需的严格程度。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上相同的，则这些核酸仍然是实质上相同的。例如，当使用遗传编码允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸时，这可能发生。两个核酸序列实质上相同的一个指征是，第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。

本文所公开的组织偏好性启动子及其变体和片段可用于植物的基因工程，例如，用于产生转化的或转基因的植物，来表达目的表型。如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文使用的，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。

通过以下来产生转基因事件：用包含核酸表达盒的异源dna构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的基因；再生由该转移的基因插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化株和另一个植物之间有性杂交所产生的子代，其中所述子代包含异源dna。

术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子和植物的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如单细胞、原生质体、胚胎和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。

本披露还包括通过本文所披露的任何方法或组合物获得的植物。本公开还包括来自通过本文公开的任何方法或组合物获得的植物的种子。术语“植物”是指完整植物、植物器官(例如：叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚胎及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟及成熟的胚胎、未成熟合子胚、未成熟子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、器官发生性愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶基、成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、胚轴、分生组织区域、愈伤组织、叶细胞、茎细胞、根细胞、芽细胞、配子体、孢子体、花粉和小孢子。植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的培养细胞(例如单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中的。籽粒意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，其条件是这些子代、变体和突变体包含引入的多核苷酸。

本公开可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物，包括但不限于玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属。单子叶植物包括但不限于大麦，玉蜀黍(玉米)、粟(例如，珍珠粟(蜡烛稗)、猪粟(黍稷(panicummiliaceum))、狐尾粟(粟米(setariaitalica))、龙山粟(龙爪稷(eleusinecoracana))、燕麦、稻、黑麦、狗尾草属物种，高粱，黑小麦属或小麦，或叶和茎作物，包括但不限于竹子、滨草、草地早熟禾、芦苇、黑麦草、甘蔗；草坪草(lawngrass)，观赏草以及其他草如柳枝稷和草皮草。可替代地，本发明中使用的双子叶植物包括但不限于羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、花生、木薯、大豆、低芥酸油菜、向日葵、红花、烟草、拟南芥或棉花。

本公开可以使用高等植物，例如被子植物和裸子植物的纲。适用于本公开的合适物种的植物可以来自爵床科、葱科、六出花科、石蒜科、夹竹桃科、棕榈科、菊科、小檗科、胭脂树科、十字花科、凤梨科、大麻科、石竹科、三尖杉科、藜科、秋水仙科、葫芦科、薯蓣科、麻黄科、古柯科、大戟科、豆科、唇形科、亚麻科、石松科、锦葵科、黑药花科、芭蕉科、桃金娘科、蓝果树科、罂粟科、松科、车前科、禾本科、蔷薇科、茜草科、杨柳科、无患子科、茄科、紫杉科、山茶科和葡萄科。可以在本公开的方法中使用来自以下属的成员的植物：秋葵属、冷杉属、槭属、剪股颖属、葱属、六出花属、凤梨属、穿心莲属、须芒草属、蒿属、芦竹属、颠茄属、小檗属、甜菜属、红木属、芸苔属、金盏花属、山茶属、喜树属、大麻属、辣椒属、红花属、长春花属、三尖杉属、菊属、金鸡纳属、西瓜属、咖啡属、秋水仙属、锦紫苏属、黄瓜属、南瓜属、狗牙根属、曼陀罗属、石竹属、洋地黄属、薯蓣属、油棕属、麻黄属、蔗茅属、古柯属、桉属、羊茅属、草莓属、雪花莲属、大豆属、棉属、向日葵属、橡胶树属、大麦属、莨菪属、麻风树属、莴苣属、亚麻属、毒麦属、羽扇豆属、番茄属、石松属、木薯属、苜蓿属、薄荷属、芒属、芭蕉属、烟草属、稻属、黍属、罂粟属、银胶菊属、狼尾草属、矮牵牛属、虉草属、梯牧草属、松属、早熟禾属、一品红属、杨属、萝芙木属、蓖麻属、蔷薇属、甘蔗属、柳属、血根草属、赛茛菪属、黑麦属、茄属、高粱属、米草属、菠菜属、菊蒿属、红豆杉属、可可属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、蔓长春花属、葡萄属和玉蜀黍属。

对于农业、园艺、生物质生产(用于生产液体燃料分子和其他化学物质)和/或林业重要或有意义的植物可以用于本公开的方法中。非限制性实例包括例如柳枝稷(panicumvirgatum)(风倾草(switchgrass))、巨芒(miscanthusgiganteus)(芒草(miscanthus))、甘蔗属物种(saccharumspp.)(唐甘蔗(sugarcane)、能源甘蔗(energycane))、香脂杨(populusbalsamifera)(杨树(poplar))、棉花(海岛棉(gossypiumbarbadense)、陆地棉(gossypiumhirsutum))、向日葵(helianthusannuus(太阳花(sunflower))、紫花苜蓿(medicagosativa)(苜蓿(alfalfa))、甜菜(betavulgaris)(糖甜菜(sugarbeet))、高粱(两色高粱(sorghumbicolor)、普通高粱(sorghumvulgare))、蔗茅属物种(erianthusspp.)、桔草(andropogongerardii)(大须芒草(bigbluestem))、矮象草(pennisetumpurpureum)(象草(elephantgrass)、虉草(phalarisarundinacea)(利甘草(reedcanarygrass)、百慕大草(cynodondactylon)(狗牙根(bermudagrass)、高羊茅(festucaarundinacea)(牛尾草(tallfescue))、果胶草(spartinapectinata)(草原绳草(prairiecord-grass)、芦竹(arundodonax)(巨芦苇(giantreed))、冬黑麦(secalecereale)(黑麦(rye))、柳属物种(salixspp.)(柳树(willow))、桉属物种(eucalyptusspp.)((桉属，包括巨桉(e.grandis)(及其杂种，被称为“尾巨怪(urograndis)”)、蓝桉(e.globulus)、赤桉(e.camaldulensis)、细叶桉(e.tereticornis)、多枝桉(e.viminalis)、亮果桉(e.nitens)、柳叶桉(e.saligna)和尾叶桉(e.urophylla))、小黑麦属物种(triticosecalespp.)((小麦属-小麦x黑麦)、竹子、红花(carthamustinctorius)(红花(safflower))、小油桐(jatrophacurcas)(麻风树(jatropha))、蓖麻(ricinuscommunis)(蓖麻(castor))、非洲油棕(elaeisguineensis)(棕榈树(palm))、亚麻(linumusitatissimum)(亚麻(flax))、木薯(manihotesculenta)(木薯(cassava))、番茄(lycopersiconesculentum)(西红柿(tomato))、莴苣(lactucasativa)(生菜(lettuce))、菜豆(phaseolusvulgaris)(青豆(greenbeans))、大棉豆(phaseoluslimensis)(利马豆(limabeans))、山黧豆属物种(lathyrusspp.)(豌豆(peas))、天宝蕉(musaparadisiaca)(香蕉(banana))、马铃薯(solanumtuberosum)(土豆(potato))、芸苔属物种(brassicaspp.)(甘蓝型油菜(b.napus)(低芥酸油菜(canola))、芜菁(b.rapa)、芥菜(b.juncea))、甘蓝(brassicaoleracea)(西兰花(broccoli)、花椰菜(eauliflower)、球茎甘蓝(brusselsprouts))、茶树(camelliasinensis)(茶(tea))、草莓(fragariaananassa)(草莓(strawberry))、可可树(theobromacacao)(可可(cocoa))、咖啡树(coffeaarabica)(咖啡(coffee))、欧洲葡萄(vitisvinifera)(葡萄(grape))、凤梨(ananascomosus)(菠萝(pineapple))、指尖椒(capsicumannum)(甜辣椒(hot&sweetpepper))、落花生(arachishypogaea)(花生(peanuts))、甘薯(ipomoeabatatus)(地瓜(sweetpotato))、椰子(cocoshueifera)(椰子(coconut))、柑橘属物种(citrusspp.)(柑橘树(citrustrees))、鳄梨(perseaamericana)(鳄梨树(avocado))、无花果树(无花果(ficuscasica))、番石榴(番石榴(psidiumguajava))、芒果(杧果(mangiferaindica))、橄榄(油橄榄(oleaeuropaea))、番木瓜(caricapapaya)(番木瓜(papaya))、腰果(anacardiumoccidentale)(腰果树(cashew))、澳洲坚果(macadamiaintegrifolia)(麦加多利树(macadamiatree))、巴旦杏(prunusamygdalus)(扁桃(almond))、玉葱(alliumcepa)(洋葱(onion))、香瓜(cucumismelo)(喷鼻瓜(muskmelon))、黄瓜(cucumissativus)(黄瓜(cucumber))、罗马甜瓜(cucumiscantalupensis)(美国甜瓜(cantaloupe))、番南瓜(cucurbitamaxima)(西葫芦(squash))、裸仁南瓜(cucurbitamoschata)(西葫芦(squash))、菠菜(spinaceaoleracea)(菠菜(spinach))、西瓜(citrulluslanatus)(西瓜(watermelon))、黄秋葵(abelmoschusesculentus)(秋葵(okra))、栽培茄(solanummelongena)(茄子(eggplant))、簇生豆(cyamopsistetragonoloba)(瓜尔豆(guarbean))、长角豆(ceratoniasiliqua)(槐豆(locustbean))、胡芦巴(trigonellafoenum-graecum)(苦豆(fenugreek))、绿豆(vignaradiata)(绿夹豆(mungbean))、豇豆(vignaunguiculata)(豇豆(cowpea))、蚕豆(viciafaba)(favabean(favabean))、鹰嘴豆(cicerarietinum)(鸡豆(chickpea))、兵豆(lensculinaris)(小扁豆(lentil))、罂粟(papaversomniferum)(罂粟(opiumpoppy))、东方罂粟(papaverorientale)、红豆杉(taxusbaccata)、短叶红豆杉(taxusbrevifolia)、黄花蒿(artemisiaannua)、大麻(cannabissativa)、喜树(camptothecaacuminate)、长春花(catharanthusroseus)、日日春(vincarosea)、金鸡纳树(cinchonaofficinalis)、秋水仙(colchicumautumnale)、加州藜芦(veratrumcalifornica.)、毛花洋地黄(digitalislanata)、紫花洋地黄(digitalispurpurea)、薯蓣属物种(dioscoreaspp.)、穿心莲(andrographispaniculata)、颠茄(atropabelladonna)、曼陀罗(daturastomonium)、小檗属物种(berberisspp.)、三尖杉属物种(cephalotaxusspp.)、草麻黄(ephedrasinica)、麻黄属物种(ephedraspp.)、古柯(erythroxylumcoca)、沃诺里雪花莲(galanthuswornorii)、莨菪属物种(scopoliaspp.)、千层塔(lycopodiumserratum)(蛇足石杉(huperziaserrata)、石松属物种(lycopodiumspp.)、蛇根木(rauwolfiaserpentina)、萝芙木属物种(rauwolfiaspp.)、加拿大血根(sanguinariacanadensis)、天仙子属物种(hyoscyamusspp.)、金盏花(calendulaofficinalis)、小白菊(chrysanthemumparthenium)、毛喉鞘蕊花(coleusforskohlii)、解热菊(tanacetumparthenium)、灰白银胶菊(partheniumargentatum)(银胶菊(guayule))、橡胶树属物种(heveaspp.)(橡胶(rubber))、留兰香(menthaspicata)(薄荷(mint))、欧薄荷(menthapiperita)(薄荷(mint))、红木(bixaorellana)(胭脂树(achiote))、六出花属物种(alstroemeriaspp.)、蔷薇属物种(rosaspp.)(玫瑰(rose))、杜鹃属物种(rhododendronspp.)(杜鹃(azalea))、绣球花(macrophyllahydrangea)(八仙花(hydrangea))、玫瑰木槿(hibiscusrosasanensis)(芙蓉(hibiscus))、郁金香属物种(tulipaspp.)(郁金香(tulips))、水仙属物种(narcissusspp.)(洋水仙(daffodils))、矮牵牛(petuniahybrida)(喇叭花(petunias))、康乃馨(dianthuscaryophyllus)(麝香石竹(carnation))、一品红(euphorbiapulcherrima)(猩猩木(poinsettia))、菊属(chrysanthemum)、烟草(nicotianatabacum)(烟草(tobacco))、白羽扇豆(lupinusalbus)(羽扇豆(lupin))、圆锥北美穗草(uniolapaniculata)(燕麦(oats))、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(agrostisspp.))、颤杨(populustremuloides)(山杨(aspen))、松属物种(pinusspp.)(松树(pine))、冷杉属物种(abiesspp.)(冷杉(fir))、槭属物种(acerspp.)(槭树(maple))、大麦(hordeumvulgare)(大麦(barley))、早熟禾(poapratensis)(蓝草(bluegrass))、毒麦属物种(loliumspp.)(黑麦草(ryegrass))、梯牧草(phleumpratense)(梯牧草(timothy))、和针叶树(conifers)。

针叶树可以在本公开中使用，并且包括例如松树如火炬松(loblollypine，pinustaeda)、湿地松(slashpine，pinuselliotii)、杰克松(西黄松(pinusponderosa))、黑松(小干松(pinuscontorta))以及蒙特利松树(辐射松(pinusradiata))；花旗松(douglas-fir，pseudotsugamenziesii)；东方或加拿大铁杉(加拿大铁杉)；西部铁杉(异叶铁杉)；高山铁杉(mountainhemlock)(大果铁杉(tsugamertensiana))；美洲落叶松或落叶松(美国西部落叶松)；美国西加云杉(白云杉(piceaglauca))；红杉(北美红杉(sequoiasempervirens))；冷杉如银杉(温哥华冷杉(abiesamabilis))和香脂冷杉(加拿大胶杉(abiesbalsamea))；以及雪松，如美国西部侧柏(北美香柏(thujaplicata))以及阿拉斯加黄杉(alaskayellow-cedar)(黄扁柏(chamaecyparisnootkatensis))。

草皮草可用于本公开中，并且包括但不限于：一年生早熟禾(早熟禾)、一年生黑麦草(多花黑麦草)、加拿大早熟禾(扁早熟禾)、细弱剪股颖(colonialbentgrass、agrostistenuis)、匍匐剪股颖(creepingbentgrass、agrostispalustris)、麦穗草(沙生冰草)、扁穗冰草(冰草)、硬羊茅(苇草(festucalongifolia))、肯塔基蓝草(草地早熟禾)、鸭茅(猫尾草)、多年生黑麦草(黑麦草)、红狐茅(紫羊茅)、小糠草(白翦股颖)、粗茎早熟禾(普通早熟禾)、羊茅(sheepfescue)(酥油草)、无芒雀麦(无芒雀麦草)、梯牧草(timothy、phleumpratense)、绒毛剪股颖(velvetbentgrass、agrostiscanina)、碱茅(weepingalkaligrass、puccinelliadistans)、西部麦草(蓝茎冰草)、圣奥古斯丁草(偏序钝叶草)、结缕草(结缕草属物种)、百喜草(bahiagrass、paspalumnotatum)、冰结草地(类地毯草)、百足草(假俭草)、隐花狼尾草(铺地狼尾草)、海滨雀稗(海雀稗)、蓝奶奶草(bluegramma)(格兰马草)、野牛草(buffalograss、buchloedactyloids)、边燕麦奶草(sideoatsgramma)(垂穗草)。

在特定方面中，本公开的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、稻、高粱、小麦、粟、烟草等)。可用于本公开的其他植物包括大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马铃薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属和甜瓜。

由本公开的启动子序列表达的另外的异源编码序列、异源多核苷酸和目的多核苷酸可以用于改变植物的表型。表型的各种变化是所关注的，包括修饰基因在植物中的表达，改变植物对病原体或昆虫的防御机制，提高植物对除草剂的耐受性，改变植物发育以响应环境胁迫，调控植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱等的响应。这些结果可通过表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来获得。在特定方面中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提升的植物内源序列。可以通过提供改变的一个或多个内源基因产物(特别是激素、受体、信号分子、酶、转运蛋白或辅因子)的表达或通过影响植物中的营养摄取来获得结果。如本文公开的启动子提供的组织偏好性表达可以改变基因产物表达。这些改变导致转化的植物的表型的变化。在某些方面，由于表达模式是组织偏好性的，所以表达模式可用于许多类型的筛选。

本公开的目的核苷酸序列的一般类别包括，例如涉及信息的那些基因(例如锌指)，涉及通讯的那些基因(例如激酶)，以及涉及管家的那些基因(例如热休克蛋白)。转基因的更具体的类别例如包括编码农艺学、昆虫抗性、抗病性、除草剂抗性、环境胁迫抗性(对寒冷、盐、干旱等的耐受性改变)和谷物特征的重要性状的基因。仍另外的转基因种类包括从植物和其他真核生物以及原核生物诱导外源性产物(如酶、辅因子及激素)的表达的基因。应认识到，任何目的基因或多核苷酸可以可操作地连接至本公开的启动子并在植物中表达。

多个目的基因可以可操作地连接至本公开的启动子并在植物中表达，例如wus/wox基因可以与昆虫抗性性状堆叠，所述昆虫抗性性状也可以与一种或多种其他输入性状(例如除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、疾病抗性、雄性不育性、茎秆强度等)或输出性状(例如产量增加、变性淀粉、油谱改善、氨基酸平衡、高赖氨酸或甲硫氨酸、消化率提高、纤维质量改善、干旱抗性，营养增强等)堆叠。

本公开的启动子可以与影响谷物品质的重要农艺性状可操作地连接，例如饱和与不饱和的油的水平(增加油酸含量)和类型、必需氨基酸的质量和数量、增加赖氨酸和硫的水平、纤维素的水平以及淀粉和蛋白质含量。本公开的启动子可以可操作地连接至在玉米中提供戈多硫蛋白(hordothionin)蛋白质修饰的基因，其在美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802和5,703,049中描述；所述文献通过引用以其全文结合在此。可以与本公开的启动子可操作地连接的基因的另一个实例是大豆2s白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白(描述于1996年3月20日提交的美国专利号5,850,016)和大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂(williamson，等人，(1987)eur.j.biochem[欧洲生物化学杂志]165：99-106)，所述文献的公开通过引用以其全文结合在此。

本公开的启动子可以可操作地连接至抗昆虫基因，所述抗昆虫基因编码对严重影响产量的有害生物的抗性，这些有害生物例如根虫、切根虫、欧洲玉蜀黍螟等。此类基因包括，例如，苏云金芽孢杆菌毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881和geiser，等人，(1986)gene[基因]48：109)，所述文献的公开通过引用以其全文结合在此。可以与本公开的启动子可操作地连接的编码抗病性状的基因包括，例如，解毒基因，例如将伏马菌素解毒的那些基因(美国专利号5,792,931)；无毒(avr)和抗病性(r)基因(jones，等人，(1994)science[科学]266：789；martin，等人，(1993)science[科学]262：1432；andmindrinos，等人，(1994)cell[细胞]78：1089)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

可以与本公开的启动子可操作地连接的除草剂抗性性状包括编码对具有抑制乙酰乳酸合酶(als)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂(例如含有导致这种抗性突变(特别是s4和/或hra突变)的乙酰乳酸合酶(als)基因))具有抗性的基因、编码对具有抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂(例如草丁瞵或basta(例如bar基因))具有抗性的基因、编码对草甘膦具有抗性的基因(例如，epsps基因和gat基因；例如，参见美国专利申请公开号2004/0082770和wo03/092360，所述文献通过引用以其全文结合在此)或其他本领域已知的此类基因。bar基因编码对除草剂basast的抗性，nptii基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且als基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性，所有这些都可以与本公开的启动子可操作地连接。

草甘膦抗性由突变型5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸酯合酶(epsp)和aroa基因(其可与本公开的启动子可操作地连接)赋予。参见，例如shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。授予barry等人的美国专利5,627,061也描述了编码epsps酶的基因，所述基因可以可操作地连接至本公开的启动子。还参见，美国专利号6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288以及国际公开wo97/04103；wo97/04114；wo00/66746；wo01/66704；wo00/66747和wo00/66748，其通过引用以其全文结合在此。草甘膦抗性也赋予表达可与本公开启动子可操作连接的基因的植物，所述基因编码如美国专利号5776760和5463175(其通过引用以其全文结合在此)中更全面地描述的草甘膦氧化还原酶。草甘膦抗性也可以通过编码草甘膦n-乙酰基转移酶的基因的过表达而赋予植物，所述基因可以与本公开的启动子可操作地连接。参见，例如美国专利申请序列号11/405,845和10/427,692，所述文献通过引用以其全文结合在此。

可操作地连接至本公开的启动子的不育基因也可以在dna构建体中编码，并提供物理去雄的替代方法。以这种方式使用的基因的实例包括美国专利号5,583,210(通过引用以其全文结合在此)中所描述的雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因(如qm)。可以与本公开的启动子可操作地连接的其他基因包括激酶和编码对雄或雌配子体发育有毒的化合物的那些。

商业性状也可以编码在与本公开的启动子可操作地连接的一个或多个基因上，所述基因可以增加例如用于乙醇生产的淀粉或提供蛋白质的表达。转化植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如在美国专利号5,602,321(通过引用以其全文结合在此)中所述。基因(如β酮硫解酶、phb酶(聚羟基丁酸酯合酶)、及乙酰乙酰辅酶a还原酶可以可操作地连接本公开的启动子(参见schubert等人.，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847，其通过引用以其全文结合在此))促进聚羟基链烷酸酯(pha)的表达。

可以与本公开的启动子可操作地连接的其他适用基因及其相关表型的实例包括编码病毒外壳蛋白和/或rna的基因或者赋予病毒抗性的其他病毒基因或者植物基因；赋予真菌抗性的基因；促进产量提高的基因；以及提供针对胁迫的抗性的基因，所述胁迫诸如为寒冷、因干旱、热和盐度引起的脱水、有毒金属或者痕量元素等。

通过说明的方式，而无意于限制，以下是可与本公开的启动子序列可操作地连接的基因类型的其他实例的列表。

1.转基因，其赋予对昆虫或疾病的抗性并编码：

(a)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(r)的产物与病原体中相应的无毒性(avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程改造对具体病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如jones等人，(1994)science[科学]266：789(cloningofthetomatocf-9geneforresistancetocladosporiumfulvum[克隆番茄cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；martin等人，(1993)science[科学]262：1432(tomatoptogeneforresistancetopseudomonassyringaepv.tomatoencodesaproteinkinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变体的番茄pto基因编码蛋白激酶])；mindrinos等人，(1994)cell[细胞]78：1089(arabidopsisrsp2geneforresistancetopseudomonassyringae[用于抵抗丁香假单胞菌的拟南芥属rsp2基因])；mcdowell和woffenden，(2003)trendsbiotechnol.[生物技术趋势]21(4)：178-83；和toyoda等人，(2002)transgenicres.[转基因研究]11(6)：567-82；所述文献通过引用以其全文结合在此。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。

(b)苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，geiser等人，(1986)gene[基因]48：109，其公开了btδ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的dna分子可购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(美国马里兰州罗克韦尔市(rockville，md.))，例如atcc登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程改造的苏云金芽孢杆菌转基因的其他实例在以下专利和专利申请中给出，并为此目的通过引用并入本文：美国专利号5,188,960；5,689,052；5,880,275；wo91/14778；wo99/31248；wo01/12731；wo99/24581；wo97/40162和美国申请序列号10/032,717；10/414,637和10/606,320，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(c)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素、其变体、基于其的模拟物、或其拮抗剂或激动剂。参见例如，hammock等人，(1990)nature[自然]344：458公开了经克隆的保幼激素酯酶(保幼激素的灭活剂)的杆状病毒表达，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(d)昆虫特异性肽，其表达时破坏受影响害虫的生理学。例如，参见regan，(1994)j.biol.chem.[生物化学杂志]269：9的公开内容(表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的dna)；pratt等人，(1989)biochem.biophys.res.comm.[生物化学与生物物理研究通讯]163：1243(在diplopterapuntata中识别出了阿洛斯德汀(allostatin))；chattopadhyay等人，(2004)criticalreviewsinmicrobiology[微生物学评论]30(1)：33-54；zjawiony，(2004)jnatprod[天然产物杂志]67(2)：300-310；carlini和grossi-de-sa，(2002)toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；ussuf等人，(2001)currsci.[当代科学]80(7)：847-853以及vasconcelos和oliveira，(2004)toxicon[毒素]44(4)：385-403，所述文献通过引用以其全文结合在此。还参见tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(e)引起单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯基丙烷衍生物或具有杀昆虫活性的另一种非蛋白质分子超积累的酶。

(f)参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，scott等人的pct申请号wo93/02197，其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列，将该文献通过引用以其全文结合在此。含有几丁质酶编码序列的dna分子可以例如从atcc登录号39637和67152下获得。还参见，kramer等人，(1993)insectbiochem.molec.biol.[昆虫生物化学与分子生物学]23：691，他们教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cdna的核苷酸序列；以及kawalleck等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：673，他们提供了欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列；美国专利申请序列号10/389,432、10/692,367以及美国专利号6,563,020；所述文献通过引用以其全文结合在此。

(g)刺激信号转导的分子。例如，参见botella等人，(1994)plantmolec.biol.[植物分子生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cdna克隆的核苷酸序列；以及griess等人，(1994)plantphysiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cdna克隆的核苷酸序列；所述文献通过引用以其全文结合在此。

(h)疏水性瞬时肽。参见，pct申请号wo95/16776和美国专利号5,580,852(公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物)以及pct申请号wo95/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)；所述文献通过引用以其全文结合在此。

(i)膜透性酶，一种通道形成剂或通道阻断剂。例如，参见jaynes等人，(1993)plantsci.[植物科学]89：43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)具有抗性的转基因烟草植物，通过引用以其全文结合在此。

(j)病毒侵入性蛋白或其衍生的复合毒素。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。参见，beachy等人，(1990)ann.rev.phytopathol.[植物病理学年评]28：451，将该文献通过引用以其全文结合在此。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。

(k)昆虫特异性抗体或其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。参看taylor等人，摘要#497，关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会(seventhint′lsymposiumonmolecularplant-microbeinteractions)(苏格兰爱丁堡(edinburgh，scotland)，1994)(通过生产单链抗体片段在转基因烟草中的酶失活)；将该文献通过引用以其全文结合在此。

(l)病毒特异性抗体。参见，例如tavladoraki等人，(1993)nature[自然]366：469，他们示出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(m)在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。因此，真菌内α-1，4-d-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1，4-d-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见，lamb等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：1436，将该文献通过引用以其全文结合在此。以下文献描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征：toubart等人，(1992)plantj.[植物杂志]2：367，通过引用以其全文结合在此。

(n)在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白。例如，logemann等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：305已经表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌病的抗性，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(o)参与系统获得抗性(sar)应答的基因和/或发病机制相关基因。briggs，(1995)currentbiology[当代生物学]5(2)：128-131，pieterse和vanloon，(2004)curr.opin.plantbio.[植物生物学新观点]7(4)：456-64以及somssich，(2003)cell[细胞]113(7)：815-6，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(p)抗真菌基因(cornelissen和melchers，(1993)pl.physiol.[植物生理学]101：709-712；和parijs等人，(1991)planta[植物]183：258-264；以及bushnell等人，(1998)can.j.ofplantpath.[加拿大植物病理学杂志]20(2)：137-149)。还参见美国专利申请号09/950,933，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如参见美国专利号5,792,931，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(r)胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。参见美国申请序列号10/947,979，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(s)防御素基因。参见wo03/000863和美国申请序列号10/178,213，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(t)赋予对线虫的抗性的基因。参见，wo03/033651和urwin等人，(1998)planta[植物]204：472-479，williamson(1999)curropinplantbio.[植物生物学新观点]2(4)：327-31，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(u)赋予对炭疽茎腐病(由真菌禾生炭疽菌引起)的抗性的基因，如rcgl。参见，jung等人，generation-meansanalysisandquantitativetraitlocusmappingofanthracnosestalkrotgenesinmaize[玉米中炭疽茎腐病基因的代平均值分析和数量性状基因座谱图]，theor.appl.genet.[理论与应用遗传学](1994)89：413-418，以及美国临时专利申请号60/675,664，所述文献通过引用以其全文结合在此。

2.赋予对除草剂的抗性的转基因，例如：

(a)抑制生长点或分生组织的除草剂，如咪唑啉酮或磺酰脲。此类别的示例性基因编码突变体als和ahas酶，分别如以下文献中所述：lee等人，(1988)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和miki等人，(1990)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见，美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,378,824以及国际公开wo96/33270，其通过引用以其全文结合在此。

(b)草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(epsp)和aroa基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(pat)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(acc酶抑制剂编码基因)。参见，例如shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码epsps酶的基因。还参见，美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e和5,491,288以及国际公开ep1173580；wo01/66704；ep1173581和ep1173582，其通过引用以其全文结合在此。还对表达编码草甘磷氧化还原酶的基因的植物赋予草甘磷抗性，这在美国专利号5,776,760和5,463,175(其通过引用以其全文结合在此)中进行了更全面地描述。另外，可通过过量表达编码草甘磷n-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利申请序列号11/405,845和10/427,692以及pct申请号us01/46227，所述文献通过引用以其全文结合在此。编码突变aroa基因的dna分子可以在atcc登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于comai的美国专利号4,769,061中，将该文献通过引用以其全文结合在此。kumada等人的欧洲专利申请号0333033和goodman等人的美国专利号4,975,374公开了赋予除草剂(如l-草丁膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列，所述文献通过引用以其全文结合在此。leemans等人的欧洲专利号0242246和0242236、以及degreef等人，(1989)bio/technology[生物/技术]7：61(其描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生)提供了草丁膦-乙酰基-转移酶基因的核苷酸序列，所述文献通过引用以其全文结合在此。还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616b1和5,879,903，所述文献通过引用以其全文结合在此。赋予苯氧基丙酸和环己酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是accl-s1、accl-s2和accl-s3基因，它们描述于marshall等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]83：435中，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(c)抑制光合作用的除草剂，如三嗪(psba基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。przibilla等人，(1991)plantcell[植物细胞]3：169描述了用编码突变体psba基因的质粒对衣藻进行的转化，将该文献通过引用以其全文结合在此。stalker的美国专利号4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的dna分子可在atcc登录号53435、67441和67442下获得，将该文献通过引用以其全文并入本文。编码谷胱甘肽s-转移酶的dna的克隆和表达描述于hayes等人，(1992)biochem.j.[生物化学杂志]285：173中，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(d)乙酰羟酸合酶，已经发现其使表达该酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性，已经被引入到各种植物中(参见，例如，hattori等人，(1995)molgengenet.[分子和普通遗传学]246：419，将该文献通过引用以其全文结合在此)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素p4507a1和酵母nadph-细胞色素p450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(shiota等人，(1994)plantphysiol[植物生理学]106(1)：17-23)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(aono等人，(1995)plantcellphysiol[植物细胞生理学]36：1687)和各种磷酸转移酶的基因(datta等人，(1992)plantmolbiol[植物分子生物学]20：619)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(e)原卟啉原氧化酶(protox)是叶绿素的生成所必需的，而叶绿素是所有植物存活所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破坏。含有对这些除草剂具有抗性的经改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的发育描述于美国专利号6,288,306b1、6,282,837b1和5,767,373；以及国际公开号wo01/12825中，所述文献通过引用以其全文结合在此。

3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因，

例如：

(a)改变的脂肪酸，例如，通过以下方式：

(1)下调硬脂酰-acp去饱和酶以提高植物的硬脂酸含量。参见，knultzon等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：2624和wo99/64579(genesfordesaturasestoalterlipidprofilesincorn[改变玉米中脂质谱的去饱和酶的基因])，所述文献通过引用以其全文结合在此；

(2)通过fad-2基因修饰升高油酸和/或通过fad-3基因修饰降低亚麻酸(参见，美国专利号6,063,947、6,323,392、6,372,965和wo93/11245，所述文献通过引用以其全文结合在此)；

(3)改变共轭的亚麻酸或亚油酸含量，如wo01/12800中，将该文献通过引用以其全文结合在此；

(4)改变lec1、agp、dek1、superall、milps、各种lpa基因(如lpa1、lpa3、hpt或hggt)。例如，参见，wo02/42424、wo98/22604、wo03/011015，美国专利号6,423,886、美国专利号6,197,561、美国专利号6,825,397，美国专利申请公开号2003/0079247、2003/0204870、wo02/057439、wo03/011015以及rivera-madrid等人，(1995)proc.natl.acad.sci.[美国国家科学院院刊]92：5620-5624，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(b)改变的磷含量，例如，通过

(1)引入植酸酶编码基因将促进植酸盐的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸根。例如，参见vanhartingsveldt等人，(1993)gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列，将该文献通过引用以其全文结合在此。

(2)上调降低植酸盐含量的基因。在玉米中，这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如lpa等位基因(在以低水平植酸为特征的玉米突变株中鉴定到)相关的dna进行克隆并再引入，如raboy等人，(1990)maydica[美迪卡杂志]35：383中所述，和/或通过改变肌醇激酶活性，如wo02/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、wo03/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、wo99/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、wo2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、wo98/45448、wo99/55882、wo01/04147中所述，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(c)例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因，或改变硫氧还蛋白如ntr和/或trx(参见，美国专利号6,531,648，将该文献通过引用以其全文结合在此)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体如cs27或tusc27或en27的基因(参见，美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488和2005/0204418，将这些文献通过引用以其全文结合在此)来产生改变的碳水化合物。参见，shiroza等人，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]，170：810(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，steinmetz等人，(1985)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，pen等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：292(生产表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物)，elliot等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，等人，(1993)j.biol.chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和fisher等人，(1993)plantphysiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶ii)，wo99/10498(通过修饰udp-d-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、ref1、hchl、c4h而改进的消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(agp)生产高油种子的方法)，所述文献通过引用以其全文结合在此。以上提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。

(d)改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见涉及通过改变植基异戊烯基转移酶(ppt)来操纵抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和wo00/68393，涉及通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)来操纵抗氧化剂水平的wo03/082899，所述文献通过引用以其全文结合在此。

(e)改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸的积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸的积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、wo99/40209(改变种子中氨基酸组成)、wo99/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(改变种子中氨基酸组成)、wo98/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、wo98/56935(植物氨基酸生物合成酶)、wo98/45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程化的种子蛋白)、wo98/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的必需氨基酸的限定的结构的合成储存蛋白，用于改进植物的营养价值)、wo96/01905(苏氨酸增加)、wo95/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、wo01/79516和wo00/09706(cesa：纤维索合酶)、美国专利号6,194,638(半纤维素)、美国专利号6,399,859和美国专利申请公开号2004/0025203(udpgdh)、美国专利号6,194,638(rgp)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

4.创建用于位点特异性dna整合的位点的基因

这包括引入可以在flp/frt系统中使用的frt位点和/或可以在cre/loxp系统中使用的lox位点。例如，参见lyznik等人，(2003)plantcellrep[植物细胞报告]21：925-932和wo99/25821，将这些文献通过引用以其全文结合在此。可以使用的其他系统包括噬菌体mu的gin重组酶(maeser等人，1991；vickichandler，themaizehandbook[玉米手册]第118章(施普林格出版社，1994))、大肠杆菌的pin重组酶(enomoto等人，1983)和psr1质粒的r/rs系统(araki等人，1992)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

5.影响非生物胁迫抗性(包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮响应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性)和胁迫下产量提高的基因。例如，参见wo00/73475，其中通过改变苹果酸盐而改变水利用效率；描述基因(包括cbf基因)和转录因子(这些基因和转录因子有效于减轻冻害、高盐度和干旱对植物的负面影响，并对植物表型赋予其他正向影响)的美国专利号5,892,009、美国专利号5,965,705、美国专利号5,929,305、美国专利号5,891,859、美国专利号6,417,428、美国专利号6,664,446、美国专利号6,706,866、美国专利号6,717,034、wo2000060089、wo2001026459、wo2001035725、wo2001034726、wo2001035727、wo2001036444、wo2001036597、wo2001036598、wo2002015675、wo2002017430、wo2002077185、wo2002079403、wo2003013227、wo2003013228、wo2003014327、wo2004031349、wo2004076638、wo9809521、和wo9938977；美国专利申请公开号2004/0148654和wo01/36596，其中植物中的脱落酸被改变，导致植物表型改进，如产量提高和/或对非生物胁迫的耐受性提高；wo2000/006341、wo04/090143、美国专利申请序列号10/817483和美国专利号6,992,237，其中细胞分裂素表达被改变，产生胁迫耐受性(如耐旱性)提高和/或产量提高的植物，所述文献通过引用以其全文结合在此。还参见wo0202776、wo2003052063、jp2002281975、美国专利号6,084,153、wo0164898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(氮利用率的提高和氮响应性的改变)，所述文献通过引用以其全文结合在此。关于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号2003/0166197和wo200032761，所述文献通过引用以其全文结合在此。关于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见例如美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852，所述文献通过引用以其全文结合在此。

6.影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或渗入到植物中，参见例如wo97/49811(lhy)、wo98/56918(esd4)、wo97/10339和美国专利号6,573,430(tfl)、美国专利号6,713,663(ft)、wo96/14414(con)、wo96/38560、wo01/21822(vrn1)、wo00/44918(vrn2)、wo99/49064(gi)、wo00/46358(fri)、wo97/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(gai)、wo99/09174(d8和rht)以及wo2004076638和wo2004031349(转录因子)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

可操作地连接至本文公开的启动子序列及其相关生物活性片段或变体的异源核苷酸序列可以是靶基因的反义序列。术语“反义dna核苷酸序列”是指与该核苷酸序列的5′至3′正常方向相反的方向的序列。当反义dna序列被递送到植物细胞中时，其阻止了靶向的基因的dna核苷酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码rna转录物，所述rna转录物与通过靶向的基因的dna核苷酸序列的转录产生的内源信使rna(mrna)互补并能够杂交。在这种情况下，抑制了由靶向的基因编码的天然蛋白的产生，以实现所需的表型应答。可以对该反义序列作出修饰，只要该序列与相应的mrna杂交并干扰相应的mrna的表达。在该方式中，可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可以用来破坏该靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。因此，本文披露的启动子序列可以有效地连接至反义dna序列，以降低或抑制植物中天然蛋白的表达。

“rnai”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利号6,506,559，通过引用以其全文结合在此)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义rna转录物，以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义rna转录物(美国专利号5,231,020，将其通过引用以其全文结合在此)。此类技术依赖于使用能导致积累这样的双链rna的构建体，该双链rna中的一条链与待沉默的靶基因互补。本公开的启动子序列可用来驱动将会产生rna干扰的构建体(包括微rna和sirna)的表达。

如本文所用，术语“启动子”或“转录起始区”意为dna调节区，其通常包含tata盒或能够指导rna聚合酶ii在特定编码序列的适当的转录起始位点起始rna合成的dna序列。启动子可以另外地包含通常位于tata盒上游或5′的其他识别序列或能够指导rna聚合酶ii起始rna合成的dna序列，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。认识到虽然已经鉴定了本文公开的启动子区域的核苷酸序列，在此处鉴定的特定启动子区域上游的5’非翻译区中分离和鉴定其他启动子在本领域的水平内。另外，可以提供嵌合启动子。这样的嵌合体包括与异源转录调节区的片段和/或变体融合的启动子序列的部分。因此，本文公开的启动子区域可包含上游启动子，例如负责编码序列的组织表达和时间表达的启动子，增强子，等。

如本文所用，术语“调控元件”也指dna序列，所述dna序列通常但不总是在结构基因的编码序列上游(5’)，所述dna序列包括通过以下方式控制编码区表达的序列：提供对从特定位点开始转录所需的rna聚合酶和/或其他因子的识别。提供对rna聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调节元件的实例是启动子元件。启动子元件包括负责转录起始的核心启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件。应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。合适的内含子的实例包括但不限于玉米ivs6内含子或玉米肌动蛋白内含子。调节元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)、或转录的区域内、或两者处的元件。在本公开的上下文中，转录后调节元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mrna稳定性决定子。

可将本公开的启动子或其变体或片段与异源调节元件或启动子可操作地关联，以调控异源调节元件的活性。此类调控包括增强或抑制异源调节元件的转录活性、调控转录后事件、或者增强或抑制异源调节元件的转录活性并调控转录后事件。例如，可将本公开的一个或多个启动子或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启动子或其片段可操作地关联，以调控这种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性。

当本公开的启动子序列或其变体或其片段可操作地连接至目的形态发生基因和/或异源核苷酸序列时，可以驱动形态发生基因和/或异源核苷酸序列在植物的l1组织中稳定或瞬时表达。

在本公开全文中使用的“异源核苷酸序列”、“目的异源多核苷酸”或“异源多核苷酸”是与本发明的启动子序列不是天然地一起存在的或是与本发明的启动子序列可操作地连接的序列。虽然这种核苷酸序列对启动子序列来说是异源的，但相对植物宿主，可以是同源的或天然的、或者异源的、或者外来的。同样，启动子序列对于植物宿主和/或目的多核苷酸可以是同源的或天然的或异源的或外来的。

可对本公开的分离的启动子序列进行修饰，使所述异源核苷酸序列以一系列水平表达。因此，可利用完整启动子区域的一部分，且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到，可采用不同方式缺失启动子序列的一部分，来改变mrna的表达水平。可降低mrna表达水平，或者可替代地，如果例如在截短过程中有负调节元件(对于阻遏子)被去除的话，则由于启动子缺失，可以增加表达。通常，分离的启动子序列的至少约20个核苷酸将用于驱动核苷酸序列的表达。

应认识到，为提高转录水平，可将增强子与本公开的启动子区域结合使用。增强子是发挥作用以增加启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括sv40增强子区、35s增强子元件等。还知道一些增强子还可以改变正常的启动子表达模式，例如通过引起启动子组成型表达，当不具有增强子时同一启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中表达。

本公开的经分离的启动子序列的修饰可以提供异源核苷酸序列的一系列表达。因此，可将这些调节元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达旨在是指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子以高水平或以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。

公认的是，本公开的启动子可以与其天然编码序列一起使用以增加或减少表达，从而导致转化的植物的表型改变。本文所公开的核苷酸序列(参见表1)及其变体和片段可用于任何植物的遗传操纵。这些调节序列在与待控制其表达以实现所需表型响应的异源核苷酸序列可操作地连接时，可用于这个方面。术语“可操作地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受启动子序列的影响。以此方式，可将本公开的启动子的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一同在表达盒中提供，以便在目的植物中，更具体地，在植物的生殖组织中表达。

在本公开的一个方面，表达盒包含转录起始区，所述转录起始区包含本公开的可操作地连接至形态发生基因和/或异源核苷酸序列的启动子核苷酸序列之一或其变体或其片段。这种表达盒可具有多个限制位点，用于使插入该核苷酸序列的过程受调节区的转录调节。表达盒可另外含有选择性标记基因以及3’终止区。

表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转录起始区(即本公开的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中有功能的转录终止区。各个方面的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，各个方面的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效地连接的目的dna序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可能源自另一种来源(即，对于启动子、被表达的dna序列、植物宿主或其任何组合来说为外源的或异源的)。方便的终止区可获得自根癌农杆菌(a.tumefaciens)的ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见guerineau，等人，(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；proudfoot，(1991)cell[细胞]64：671-674；sanfacon，等人，(1991)genesdev.[基因与发育]5：141-149；mogen，等人，(1990)plantcell[植物细胞]2：1261-1272；munroe，等人，(1990)gene[基因]91：151-158；ballas，等人，(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：7891-7903；以及joshi，等人，(1987)nucleicacidres.[核酸研究]15：9627-9639，所述文献通过引用以其全文结合在此。

包含本公开的序列的表达盒还可含有针对基因、异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸或要共转化入生物体的异源多核苷酸的至少一个另外的核苷酸序列。可替代地，所述一个或多个另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供。

在适当的情况下，可以优化其表达待处于本公开的组织偏好性启动子序列控制下的核苷酸序列和任何另外的一个或多个核苷酸序列，以便在转化的植物中增加表达。也就是说，可使用植物偏好性密码子来合成这些核苷酸序列，从而改进表达。对于宿主偏好性密码子使用的讨论，参见，例如campbell和gowri，(1990)plantphysiol.[植物生理学]92：1-11，通过引用以其全文结合在此。本领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831，5,436,391以及murray，等人，(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：477-498，所述文献通过引用以其全文结合在此。

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将异源核苷酸序列的g-c含量调整至给定细胞宿主的平均水平，所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mrna结构。

表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括但不限于：小核糖核酸病毒前导序列，例如，emcv前导序列(脑心肌炎5’非编码区域)(elroy-stein等人，(1989)proc.nat.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]86：6126-6130)；马铃薯y病毒组前导序列，例如，tev前导序列(烟草蚀纹病毒)(gallie等人，(1986)gene[基因]154：9-20)；mdmv前导序列(玉米矮花叶病毒)、人类免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)(macejak等人，(1991)nature[自然]353：90-94)；来自苜蓿花叶病病毒的外壳蛋白mrna的非翻译前导序列(amvrna4)(jobling等人，(1987)nature[自然]325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(tmv)(gallie等人，(1989)molecularbiologyofrna[rna的分子生物学]，第237-256页)；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(mcmv)(lommel等人，(1991)virology[病毒学]81：382-385)，所述文献通过引用以其全文结合在此。还参见，della-cioppa等人，(1987)plantphysiology[植物生理学]84：965-968，将该文献通过引用以其全文结合在此。也可采用已知的用来提高mrna稳定性的方法，例如内含子，如玉米泛素内含子(christensen和quail，(1996)transgenicres.[转基因研究]5：213-218；christensen等人，(1992)plantmolecularbiology[植物分子生物学]18：675-689)或者玉米adhi内含子(kyozuka等人，(1991)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]228：40-48；kyozuka等人，(1990)maydica[美迪卡杂志]35：353-357)等，所述文献通过引用以其全文结合在此。

这些方面的dna构建体还可根据需要包含其他增强子(翻译或转录增强子)。这些增强子区域是本领域技术人员众所周知的，并且可以包括atg起始密码子和相邻序列。起始密码子必须与编码序列的阅读框同相，以确保翻译整个序列。翻译控制信号和起始密码子可以来自天然和合成的多种来源。可以从转录起始区的来源或从结构基因提供翻译起始区。所述序列也可以衍生自被选择以表达所述基因的调控元件，并且可以被特异性修饰以增加mrna的翻译。应认识到，为提高转录水平，可将增强子与多个方面的启动子区域结合使用。增强子是本领域已知的，包括sv40增强子区、35s增强子元件等。

在制备表达盒时，可以操作各种dna片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的dna序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的dna、去除限制性位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。

报道基因或选择性标记基因也可以包括在本公开的表达盒中。本领域已知的合适报道基因的实例可以见于例如以下文献：jefferson等人，(1991)plantmolecularbiologymanual[植物分子生物学手册]，gelvin等人编辑(kluweracademicpublishers[克吕韦尔学术出版集团])，第1-33页；dewet等人，(1987)mol.cell.biol.[分子细胞生物学]7：725-737；goff等人，(1990)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；kain等人，(1995)biotechniques[生物技术]19：650-655；和chiu等人，(1996)currentbiology[当代生物学]6：325-330，所述文献通过引用以其全文结合在此。

用于选择转化细胞或者组织的选择性标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于编码对以下具有抗性的基因：氯霉素(herreraestrella等人，(1983)emboj.[欧洲分子生物学杂志]2：987-992)；甲氨蝶呤(herreraestrella等人，(1983)nature[自然]303：209-213；meijer等人，(1991)plantmol.biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(waldron等人，(1985)plantmol.biol.[植物分子生物学]5：103-108和zhijian等人，(1995)plantscience[植物科学]108：219-227)；链霉素(jones等人，(1987)mol.gen.genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(bretagne-sagnard等人，(1996)transgenicres.[转基因研究]5：131-137)；博莱霉素(hille等人，(1990)plantmol.biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺(guerineau等人(1990)plantmol.biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴苯腈(stalker等人，(1988)science[科学]242：419-423)；草甘膦(shaw等人，(1986)science[科学]233：478-481和美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(deblock等人，(1987)emboj.[欧洲分子生物学杂志]6：2513-2518)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

其他可在转基因事件的恢复中发挥实用的基因将包括但不限于以下实例，如：gus(β-葡糖醛酸糖苷酶；jefferson，(1987)plantmol.biol.rep.[植物分子生物学报告]5：387)、gfp(绿色荧光蛋白；chalfie等人，(1994)science[科学]263：802)、荧光素酶(riggs等人，(1987)nucleicacidsres.[核酸研究]15(19)：8115和luehrsen等人，(1992)methodsenzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码用于花青素生产的玉米基因(ludwig等人，(1990)science[科学]247：449)，所述文献通过引用以其全文结合在此。

包含本公开内容的启动子序列(其可操作地连接至形态发生基因，并且任选地进一步可操作地连接至异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸、异源多核苷酸核苷酸或目的序列)的表达盒可用于转化任何植物。以此方式，可以获得经基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等。

如本文所用，“载体”是指用于将核苷酸构建体例如表达盒或构建体引入宿主细胞的dna分子，例如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体典型地含有一个或少量限制性内切核酸酶识别位点，可以以可确定的方式在所述位点插入外来dna序列而不会丧失所述载体的基本生物学功能，以及插入适用于鉴定和选择克隆载体转化的细胞的标记基因。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

本披露的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。如本文使用，“引入”意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于所述序列得以进入所述植物的细胞内部。本披露的方法不取决于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。

“稳定转化”是其中引入到植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。

转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(crossway等人，(1986)biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(riggs等人，(1986)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]83：5602-5606)、农杆菌介导的转化(townsend等人，美国专利号5,563,055和zhao等人，美国专利号5,981,840)、直接基因转移(paszkowski等人，(1984)emboj[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244和；5,932,782；tomes等人，(1995)，在plantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，gamborg和phillips编辑(springer-verlag，berlin[德国柏林施普林格出版公司])；mccabe等人(1988)biotechnology[生物技术]6：923-926)；以及lecl转化法(wo00/28058)。还参见weissinger等人，(1988)ann.rev.genet.[遗传学年鉴]22：421-477；sanford等人，(1987)particulatescienceandtechnology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；christou等人，(1988)plantphysiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；mccabe等人，(1988)bio/technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；finer和mcmullen，(1991)invitrocelldev.biol.[体外细胞与发育生物学]27p：175-182(大豆)；singh等人，(1998)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；datta等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；klein等人，(1988)proc.natl.acadsci.usa[美国国家科学院院刊]85：4305-4309(玉米)；klein等人，(1988)biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,646；klein等人，(1988)plantphysiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；fromm等人，(1990)biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；hooykaas-vanslogteren等人，(1984)nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；bytebier等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；dewet等人，(1985)在theexperimentalmanipulationofovuletissues[卵巢组织的实验操作]中，chapman等人编辑(纽约朗文出版社(longman，newyork))，第197-209页(花粉)；kaeppler等人，(1990)plantcellreports[植物细胞报告]9：415-418和kaeppler等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；d′halluin等人，(1992)plantcell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；li等人，(1993)plantcellreports[植物细胞报告]12：250-255以及christou和ford(1995)annalsofbotany[植物学年鉴]75：407-413(稻)；osjoda等人，(1996)naturebiotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌的玉米)，以上所有文献均通过引用以其全文结合在此。在美国专利2017/0121722(通过引用以其全文并入本文)中也发现了用于快速植物转化的方法和组合物。在植物转化中有用的载体可在美国专利申请序列号15/765,521(通过引用以其全文并入本文)中找到。

在特定方面中，可使用多种瞬时转化方法将包含本披露的启动子序列的dna构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统，和以阻止dna后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，可以从粒子结合的dna进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(pei；西格玛公司(sigma)#p3143)的粒子。

在其他方面中，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本披露的多核苷酸引入植物。通常，这类方法涉及将本披露的核苷酸构建体掺入病毒dna或rna分子内。涉及病毒dna或rna分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和porta，等人，(1996)molecularbiotechnology[分子生物技术]5：209-221，所述文献通过引用以其全文结合在此。

用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个方面中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见例如，wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，所述文献通过引用以其全文结合在此。简言之，可以在转移盒中包含本公开的多核苷酸，所述转移盒侧翼为两个不相同的重组位点。将该转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处。

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，mccormick，等人，(1986)plantcellreports[植物细胞报道]5：81-84，通过引用以其全文并入本文。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的表达的所得子代。可以生长两代或两代以上以确保希望的表型特征的表达稳定保持并且遗传，然后收获种子以确保希望的表型特征已经实现表达。以此方式，本披露提供了基因组中稳定掺入了本披露的核苷酸构建体(例如本披露的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。

有各种各样的方法用于从植物组织再生植物。特定的再生方法将取决于起始植物组织和待再生的特定植物种类。从单个植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域众所周知的(weissbach和weissbach，(1988)在：methodsforplantmolecularbiology[植物分子生物学方法]，(编辑.)，学术出版社公司(academicpress，inc.)，加利福尼亚州圣地亚哥，通过引用以其全文结合在此)。这种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择经转化的细胞，通过胚性发育的通常阶段、通过生根苗阶段培养那些个体化细胞。以同样的方式再生转基因胚和种子。然后将所得的转基因生根芽苗种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反地，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养含有所希望的多核苷酸的所述方面的转基因植物。

所述方面提供了用于筛选化合物的组合物，所述化合物调节植物内的表达。载体、细胞和植物可用于筛选本文公开的调节序列的激动剂和拮抗剂的候选分子。例如，可以将报道基因与调节序列可操作连接并作为转基因在植物中表达。添加待检验的化合物并测量报道基因的表达以确定其对启动子活性的影响。

在一个方面，所公开的方法和组合物可用于以提高的效率和速度将多核苷酸引入体细胞胚中，所述多核苷酸可用于靶向特定位点以在衍生自体细胞胚的植物基因组中进行修饰。可以用所披露的方法和组合物引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。例如，所披露的方法和组合物可以用于将crispr-cas系统引入植物细胞或植物中，出于以下目的：基因组修饰植物或植物细胞的基因组中的靶序列，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所披露的方法和组合物可以与crispr-cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统。所述cas内切核酸酶基因是植物优化的cas9内切核酸酶，其中植物优化的cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。

该cas内切核酸酶由指导核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将其引入细胞的基因组中。该crispr-cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。进一步提供了使用指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和编辑细胞基因组中的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点，这样使得它们包含多种目的多核苷酸。所披露的组合物和方法可以用于引入crispr-cas系统，所述系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由cas内切核酸酶识别的靶位点内部或外部。

crispr基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称spidr--间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的dna基因座的家族。crispr基因座由部分回文的短而高度保守的dna重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为crispr重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于crispr基因座(wo2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。

crispr基因座首次在大肠杆菌中被识别(ishino等人(1987)j.bacterial.[细菌学杂志]169：5429-5433；nakata等人(1989)j.bacterial.[细菌学杂志]171：3553-3556)。相似的间隔短序列重复序列已经在地中海富盐菌(haloferaxmediterranei)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、鱼腥藻属(anabaena)、和结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)中被鉴定出(groenen等人(1993)mol.microbiol.[分子微生物学]10：1057-1065；hoe等人(1999)emerg.infect.dis.[新兴传染病]5：254-263；masepohl等人(1996)biochim.biophys.acta[生物化学与生物物理学学报]1307：26-30；mojica等人(1995)mol.microbiol.[分子微生物学]17：85-93)。该crispr基因座与其他ssr的不同之处在于重复序列的结构，该结构已被命名为短规律间隔重复序列(srsr)(janssen等人(2002)omicsj.integ.biol.[组学：整合生物学杂志]6：23-33；mojica等人(2000)mol.microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。重复序列是以成簇形式发生的短元件，这些短元件总是由以恒定长度的可变序列规律地间隔开(mojica等人(2000)mol.microbiol.[分子微生物学]36：244-246)。

cas基因包括通常与侧翼crispr基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“cas基因”和“crispr相关的(cas)基因”在本文中可互换地使用。对cas蛋白家族的全面综述呈现于以下文献中：haft等人(2005)computationalbiology[计算生物学]，ploscomputbiol[科学公共图书馆计算生物学]1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060。

除了最初描述的四个基因家族之外，在wo/2015/026883中已经描述了另外41个crispr相关(cas)基因家族，将其通过引用结合在此。此参考文献表明crispr系统属于不同类别，具有不同的重复模式、基因的组和种类范围。在给定的crispr基因座处的cas基因数目在物种之间可以不同。cas内切核酸酶涉及由cas基因编码的cas蛋白质，其中所述cas蛋白质能够将双链断裂引入dna靶序列中。cas内切核酸酶由指导多核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将其引入细胞的基因组中。如本文所用，术语“指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统”包括能够将双链断裂引入dna靶序列的cas内切核酸酶和指导多核苷酸的复合物。当由指导核苷酸识别靶序列时，cas内切核酸酶紧邻基因组靶位点解开dna双链体，并且切割两个dna链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(pam)被大致定向在靶序列的3’端(参见2015年2月26日公开的wo/2015/026883的图2a和图2b)。

在一个方面中，该cas内切核酸酶基因是cas9内切核酸酶，例如但不限于，于2007年3月1日公开的wo2007/025097(通过引用并入本文)中的seqidno：462、474、489、494、499、505、以及518中列出的cas9基因。在另一方面，cas内切核酸酶基因是植物、玉蜀黍或大豆优化的cas9内切核酸酶，例如但不限于wo/2015/026883的图1a中显示的那些。在另一方面，cas内切核酸酶基因有效地连接至cas密码子区域上游的sv40核靶向信号和cas密码子区域下游的二分型vird2核定位信号(tinland等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。

在一个方面，cas内切核酸酶基因是wo/2015/026883的seqidno：1、124、212、213、214、215、216、193或seqidno：5的核苷酸2037-6329的cas9内切核酸酶基因，或其任何功能片段或变体。

如与cas内切核酸酶有关，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指本披露的cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。

如与cas内切核酸酶有关，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指本披露的cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。

在一个方面，cas内切核酸酶基因是可以识别n(12-30)ngg型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌cas9基因。

内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割dna而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括i型、ii型、iii型、和iv型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在i型和iii型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(he酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请pct/us12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，所述家族是laglidadg、giy-yig、h-n-h、和his-cysbox家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其dna底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别特征在于针对由独立的orf、内含子、和内含肽编码的酶的前缀f-、i-、或pi-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见，sauer(1994)curropbiotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及sadowski(1993)faseb[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(integrase)或解离酶(resolvase)家族。tal效应子核酸酶是新类别的序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物体的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(miller，等人(2011)naturebiotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(zfn)是由锌指dna结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。zfn包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自ms型内切核酸酶，例如fokl的核酸酶结构域)的工程化dna结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶dna中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。

细菌和古细菌已经进化出了适应性免疫防御，称为成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/crispr-相关的(cas)系统，该系统使用短的rna来引导外源核酸的降解(于2007年3月1日公开的wo2007/025097)。来自细菌的ii型crispr/cas系统采用crrna和tracrrna将cas内切核酸酶指导至其dna靶。该crrna(crisprrna)包含与双链dna靶的一条链互补，并且与tracrrna(反式激活crisprrna)碱基配对形成rna双链体的区域，该rna双链体引导cas内切核酸酶切割dna靶。

如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个rna分子、包含可变靶向结构域的crrna(crisprrna)和tracrrna的合成性融合。在一个方面，该指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与cas内切核酸酶相互作用的rna片段。

如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得cas内切核酸酶能够识别并任选地切割dna靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是rna序列、dna序列或其组合(rna-dna组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(lna)、5-甲基dc、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代a、2′-氟代u、2′-o-甲基rna、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。

指导多核苷酸可以是双分子(也称为双链体指导多核苷酸)，其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。双分子指导多核苷酸的cer结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子。两个单独的分子可以是rna、dna和/或rna-dna组合序列。在一个方面，包含连接到cer结构域的vt结构域的双链体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crdna”(当包含dna核苷酸的连续延伸时)或“crrna”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“crdna-rna”(当包含dna和rna核苷酸的组合时)。该cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的crna的片段。在一个方面，存在于在此披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的crna的片段的大小范围可以是，但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。

在一个方面，包含cer结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrrna”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“tracrdna”(当包含dna核苷酸的连续延伸时)或“tracrdna-rna”(当包含dna和rna核苷酸的组合时)。在一个方面，指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。

指导多核苷酸还可以是单分子，其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。“结构域”意指可以为rna、dna和/或rna-dna组合序列的核苷酸的连续延伸。单指导多核苷酸的vt结构域和/或cer结构域可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一个方面，单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含cer结构域)的cr核苷酸(包含与cer结构域连接的vt结构域)，其中该连接是包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列的核苷酸序列。包含来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列的单指导多核苷酸可以被称为“单指导核苷酸”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“单指导dna”(当包含dna核苷酸的连续延伸时)或“单指导核苷酸-dna”(当包含rna和dna核苷酸的组合时)。在本披露的在一个方面，单指导核苷酸包含可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crispr/cas系统的crna或crna片段和tracrrna或tracrrna片段，其中该指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是，为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒。

术语“可变靶向结构域”或“vt结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链dna靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列结构域(vt结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在一个方面，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸。可变靶向域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列或其任何组合构成。

术语指导多核苷酸的“cas内切核酸酶识别结构域”或“cer结构域”在此可互换地使用，并且包括与cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。cer结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成。

连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一个方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的长度。在另一方面，连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于gaaa四核苷酸环序列。

指导多核苷酸、vt结构域和/或cer结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsrna双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(lna)、5-甲基dc核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代a核苷酸、2′-氟代u核苷酸、2′-o-甲基rna核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。

在一个方面，该指导核苷酸和cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得cas内切核酸酶能够在dna靶位点引入双链断裂。

在本披露的一个方面中，该可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸长度。

在本披露的一个方面，指导核苷酸包含可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crispr/cas系统的crna(或crna片段)和tracrrna(或tracrrna片段)，其中该指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。

在一个方面，还可以通过引入重组dna分子间接地引入指导核苷酸，该重组dna分子包含有效地连接至植物特定启动子的相应的指导dna序列，该启动子能够在植物细胞中转录该指导核苷酸。术语“相应的指导dna”包括与rna分子相同的，但具有“t”取代rna分子的每个“u”的dna分子。

在一个方面，经由粒子轰击或使用所披露的用于重组dna构建体的农杆菌转化的方法和组合物来引入该指导核苷酸，该重组dna构建体包含有效地连接至植物u6聚合酶iii启动子的相应指导dna。

在一个方面，指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。使用指导核苷酸对比双链体crrna-tracrrna的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。

术语“靶位点”、“靶序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体dna和线粒体dna)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。

如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一个方面，靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，例如lig3-4内切核酸酶(美国专利公开2009-0133152a1(2009年5月21日公开))或ms26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)特异性识别和/或结合的dna识别位点或靶位点。

“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物的基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时，所述靶序列包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。

seqidno：1-189的总结列于表1。

表1.seqidno：1-189的总结。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。

实例

本公开的方面在以下实例中进一步定义，除非另有说明，其中份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。这些实例虽然指示了本公开的方面，但是仅以说明的方式给出。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的方面的本质特性，并且在不脱离本披露的精神和范围的情况下，可对其进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

实例1.植物材料和培养基组成

当前的方法可以使用多种组织或外植体类型，包括悬浮培养物、未成熟子叶、成熟子叶、分割的种子、胚轴、下胚轴、上胚轴和叶。表2概述了用于大豆转化、组织培养和再生的各种培养基的组成。在该表中，如果这是转化的起始材料，则将培养基m1用于悬浮培养。培养基m2和m3代表可用于上述所列整个范围的外植体的农杆菌转化的典型共培养培养基。培养基m4可用于选择(使用适当的选择剂)，m5用于体细胞胚成熟，并且培养基m6用于萌发以产生t0苗。

表2.培养基m1-m5的组成

共培养1-5天后，将组织在无选择的m3培养基上培养1周(恢复期)，然后移至选择。为了选择，将抗生素或除草剂添加到m3培养基中以选择稳定的转化体。为了开始针对农杆菌的反选择，还添加了300mg/l(与克拉维酸钾混合的无菌羟基噻吩青霉素二钠，植物培养基公司，都柏林(dublin)，俄亥俄州，美国)，并且在整个选择过程中都将选择剂和保留在培养基中(最多8周)。选择培养基每周更换一次。在选择培养基上放置6-8周后，在漂白(或坏死)的较不健康的组织的背景下，转化的组织显示为可见的绿色组织。将这些组织块再培养4-8周。

然后将绿色健康的体细胞胚转移到含有100mg/l的m5培养基中。在m5培养基上总共培养4周后，将成熟的体细胞胚置于无菌的空皮氏培养皿中，用microporetm胶带(3m健康医疗公司(3mhealthcare)，圣保罗(st.paul)，明尼苏达州，美国)密封或置于塑料盒中(无纤维胶带)在室温下放置4-7天。

将干燥的胚种植在m6培养基中，在26℃下以60-100μe/m²/s的光强度在18小时的光周期中萌发。在萌发培养基中4-6周后，将苗转移到潮湿的jiffy-7泥炭颗粒中(杰夫产品公司(jiffyproductsltd)，希帕根(shippagan)，加拿大)，并密封在透明的塑料托盘盒中，直到在以下条件下在percival恒温箱中适应环境为止，所述条件为：在60-100μe/m²/s，昼/夜温度为26℃/24℃，进行16小时的光照。最后，将硬化的苗盆栽到装有加湿的sungro702的2加仑盆中，并在温室中生长至成熟，育出种子。

实例2大豆的转化

对于大豆的粒子轰击的标准方案(finer和mcmullen，1991，invitrocelldev.biol.-plant[体外细胞发育生物学-植物]27：175-182)、农杆菌介导的转化(jia等人.，2015，intj.mol.sci.[国际分子科学]16：18552-18543；us20170121722；通过引用以其全文结合在此)或苍白杆菌属介导的转化(us20180216123，通过引用以其全文结合在此)可与本公开的方法一起使用。

实例3控制wus表达的gm-ltp3启动子改善大豆转化

农杆菌菌株agl1(含有带有表达盒gm-ltp3pro::at-wus::ubq14term+gm-ubqpro::gm-ubqintron1::tag-rfp::ubq3term+gm-samspro::gm-samsintron1::gm-hra::gm-alsterm(php80730；seqidno：112)的t-dna)用于转化先锋大豆品种phy21。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。九天后，将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥。此时，在带有rfp滤光片组的落射荧光显微镜下，良好形成的成熟体细胞胚发出红色荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发，在温室中产生健康的植物。这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到两个月。

实例4控制wus表达的gm-hbstart3启动子改善大豆转化成熟效率

在难以转化的大豆品种中，通常会观察到在大豆转化过程中形成的许多转基因体细胞胚均无法正常成熟。体细胞胚无法成熟最终导致萌发从而形成可以在温室中存活的转基因苗的频率大大降低。测试了驱动wus表达的启动子(gm-hbstart3(seqidno：1)、gm-ltp3(seqidno：124)、gm-hbstart2(seqidno：108)、gm-mate1(seqidno：109)、gm-ned1(seqidno：110))以确定它们对大豆转化成熟效率的影响。驱动wus表达(php81343；seqidno：116)的gm-hbstart3启动子(seqidno：1)极大地改善体细胞胚胎成熟的效率，使成熟效率从tag-rfp对照(php80728；seqidno：111)中的中值低于8％至超过50％。参见图1。这直接转化为能够萌发形成转基因t0植物的转基因成熟体细胞胚的频率增加。参见图3a和3b。

使用其他启动子来驱动wus的表达导致中等成熟效率，其中gm-hbstart2(php80734；seqidno：113)、gm-ltp3(php80730；seqidno：112)、gm-mate1(php80736；seqidno：114)或gm-ned1(php81060；seqidno：115)启动子的中值水平分别为13％、33％、13％和15％。参见图1。在tag-rfp对照处理(php80728；seqidno：111)中，农杆菌感染后5-6周，体细胞胚很小且发育不充分，而gm-ltp3pro::wus(php80730；seqidno：112)和gm-hbstart3pro::wus(php81343；seqidno：116)处理的体细胞胚分别约2至5倍更大。参见图2a-2f。

实例5控制形态发生基因的表达的gm-hbstart3或gm-ltp3启动子改善转化

使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子来驱动包含荧光标记的表达盒中的拟南芥lec1、lec2、kn1、stm或lec1样(kwong等人，(2003)theplantcell[植物细胞]，vol.15，5-18)基因的表达，发现这增加了体细胞胚形成的频率和转基因t0植物的恢复。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。预计大约九天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在大约二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥。此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下，良好形成的成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发，在温室中产生健康的植物。预期这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到大约两至三个月。

实例6使用gm-hbstart3或gm-ltp3启动子控制农杆菌ipt基因表达刺激直接芽形成和改善转化

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的农杆菌ipt基因的表达)增加多芽形成的频率和转基因t0植物的恢复。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌并移至能促进多芽繁殖的培养基上。预期在九天后将组织移至有利于芽发育的培养基中，然后在二十二天后将转基因芽移至促进生根的培养基中。此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下，初生苗发出荧光。功能苗快速发育，并在温室中继续生长并产生健康的植物。预期这种直接形成转基因植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(用于常规大豆转化)减少到大约两至三个月。

实例7控制拟南芥monopteros-δ基因的表达的gm-hbstart3或gm-ltp3启动子刺激直接芽形成和改善转化

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的拟南芥monopteros-δ基因的表达)增加多芽形成的频率和转基因t0植物的恢复。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21中的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌并移至能促进多芽繁殖的培养基上。预期在九天后将组织移至有利于芽发育的培养基中，然后在二十二天后将转基因芽移至促进生根的培养基中。此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下，初生苗发出荧光。功能苗快速发育，并在温室中继续生长并产生健康的植物。预期这种直接形成转基因植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(用于常规大豆转化)减少到大约两至三个月。

实例8控制生长增强基因的表达的gm-hbstart3或gm-ltp3启动子改善转化

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的农杆菌av-6b基因、农杆菌iaa-h基因、农杆菌iaa-m基因、拟南芥serk或拟南芥agl15基因的表达)增加体细胞胚形成的频率和转基因t0植物的恢复。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。预计九天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥。此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下，良好形成的成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发，在温室中产生健康的植物。预期这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到大约两至三个月。

实例9结合使用病毒增强子元件与驱动wus表达的gm-hbstart3启动子导致大豆转化的进一步改善

相对于单独使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子，与gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的wus的表达)相邻地使用病毒增强子元件(例如35s增强子)导致体胚形成频率和体胚成熟频率进一步增加，导致转基因t0植物恢复方面的整体增加。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。九天后，将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥。此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下，良好形成的成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发，在温室中产生健康的植物。这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到大约两至三个月。

以类似方式测试其他增强子元件，并且显示出相对于单独使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)也导致增加的转化。这些增强子包括病毒增强子，例如花椰菜花叶病毒35s和紫茉莉花叶病毒2xmmv以及内源性植物增强子元件。

实例10拟南芥wus基因的直系同源基因在大豆中起功能刺激体细胞胚形成

比较了以下处理。对于粒子枪转化处理，全部都包含具有gm-ef1apro::gm-ef1a内含子1::zs-yellow::nosterm+gm-samspro::gm-sams内含子1::gm-als::gm-alsterm的质粒qc318(seqidno：117)。处理包括1)没有添加基因的对照，2)pver9662(seqidno：118)，其具有驱动拟南芥wus基因表达的at-ubipro，3)ubigmwus(seqidno：119)，其具有驱动大豆wus基因表达的at-ubipro，4)ubimtwus(seqidno：120)，其具有驱动蒺藜状苜蓿wus基因表达的at-ubipro，5)ubiljwus(seqidno：121)，其具有驱动日本莲(lotusjaponica)wus基因表达的at-ubipro，6)ubipvwus(seqidno：122)，其具有驱动菜豆wus基因表达的at-ubipro，以及7)ubipywus(seqidno：123)，其具有驱动矮牵牛wus基因表达的at-ubipro。

从种子中分离出未成熟子叶，预培养两周，然后用粒子枪转化，共同引入两种质粒的混合物，第一种包含由驱动每个wus直系同源物的cdna序列表达的at-ubipro组成的表达盒(pver9662(seqidno：118)、ubigmwus(seqidno：119)、ubimtwus(seqidno：120)、ubiljwus(seqidno：121)、ubipvwus(seqidno：122)和ubipywus(seqidno：123))加上zs-yellow的表达盒(qc318(seqidno：117))。将外植体培养两周。在两周时，对每个处理的荧光球状体细胞胚的数量进行计数并制成表格。

粒子枪转化后两周，在轰击的对照子叶上很少观察到荧光球状体细胞胚，而所有其他处理方法(含由at-ubi启动子驱动的不同双子叶物种的wus基因)则在轰击的子叶上观察到许多荧光体细胞胚。

实例11拟南芥wus基因的直系同源基因在芸苔属中起功能刺激体细胞胚形成

分离出芸苔属的各种外植体类型，包括不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织，以用拟南芥wus基因的直系同源基因进行转化。比较了以下处理。对于粒子枪转化处理，全部都包含具有gm-ef1apro::gm-ef1a内含子1::zs-yellow::nosterm+gm-samspro::gm-sams内含子1::gm-als::gm-alsterm的质粒qc318(seqidno：117)。处理包括1)没有添加基因的对照，2)pver9662(seqidno：118)，其具有驱动拟南芥wus基因表达的at-ubipro，3)ubigmwus(seqidno：119)，其具有驱动大豆wus基因表达的at-ubipro，4)ubimtwus(seqidno：120)，其具有驱动蒺藜状苜蓿wus基因表达的at-ubipro，5)ubiljwus(seqidno：121)，其具有驱动日本莲(lotusjaponica)wus基因表达的at-ubipro，6)ubipvwus(seqidno：122)，其具有驱动菜豆wus基因表达的at-ubipro，以及7)ubipywus(seqidno：123)，其具有驱动矮牵牛wus基因表达的at-ubipro。

分离出芸苔属的各种外植体类型，包括不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织，以用粒子枪转化，共同引入两种质粒的混合物，第一种包含由驱动每个wus直系同源物的cdna序列表达的at-ubipro组成的表达盒(pver9662(seqidno：118)、ubigmwus(seoidno：119)、ubimtwus(seqidno：120)、ubiljwus(seqidno：121)、ubipvwus(seqidno：122)和ubipywus(seqidno：123))加上zs-yellow的表达盒(qc318(seqidno：117))。将外植体培养两周。在两周时，对每个处理的荧光球状体细胞胚的数量进行计数并制成表格。

粒子枪转化后两周，在轰击的对照外植体类型(包括芸苔属不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上很少观察到荧光球状体细胞胚，而对于所有其他处理(包含来自at-ubi启动子驱动的不同双子叶植物物种的wus基因)，在轰击的外植体类型(包括芸苔属不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上观察到很多荧光球状体细胞胚。

实例12拟南芥wus基因的直系同源基因在向日葵中起功能刺激体细胞胚形成

分离出向日葵的各种外植体类型，包括不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织，以用拟南芥wus基因的直系同源基因进行转化。比较了以下处理。对于粒子枪转化处理，全部都包含具有gm-ef1apro::gm-ef1a内含子1::zs-yellow::nosterm+gm-samspro::gm-sams内含子1::gm-als::gm-alsterm的质粒qc318(seqidno：117)。处理包括1)没有添加基因的对照，2)pver9662(seqidno：118)，其具有驱动拟南芥wus基因表达的at-ubipro，3)ubigmwus(seqidno：119)，其具有驱动大豆wus基因表达的at-ubipro，4)ubimtwus(seqidno：120)，其具有驱动蒺藜状苜蓿wus基因表达的at-ubipro，5)ubiljwus(seqidno：121)，其具有驱动日本莲(lotusjaponica)wus基因表达的at-ubipro，6)ubipvwus(seqidno：122)，其具有驱动菜豆wus基因表达的at-ubipro，以及7)ubipywus(seqidno：123)，其具有驱动矮牵牛wus基因表达的at-ubipro。

分离出向日葵的各种外植体类型，包括不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织，以用粒子枪转化，共同引入两种质粒的混合物，第一种包含由驱动每个wus直系同源物的cdna序列表达的at-ubipro组成的表达盒(pver9662(seqidno：118)、ubigmwus(seqidno：119)、ubimtwus(seqidno：120)、ubiljwus(seqidno：121)、ubipvwus(seqidno：122)和ubipywus(seqidno：123))加上zs-yellow的表达盒(qc318(seqidno：117))。将外植体培养两周。在两周时，对每个处理的荧光球状体细胞胚的数量进行计数并制成表格。

粒子枪转化后两周，在轰击的对照外植体类型(包括向日葵不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上很少观察到荧光球状体细胞胚，而对于所有其他处理(包含来自at-ubi启动子驱动的不同双子叶植物物种的wus基因)，在轰击的外植体类型(包括向日葵不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上观察到很多荧光球状体细胞胚。

实例13拟南芥wus基因的直系同源基因刺激芸苔属的形态发生互长

通过评估在包含壮观霉素的培养基上进行选择的同时刺激芸苔属中转基因绿芽应答生长的能力，测试了来自12个不同双子叶植物物种、2个裸子植物和一个单子叶植物物种的wus基因的功效。对于所有含有wus表达盒的处理，除了在构建体中使用的wus基因外，t-dna的结构相同。所述t-dna结构为rb+camv35spro::wus::os-t28term+gm-ubqpro::gm-ubq5utr::gm-ubq内含子1::zs-yellow1n1::nosterm+at-ubiq10pro::at-ubiq105utr::at-ubiq10内含子1::ctp::spcn::ubq14term+lb，其中可变wus基因是粗斜体。

将甘蓝型油菜的种子在50％的clorox溶液中进行表面灭菌，并在含有ms基础盐和维生素的固体培养基上萌发。将幼苗在28℃的光照下生长10至14天，并将下胚轴从子叶上切下。将下胚轴外植体转移到含有10ml含200mm乙酰丁香酮的20a培养基(表3)的100x25mm皮氏培养皿中，然后切成3-5mm长的切片。切片后，将含有上述表达盒的40μl农杆菌溶液(在550nm处光密度为0.50的农杆菌菌株lba4404thy-)添加到平板中，并将含有下胚轴/农杆菌混合物的皮氏培养皿置于振动台上并轻轻搅拌10分钟。轻柔搅拌10分钟后，将平板移至昏暗的光线和21℃下共培养3天。

共培养后，从土壤杆菌溶液中除去下胚轴外植体，并轻轻印迹到无菌滤纸上，然后置于70a选择培养基(表3)(含10mg/l壮观霉素)上并移至光照室(26℃和强光)。在转移到第二轮70a选择之前，外植体在70a选择培养基上保持两周(可替代地，将外植体移到含有20mg/l壮观霉素的70b培养基(表3)中进行第二轮选择)。经过两轮选择后，将外植体转移到70c芽伸长培养基(表3)中2-3周，然后放回光照室。然后将芽转移到90a生根培养基(表3)上，然后转移到温室中的土壤。

表3.用于低芥酸油菜转化的培养基

如表4所示，来自不同物种的wus基因刺激了低芥酸油菜中转基因绿芽的生长应答。取决于wus基因的来源，这种对芽发育的刺激和恢复抗壮观霉素的芽的能力是可变的。对于黄瓜，这种转基因芽的刺激略高于阴性对照处理中看到的水平，但对于来自其他物种的wus基因而言有范围变化，对于显轴买麻藤(一种裸子植物)高达95％，对于来自葡萄、鳗草(一种单子叶植物)、高凉菜属、矮牵牛属、苹果、向日葵、木薯和买麻藤属的wus基因观察到的应答超过70％。

表4.来自各种物种的wus基因的功效＊

*来自各种物种的wus基因的功效，通过农杆菌感染后28天时从外植体产生绿色荧光芽的起始的下胚轴外植体的百分比(通过大观霉素选择)来衡量，其中起始的下胚轴外植体由具有如上所述的含有wus基因的t-dna的农杆菌转化。

实例14.使用hd-zipiv转录因子家族的启动子控制向日葵wus直系同源基因的表达刺激芸苔属的形态发生生长

通过评估在包含壮观霉素的培养基上进行选择的同时刺激芸苔属中转基因绿芽应答生长的能h，测试了驱动来自向日葵(helianthusannuus)的拟南芥wus基因直系同源基因表达的拟南芥启动子的功效。对于所有处理，使用的t-dna包含三种表达盒rb+hd-zipivpro::ha-wus::os-t28term+gm-ubqpro::gm-ubq5utr::gm-ubq内含子1::zs-yellow1n1::nosterm+at-ubiq10pro::at-ubiq105utr::at-ubiq10内含子1::ctp::spcn::ubq14term+lb，其中可变化的启动子hd-zipivpro是粗斜体。

测试的启动子来自拟南芥，并且包括原皮因子1(protodermalfactor1(pdf1)，seqidno：149)、原皮因子2(protodermalfactor2(pdf2)，seqidno：150)、无毛2(glabrous2(hdg2)，seqidno：151)、分生组织层1(meristemlayer1(ml1)，seqidno：125)、无蜡质6(eceriferum6(cer6)，seqidno：126)和无花色素(anthocyanless(anl1)，seqidno：152)。包含这些启动子的质粒的t-dna结构分别示为表1中的rv027343、rv027344、rv027340、rv027342、rv027338和rv027337，其分别对应于seqidno175、169、173、174、172和171。将这些启动子与作为阳性对照的camv35spro(有关t-dna信息，参见rv021090，seqidno：153)进行比较，将不含wus表达盒的t-dna作为阴性对照(有关t-dna信息，参见rv026532，seqidno：170)。

如实例13中所述进行芸苔属种子的表面灭菌，萌发以产生幼苗，制备下胚轴外植体，用农杆菌菌株lba4404thy-转化，组织培养和使用壮观霉素选择。

结果以0到10的标度表示，其中零(0)是没有超过阴性对照的应答，并且十(10)是与用camv35spro观察到的强烈的形态发生应答刺激相匹配。对于测试的各种启动子，使用pdf1pro观察到的应答是5，对于pdf2pro观察到的应答是2.3，对于hdg2pro观察到的应答是2.2，对于ml1观察到的应答是2，对于cer6pro观察到的应答是2，对于anl1pro观察到的应答是2。camv35s启动子是强组成型启动子，当驱动wus表达时可能是不希望的；虽然t-dna整合后立即的强初始表达是有益的(以快速刺激芽形成)，但是整个植物中的强表达会导致形态异常和不育。测试的hd-zipiv启动子在发育中的胚胎和分生组织的l1(表皮)层中表达，并且在整个植物中的另外部分不表达。因此，期望的结果是并且实现了t-dna递送后(其中随着植物的营养和生殖部分的发育，wus表达下调)芽形成的正向生长刺激。对于所有测试的hd-zipiv启动子都证明了这种芽形成的快速生长刺激。