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本申请要求2017年12月20日提交的美国序列号62/608,458的优先权权益，其内容通过援引并入本文。
本发明涉及新颖的稠合三环吡唑并-二氢-吡嗪基吡啶酮化合物，所述化合物是肝炎病毒复制的抑制剂，并且因此可用于治疗病毒(并特别是乙型肝炎病毒(hbv))感染。本发明提供了如本文所披露的新颖的稠合三环吡唑并-二氢-吡嗪基吡啶酮化合物，含有此类化合物的药物组合物，以及使用这些化合物和组合物来治疗和预防hbv感染的方法。
背景技术：
在全球范围内，超过4亿人被乙型肝炎病毒(hbv)慢性感染，并且仅在美国就有超过1200万人感染。在那些慢性感染的患者中，高达40％将最终因肝硬化或发展肝细胞癌(hcc)而出现肝衰竭并发症。hbv属于嗜肝dna病毒(hepadnaviridae)科，这是一类通过rna中间体的逆转录而复制的小嗜肝dna病毒。病毒颗粒中的3.2kbhbv基因组呈环状、部分双链dna构象(松弛环状dna或rcdna)。hbv基因组由四个重叠的开放阅读框(orf)组成，它们编码核心、聚合酶(pol)、包膜和x蛋白。rcdna具有转录惰性，并且必须在病毒rna可转录之前在感染细胞的细胞核内转化为共价闭合的环状dna(cccdna)。共价闭合的环状dna是hbv转录的唯一模板，并且因为hbvrna模板基因组逆转录，其持久性是持续感染所需的。
hbv的包膜包含表面抗原蛋白(hbsag)的混合物。hbsag外壳是三种重叠蛋白的混合物：所有三种重叠蛋白共享一个共同区，所述共同区对应于所述三种蛋白中最小的一种(shbsag)。所述混合物主要由shbsag组成，但也包括中等hbsag(mediumhbsag，其包含shbsag加另外的多肽区段)和大hbsag(largehbsag，其包含mhbsag加另一个附加的多肽区段)。除了形成感染性病毒体颗粒之外，s、m和lhbsag蛋白还组装成亚病毒颗粒，所述亚病毒颗粒已知为22-nm颗粒，不具感染性，但含有包裹感染性病毒颗粒的相同蛋白。实际上，这些亚病毒、非感染性颗粒已被用作疫苗，因为它们含有与感染性hbv病毒体相同的抗原表面蛋白，并因此引发识别感染因子的抗体。有趣的是，这些亚病毒颗粒的数量大大超过了感染性病毒体，并被认为能保护感染性病毒体免于受感染宿主的免疫系统的作用。从绝对数量上看，它们可充当诱饵，分散针对感染性病毒颗粒的免疫应答，但除此之外，据报道它们还抑制免疫细胞(单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞)的功能，并因此可能削弱对hbv的免疫应答。由于这些亚病毒颗粒保护感染性hbv免受宿主免疫系统的作用，因此降低亚病毒颗粒的水平已被认为是一种可行的治疗方法。参见例如，wo2015/113990。
慢性hbv的关键诊断症状之一是乙型肝炎表面抗原(hbsag)的高血清水平。近年来的临床数据表明，持续病毒学应答通常与治疗早期(早至第8周)过程中的治疗中hbsag下降相关，而持续暴露于hbsag和其他病毒抗原可能导致hbv特异性免疫耐受和t细胞衰竭。在治疗期间经历血清hbsag水平更大幅且更快速下降的慢性hb患者实现了显著更高的持续病毒学应答率(约40％)，如通过治疗后持续病毒控制所定义的。
hbv的现有治疗选择包括干扰素疗法和病毒dna聚合酶的核苷/核苷酸抑制剂，例如恩替卡韦和替诺福韦。这些集中于降低病毒血症水平和肝功能障碍的耐受，并且可能具有不利的副作用，并且还在长期治疗过程中就耐药性病毒变体进行选择。更重要的是，这些疗法既不能根除慢性乙型肝炎患者的肝内hbvcccdna池或限制hbsag从已存在的cccdna进行转录，也不影响合成的hbsag分泌到患者血液中以抵消宿主的先天性免疫应答。因此，这些hbv治疗在大多数情况下是终身疗法并且中断通常导致病毒学上的复发。
因此，仍然需要更有效的hbv治疗，包括降低hbsag血清水平和治疗慢性hbv感染(chbv)的疗法。本发明提供了降低血清hbsag水平的化合物，并且据信所述化合物通过抑制含hbsag的22nm亚病毒颗粒的分泌而起作用。这些化合物可用于治疗hbv感染并减少由hbv感染引起的严重肝障碍的发生率。相对于具有相似生物活性的化合物，它们还表现出改善的性能，例如在缓冲水溶液中的溶解度提高并且对某些不利影响的预测倾向降低。
技术实现要素：
本发明提供了新颖的化合物，所述新颖的化合物抑制来自乙型肝炎病毒感染的细胞的hbsag的分泌，从而减少患有慢性hbv感染的患者的病毒载量和病毒复制。因此，本发明的化合物适用于治疗患有hbv(包括慢性hbv(chbv))的患者。相对于本领域已知的类似化合物，本发明的一些化合物除了在抑制hbsag水平方面高度有效之外，还表现出改善的安全性，例如可指示潜在心脏毒性的钠离子通道的抑制降低，药物-药物相互作用降低，并且时间依赖性细胞色素(cyp)抑制的风险更低。因此，本发明的化合物适用于治疗患有hbv的患者。本发明还提供了含有新颖的化合物的药物组合物、以及使用所述化合物和组合物抑制乙型肝炎病毒复制和治疗与hbv有关或由hbv引起的疾病病症的方法。在下面的描述和实例中描述了本发明的其他目的。因此，本发明的化合物适用于治疗患有hbv(包括慢性hbv)的患者。
在一个方面，本发明提供了具有式(i)的化合物：
一种具有式(i)的化合物：
其立体异构体或其药学上可接受的盐；其中：
r1是-c1-c8-烷基；-(c0-c8-亚烷基)-(c1-c8-烷氧基)x、或-(c0-c8-亚烷基)-(c3-c8-环烷基)；其中的每一个任选地被一个或两个选自以下的基团取代：卤代、-or10、＝o、-cn、-nr102、-coor10、-conr102、和-(c0-c8-亚烷基)-芳基；
5-6元芳基或杂芳基基团；其中r1的所述5-6元芳基或杂芳基基团独立地被一个或多个选自由以下组成的组的基团取代：-h、-cn、-(c0-c8-亚烷基)-(-or10)x、和卤代；
或与r2合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基基团；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o；
x表示替代其所附接的基团上的氢的基团数目；
r2是h、c1-c8-烷基、卤代、-cn；或与r1合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10、-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o；
r3是h、羟基、卤代、或c1-c8-烷基
每个r4、r5、r6、r7或r8独立地是-h、-c1-c8-烷基、-c1-c8-卤代烷基、-cn、-c1-c8-烷氧基、-c3-c8环烷基、芳基、或含有多达三个选自n、o和s的杂原子作为环成员的5元或6元杂芳基；其中每个-c1-c8-烷基、-c3-c8环烷基、芳基或者5元或6元杂芳基任选地被多达三个选自以下的基团取代：-or10、-nr102、-卤代、-cn、和-so2r9；或者r5与r7合在一起或r6与r8合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基基团；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10、-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o：
w是-coor9、-c(o)nh-so2r10、-c(o)nh-so2nr102、-5-四唑基、或-1，2，4-噁二唑-3-基-5(4h)-酮；
r9是h或c1-c8烷基；所述c1-c8烷基任选地被一个或两个选自以下的基团取代：卤代、-or10、＝o、-cn、-nr102、-coor10、和-conr102；
r10在每次出现时独立地选自-h、-c1-c8烷基和芳基，每个-c1-c8烷基和芳基任选地被一个至三个选自以下的基团取代：卤代、-oh、-c1-c8烷氧基、＝o、-cn、-nh2、-nh(c1-c8烷基)、-n(c1-c8烷基)2、和-环丙基；并且两个r10基团直接附接至同一原子，所述同一原子可以是c或n，所述两个r10基团可以任选地合在一起形成3-6元环，所述3-6元环可任选地含有选自n、o和s的杂原子作为环成员，并且可以被多达两个选自以下的基团取代：-oh、＝o、-c1-c8烷基、和-c1-c8烷氧基；
或其药学上可接受的盐。
本发明还包括制备这些化合物、含有这些化合物的药物组合物的方法，使用这些化合物和组合物抑制乙型肝炎病毒复制、和治疗与hbv有关或由hbv引起的疾病病症的方法，包含这些化合物的药物组合，以及在药物制造中使用所述化合物的方法。在下面的描述和实例中描述了本发明的其他目的。
具体实施方式
出于解释本说明书的目的，将应用下面的定义，并且在适宜的情况下，以单数形式使用的术语还包括复数形式。
除非上下文中另有明确说明，否则本说明书中使用的术语具有以下含义：
如本文所用，术语“受试者”是指动物。在某些方面，所述动物是哺乳动物。受试者也是指例如灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施例中，所述受试者是人。如本文所用，“患者”是指人受试者。
如本文所用，术语“抑制(inhibition或inhibiting)”是指减少或抑制给定的病症、症状或障碍、或疾病，或在生物活性或过程的基线活性方面的显著降低。
如本文所用，在一个实施例中，术语任何疾病或障碍的“治疗(treating或treatment)”是指减轻疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)或在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发病或发展或进展。
如本文所用，术语“一个/种(a/an)”、“所述(the)”以及在本发明的上下文中使用的类似术语(特别是在权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数二者，本文中除非另外指示或与上下文明显相矛盾。
本文所述的所有方法均能够以任何合适顺序进行，除非本文中另有指示或者与上下文明显相矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。
“任选地取代”意指所涉及的基团可以在一个或多个位置被随后所列的任何一个基团或其任意组合取代。取代基的数量、位置和选择应理解为仅涵盖熟练化学家期望合理稳定的那些取代；因此，“氧代”将不会成为芳基或杂芳基环上的取代基，例如，并且单个碳原子不会具有三个羟基或氨基取代基。除非另有说明，任选的取代基通常是多达四个选自以下的基团：卤代、氧代、cn、氨基、羟基、-c1-3烷基、-or*、-nr*2、-sr*、-so2r*、-coor*、和-conr*2，其中每个r*独立地是h或c1-3烷基。
除非另有说明，如本文所用，“芳基”是指苯基或萘基基团。除非另有说明，否则芳基基团可任选地被多达四个选自以下的基团取代：卤代、cn、氨基、羟基、c1-3烷基、-or*、-nr*2、-sr*、-so2r*、-coor*、和-conr*2，其中每个r*独立地是h或c1-3烷基。
如本文所用，“卤代”或“卤素”可以是氟、氯、溴或碘。
如本文所用，“c1-6烷基”或“c1-c6烷基”表示具有1-6个碳原子的直链或支链烷基。如果指定不同的碳原子数，例如c4或c3，则相应地修改所述定义，例如“c1-4烷基”将表示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文所用，“c1-6亚烷基”或“c1-c6亚烷基”表示具有1-6个碳原子和用于连接两个其他基团的两个开放化合价的直链或支链烷基。如果指定不同的碳原子数，例如c4或c3，则相应地修改所述定义，例如“c1-4亚烷基”将表示亚甲基(-ch2-)、乙烯(-ch2ch2-)、直链或支链丙烯(-ch2ch2ch2-或-ch2-chme-ch2-)等。
如本文所用，“c1-6烷氧基”表示具有1-6个碳原子的直链或支链烷氧基(-o-烷基)。如果指定不同的碳原子数，例如c4或c3，则相应地修改所述定义，例如“c1-4烷氧基”将表示甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基。
如本文所用，“c1-4卤代烷基”或“c1-c4卤代烷基”表示具有1-4个碳原子(其中至少一个氢已被卤素替代)的直链或支链烷基。卤素取代基的数目可以从一个高至未取代的烷基基团上的氢原子数。如果指定不同的碳原子数，例如c6或c3，则相应地修改所述定义。因此，“c1-4卤代烷基”将表示至少一个氢被卤素(例如其中卤素是氟)取代的甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基：cf3cf2-、(cf3)2ch-、ch3-cf2-、cf3cf2-、cf3、cf2h-、cf3cf2ch(cf3)-或cf3cf2cf2cf2-。
如本文所用，“c3-8环烷基”是指3至8个碳原子的饱和单环烃环。此类基团的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。如果指定不同的碳原子数，例如c3-c6，则相应地修改所述定义。
“4至8元杂环基”、“5至6元杂环基”、“3至10元杂环基”、“3至14元杂环基”、“4至14元杂环基”和“5至14元杂环基”分别是指4至8元杂环、5至6元杂环、3至10元杂环、3至14元杂环、4至14元杂环、和5至14元杂环；除非另有说明，此类环含有1至7个、1至5个、或1至3个选自由以下组成的组的杂原子作为环成员：氮、氧和硫，且所述环可以是饱和的、或部分饱和的，但不是芳香族的。杂环基团可以在氮原子或碳原子上附接至另一个基团。术语“杂环基”包括单环基团、稠环基团和桥接基团。这种杂环基的实例包括但不限于吡咯烷、哌啶、哌嗪、吡咯烷酮、吗啉、四氢呋喃、四氢噻吩、四氢噻喃、四氢吡喃、1，4-二噁烷、1，4-氧硫杂环己烷、8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、3，8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷、3-氧杂-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛烷、2-氧杂-5-氮杂-双环[2.2.1]庚烷、2，5-二氮杂-双环[2.2.1]庚烷、氮杂环丁烷、亚乙二氧基、氧杂环丁烷、或噻唑。在某些实施例中，除非另有说明，杂环基团具有选自n、o和s的1-2个杂原子作为环成员、和4-7个环原子，且任选地被多达四个选自以下的基团取代：卤代、氧代、cn、氨基、羟基、c1-3烷基、-or*、-nr*2、-sr*、-so2r*、-coor*、和-conr*2，其中每个r*独立地是h或c1-3烷基。特别地，含有硫原子的杂环基团在硫上任选地被一个或两个氧代基团取代。
如本文所用，“4-6元环醚”是指包含一个氧原子作为环成员的4至6元环。实例包括氧杂环丁烷、四氢呋喃和四氢吡喃。
“杂芳基”是完全不饱和的(芳香族)环。术语“杂芳基”是指具有1至8个选自n、o或s的杂原子的5-14元单环-或双环-或三环-芳香族环系统。通常，杂芳基是5-10元环或环系统(例如，5-7元单环基团或8-10元双环基团)，通常5-6元环含有多达四个选自n、o和s的杂原子，尽管杂芳环通常在环中含有不超过一个二价o或s。典型的杂芳基基团包括呋喃；异噻唑；噻二唑；噁二唑；吲唑；吲哚；喹啉；2-或3-噻吩基；2-或3-呋喃基；2-或3-吡咯基；2-、4-、或5-咪唑基；3-、4-、或5-吡唑基；2-、4-、或5-噻唑基；3-、4-、或5-异噻唑基；2-、4-、或5-噁唑基；3-、4-、或5-异噁唑基；3-或5-(1，2，4-三唑基)；4-或5-(1，2，3-三唑基)；四唑基；三嗪；嘧啶；2-、3-、或4-吡啶基；3-或4-哒嗪基；3-、4-、或5-吡嗪基；2-吡嗪基；和2-、4-、或5-嘧啶基。杂芳基基团任选地被多达四个选自以下的基团取代：卤代、cn、氨基、羟基、c1-3烷基、-or*、-nr*2、-sr*、-so2r*、-coor*、和-conr*2，其中每个r*独立地是h或c1-3烷基。
术语“羟基(hydroxy或hydroxyl)”是指基团-oh。
本文描述了本发明的各种实施例。应认识到，每个实施例中指定的特征可以与其他指定特征组合以提供另外的实施例。
以下列举的实施例是本发明的代表：
1.一种具有式(i)的化合物：
其立体异构体或其药学上可接受的盐；其中：
r1是-c1-c8-烷基；-(c0-c8-亚烷基)-(c1-c8-烷氧基)x、或-(c0-c8-亚烷基)-(c3-c8-环烷基)；其中的每一个任选地被一个或两个选自以下的基团取代：卤代、-or10、＝o、-cn、-nr102、-coor10、-conr102、和-(c0-c8-亚烷基)-芳基；
5-6元芳基或杂芳基基团；其中r1的所述5-6元芳基或杂芳基基团独立地被一个或多个选自由以下组成的组的基团取代：-h、-cn、-(c0-c8-亚烷基)-(-or10)x、和卤代；
或与r2合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基基团；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10、-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o；
x表示替代其所附接的基团上的氢的基团数目；
r2是h、c1-c8-烷基、卤代、-cn；或与r1合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10、-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o；
r3是h、羟基、卤代、或c1-c8-烷基；
每个r4、r5、r6、r7或r8独立地是-h、-c1-c8-烷基、-c1-c8-卤代烷基、-cn、-c1-c8-烷氧基、-c3-c8环烷基、芳基、或含有多达三个选自n、o和s的杂原子作为环成员的5元或6元杂芳基；其中每个-c1-c8-烷基、-c3-c8环烷基、芳基或者5元或6元杂芳基任选地被多达三个选自以下的基团取代：-or10、-nr102、-卤代、-cn、和-so2r9；或者r5与r7合在一起或r6与r8合在一起形成含有n、o或s作为环成员的5-7元杂环或杂芳基基团；其中所述杂环或杂芳基环任选地被多达三个选自以下的基团取代：-r10、-or10、-nr102、-卤代、-cn、-coor10、-conr102、和＝o；
w是-coor9、-c(o)nh-so2r10、-c(o)nh-so2nr102、-5-四唑基、或-1，2，4-噁二唑-3-基-5(4h)-酮；
r9是h或c1-c8烷基；所述c1-c8烷基任选地被一个或两个选自以下的基团取代：卤代、-or10、＝o、-cn、-nr102、-coor10、和-conr102；
r10在每次出现时独立地选自-h、-c1-c8烷基和芳基，每个-c1-c8烷基和芳基任选地被一个至三个选自以下的基团取代：卤代、-oh、-c1-c8烷氧基、＝o、-cn、-nh2、-nh(c1-c8烷基)、-n(c1-c8烷基)2、和-环丙基；并且两个r10基团直接附接至同一原子，所述同一原子可以是c或n，所述两个r10基团可以任选地合在一起形成3-6元环，所述3-6元环可任选地含有选自n、o和s的杂原子作为环成员，并且可以被多达两个选自以下的基团取代：-oh、＝o、-c1-c8烷基、和-c1-c8烷氧基；
或其药学上可接受的盐。
2.如实施例1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中r1是-c1-c8-烷基。
3.如实施例1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中r1是-c1-c8-烷氧基；任选地被一个或多个-or10取代。
4.如实施例1所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中r1是5-6元芳基基团；其中r1的所述5-6元芳基基团独立地被一个或多个选自由以下组成的组的基团取代：-h或-or10。
5.如前述实施例中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐，其中r2是h或卤代。
6.如实施例1至5中任一项所述的化合物，其中w是-coor9；或其药学上可接受的盐。
7.如实施例1-6中任一项所述的化合物，其中r4是h；
或其药学上可接受的盐。
8.如实施例1-7中任一项所述的化合物，其中r5是h；
或其药学上可接受的盐。
9.如实施例1-8中任一项所述的化合物，其中r7是h；
或其药学上可接受的盐。
10.如实施例1-9中任一项所述的化合物，其中r8是h；
或其药学上可接受的盐。
11.如实施例1-10中任一项所述的化合物，其中r6是c1-c8烷基；
或其药学上可接受的盐。
12.如实施例1-11中任一项所述的化合物，其中r9是h；或其药学上可接受的盐。
13.如实施例1-12中任一项所述的化合物，其中r10是-c1-c8-烷基；或其药学上可接受的盐。
14.如实施例1-5中任一项所述的化合物，所述化合物具有以下式：
或其药学上可接受的盐。
15.如实施例14所述的化合物，其中r1是苯基；或其药学上可接受的盐。
16.如实施例14所述的化合物，其中r9是h；或其药学上可接受的盐。
17.如实施例1所述的化合物，所述化合物选自表1中实例的化合物。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含与至少一种药学上可接受的载体混合的如前述实施例中任一项所述的化合物。
19.一种治疗患有乙型肝炎感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如实施例1-17中任一项所述的化合物或如实施例18所述的药物组合物。
20.如实施例19所述的方法，其中如权利要求1-17中任一项所述的化合物或如实施例18所述的药物组合物与选自以下的另外的治疗剂组合使用：干扰素或聚乙二醇干扰素、hbv聚合酶抑制剂、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、衣壳组装抑制剂、hbv核心调节剂、逆转录酶抑制剂、tlr-激动剂、或免疫调节剂。
21.一种抑制乙型肝炎病毒复制的方法，所述方法包括使所述乙型肝炎病毒在体外或体内与如实施例1-17中任一项所述的化合物接触。
22.一种药物组合，所述药物组合包含如实施例1-17中任一项所述的化合物和至少一种另外的治疗剂。
23.如实施例1-17中任一项所述的化合物，用于在疗法中使用。
24.如实施例23所述的化合物，其中所述疗法是治疗细菌感染。
25.如实施例1-17中任一项所述的化合物在药物制造中的用途。
本发明的另一实施例提供了如上所述的化合物、或其药学上可接受的盐，用作药物。在一个方面，所述药物用于治疗患有hbv感染的受试者。在特定的实施例中，所述受试者是被诊断出患有慢性hbv的人。
具有式(i)的化合物、或其药学上可接受的盐用于制造药物的用途也在本发明的范围之内；在一些实施例中，此药物用于治疗或预防人类的病毒性疾病和/或感染，包括其中涉及的病毒是hbv。
包含具有式(i)的化合物、或其药学上可接受的盐、和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物包括在本发明的范围之内。任选地，所述组合物包含至少两种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
根据此实施例的另一方面，根据本发明的药物组合物进一步包含治疗有效量的至少一种其他抗病毒剂。在另一个实施例中，所述其他抗病毒剂是可用于治疗hbv的抗病毒剂。本文描述了合适的另外的治疗剂。
本发明还提供了如上所述的药物组合物在治疗患有或有感染风险的人类中hbv感染的用途。在一个实施例中，所述治疗的受试者已经诊断出患有慢性hbv感染。
本发明还提供了如上所述的药物组合物用于在患有疾病或有感染疾病风险的人类中治疗hbv感染的用途。
本发明的另一方面涉及通过向人类施用抗病毒有效量的本发明的化合物、其药学上可接受的盐，或包含上述化合物的组合物(单独或与至少一种其他抗病毒剂组合，一起或分开施用)来治疗或预防人类的乙型肝炎病毒疾病和/或感染的方法。
本发明的另外的方面涉及制品，所述制品包含可有效治疗乙型肝炎病毒疾病和/或感染的本发明的组合物；和包含标签的包装材料，所述标签表明所述组合物可用于治疗乙型肝炎病毒的疾病和/或感染；其中所述组合物包含根据本发明的具有式(i)的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的仍另一方面涉及抑制hbv复制的方法，所述方法包括在抑制病毒复制的条件下使病毒暴露于有效量的具有式(i)的化合物或其盐。此方法可以在体外或体内实践。
本发明范围内进一步包括的是具有式(i)的化合物或其盐在体外或体内抑制hbv复制、或减少感染hbv的受试者中存在的hbsag的量的用途。
在涉及具有式(i)的化合物的所有实施例中，具有式(i)的化合物可以是如上述实施例1-17中任一项所述的化合物。
在一些实施例中，所述具有式(i)的化合物与至少一种选自以下的另外的治疗剂共同施用或组合使用：干扰素或聚乙二醇干扰素、hbv聚合酶抑制剂、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、衣壳组装抑制剂、hbv核心调节剂、逆转录酶抑制剂、tlr-激动剂、或免疫调节剂。任选地，所述具有式(i)的化合物可以与另外的治疗剂组合制备用于同时或顺序使用；或者具有式(i)的化合物可以组合成包含具有式(i)的化合物和至少一种另外的治疗剂的药物组合。可与本发明的化合物组合使用的一些特定治疗剂包括本文所述的免疫调节剂、干扰素α2a、干扰素α-2b、聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、tlr-7和tlr-9激动剂、恩替卡韦、替诺福韦、西多福韦、替比夫定、地达诺新、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、阿立他滨、阿替韦拉平(atevirapine)、病毒唑、阿昔洛韦、法昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、阿德福韦、依法韦仑、奈韦拉平、地拉夫定、和依曲韦林。合适的核心调节剂披露于wo2013/096744中；合适的hbv衣壳抑制剂描述于us2015/0252057中。
这些另外的药剂可以与本发明的化合物组合以产生单一药物剂型。可替代地，可以例如使用试剂盒将这些另外的药剂作为多剂型的一部分分开施用于患者。可以在施用本发明的化合物或其药学上可接受的盐之前、同时或之后将此类另外的药剂施用于患者。可替代地，这些另外的治疗剂可以与本发明的化合物分开施用，且可以任选地通过不同的施用途径并以不同的给药方案施用，只要本发明的化合物和另外的治疗剂同时用于治疗hbv感染或由hbv感染引起或并发的障碍。
每天适用的本发明的化合物的剂量范围通常为0.01至100mg/kg体重，优选0.1至50mg/kg体重。在一些实施例中，每日总剂量在1和25mg之间，并且可以在不同时间以单剂量或分剂量施用，以维持合适的血浆浓度。每个剂量单位可方便地含有5％至95％的活性化合物(w/w)。优选地，此类制剂含有20％至80％的活性化合物，所述活性化合物可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合。
实际的药物有效量或治疗剂量当然将取决于本领域技术人员已知的因素，例如患者的年龄和体重、施用途径和疾病的严重程度。在任何情况下，将根据患者的独特病症以允许递送药学有效量的剂量和方式施用所述组合。
当本发明的组合物包含本发明的化合物和一种或多种另外的治疗剂或预防剂的组合时，当用作单一药剂治疗时，化合物和另外的药剂两者可以以比通常用于单个化合物的剂量更低的剂量使用。因此在一些实施例中，每种组分可以以单一疗法方案中正常施用剂量的约10％-100％之间、更优选约10％-80％之间的剂量水平存在。
预期本发明的化合物可以与其他治疗剂组合使用，就像治疗剂的组合目前用于治疗丙型肝炎病毒(hcv)感染一样。因此，本发明的化合物可以与不同的抗hbv治疗剂(例如核苷或免疫调节剂)组合使用。这些组合疗法提供了抑制hbv的互补机制，且因此将其组合使用应可增强疗效并减少耐药性发生的频率。
预期用于此类组合疗法的抗病毒剂包括可有效抑制人类病毒形成和/或复制的药剂(化合物或生物制剂)，包括但不限于干扰人类中病毒形成和/或复制所必需的宿主或病毒机制的药剂。此类药剂可以选自恩替卡韦、替诺福韦、西多福韦、替比夫定、地达诺新、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、恩曲他滨、阿立他滨、阿替韦拉平、病毒唑、阿昔洛韦、法昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、阿德福韦、依法韦仑、奈韦拉平、地拉夫定、和依曲韦林、和如本文所述的免疫调节剂(包括干扰素和聚乙二醇化干扰素、tlr-7激动剂、和tlr-9激动剂)。已知目前hbv治疗(包括免疫调节剂例如干扰素-α和聚乙二醇化干扰素-α；和口服核苷/核苷酸类似物(na)，包括拉米夫定、阿德福韦、替比夫定、恩替卡韦和替诺福韦)抑制但不能消除hbv。j.antimicrob.chemother.[抗微生物化学疗法杂志]2011，第66(12)卷，2715-25，且因此那些治疗剂可以与本发明的化合物组合使用。
本发明的许多化合物含有一个或多个手性中心。可以以单一异构体或异构体混合物制备并使用这些化合物。分离异构体(包括非对映异构体和对映异构体)的方法是本领域已知的，并且本文描述了合适方法的实例。在某些实施例中，本发明的化合物用作单一的基本上纯的异构体，意味着所述化合物的至少90％的样品是特定的异构体，而少于10％的样品是任何其他异构体或异构体的混合物。优选地，至少95％的样品是单一异构体。合适的异构体的选择在普通技术水平之内，因为一种异构体通常在本文所述的用于测量hbv活性的体内或体外测定中更具活性，并且将是优选的异构体。在异构体之间的体外活性差异相对较小(例如小于约4分之一)的地方，可以使用例如本文所述的那些方法，基于针对细胞培养物中的病毒复制的活性水平来选择优选的异构体：具有较低mic(最低抑制浓度)或ec-50的异构体是优选的。
本发明的化合物可以通过以下所示的通用合成路线合成，其具体实例在实例中更详细地描述。在公开的pct申请wo2015/113990和wo2015/173164中披露了用于合成具有式(i)的化合物和可用于这些合成的合成中间体的另外的指导。
方案1说明了可用于制备本发明的化合物的通用方法，如本文实例所示。多种吡唑-2-甲酸酯起始材料是本领域已知的。可以使用本领域已知的方法将羧酸酯还原成醇，并且可以用保护基团(例如，已知的甲硅烷基醚(例如tbs))保护所述醇。可以用合适的α-卤代酮将吲哚氮烷基化，以引入含r6的基团。还原胺化是在羰基中心引入氮的一种方法。一旦伯胺就位，可以将在吲哚/氮杂吲哚的c2处受保护的醇脱保护并氧化为醛氧化态，此时其与伯胺环合形成被r6取代的新的6元环。
然后通过本领域已知的方法使用(z)-乙基2-(乙氧基亚甲基)-3-氧代丁酸酯将新环的亚胺环化以形成另外的稠合环。然后将新环氧化以提供式(i)所示的吡啶酮环。在公开的pct申请wo2015/113990和wo2015/173164中披露了可用于制备这些化合物的方法。
方案1.合成具有式(i)的化合物的通用方法1。
在方案1中，可以通过手性hplc和类似的已知方法分离这些化合物的对映异构体。尽管该式的化合物的一种对映异构体通常比另一种对映异构体更具活性，但如本文所示两种异构体均表现出一种hbsag的活性。可替代地，可以使用对映异构体纯的氨基醇衍生物合成对映异构体纯的具有式(i)的化合物，如方案2所示。
方案2.合成具有式(i)的化合物的通用方法2。
使用这些通用方法、其他已知的起始材料和本文的实例，本领域技术人员可以合成具有式(i)的化合物。
术语“光学异构体”或“立体异构体”是指针对本发明的给定化合物可存在的多种立体异构构型中的任何一者且包括几何异构体。应了解取代基可以附接在碳原子的手性中心。术语“手性的”是指在其镜像配偶体上具有非重叠性特性的分子，而术语“非手性的”是指在其镜像配偶体上是可重叠的分子。因此，本发明包括所述化合物的对映异构体、非对映异构体或外消旋体。“对映异构体”是彼此为不能重叠镜像的一对立体异构体。对映异构体的1∶1混合物是“外消旋”混合物。所述术语用于在适当的情况下表示外消旋混合物。“非对映异构体”是具有至少两个非对称原子，而彼此非镜像的立体异构体。绝对立体化学是根据cahn-lngold-prelogr-s系统规定。当化合物是纯对映异构体时，每个手性碳处的立体化学可以通过r或s表示。未知绝对构型的拆分化合物可以取决于其使波长为钠d线的平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)来指定(+)或(-)。本文描述的某些化合物含有一或多个非对称中心或轴且可因此产生对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式，其就绝对立体化学而言可定义为(r)-或(s)-。
根据起始材料和程序的选择，所述化合物可以呈可能的异构体形式或作为其混合物(例如作为纯的光学异构体或作为异构体混合物，如外消旋体和非对映异构体混合物)存在，这取决于不对称碳原子的数目。本发明旨在包括所有这些可能的立体异构体，包括外消旋混合物、非对映异构体混合物和光学纯的形式。光学活性(r)-和(s)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术拆分。若化合物含有双键，则取代基可为e或z构型。如果所述化合物含有二取代的环烷基，则所述环烷基取代基可以具有顺式-或反式-构型。所有互变异构形式也旨在包括在内。
可以基于组分的物理化学差异，例如通过色谱法和/或分级结晶法将任何所得的异构体混合物分离成纯的或基本上纯的几何或旋光异构体或非对映异构体。
可以通过已知方法将任何所得的终产物或中间体的外消旋体拆分成旋光对映体，例如通过分离用光学活性酸或碱得到的其非对映异构体盐，并释放出光学活性的酸性或碱性化合物。特别地，因此可以采用碱性部分将本发明的化合物拆分成它们的旋光对映体，例如通过用光学活性酸形成的盐的分级结晶，例如酒石酸、联苯甲酰酒石酸、二乙酰酒石酸、二-o，o′-对甲苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸或樟脑-10-磺酸。外消旋产物也可以通过手性色谱法(例如，使用手性吸附剂的高压液相色谱法(hplc))拆分。
此外，本发明的化合物(包括它们的盐)还可以按其水合物形式获得，或包括用于其结晶的其他溶剂。本发明的化合物可以固有地或经设计与药学上可接受的溶剂(包括水)形成溶剂化物；因此，本发明包括溶剂化的形式和非溶剂化的形式两者。术语“溶剂化物”是指本发明的化合物(包括其药学上可接受的盐)与一种或多种溶剂分子的分子复合物。此类溶剂分子(例如，水，乙醇等)是制药领域常用的那些，已知它们对接受者是无害的。术语“水合物”是指其中溶剂分子为水的复合物。
本发明的化合物(包括其盐、水合物和溶剂化物)，可以固有地或通过设计形成多晶型物。
如本文所用，术语“盐(salt或salts)”是指本发明的化合物的酸加成盐或碱加成盐。“盐”特别地包括“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明的化合物的生物有效性和特性，并且通常不是生物学上或其他方面不合需要的盐。在许多情况下，由于氨基和/或羧基基团或与其类似的基团的存在，本发明的化合物能够形成酸盐和/或碱盐。
可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、胆茶碱(chlortheophyllonate)、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳糖酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。
可以衍生出盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。
可以衍生出盐的有机酸包括，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。可以用无机碱和有机碱形成药学上可接受的碱加成盐。
可以衍生出盐的无机碱包括，例如铵盐和来自元素周期表第i至xii列的金属。在某些实施例中，盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别合适的盐包括铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。
可以衍生出盐的有机碱包括，例如伯胺、仲胺和叔胺；经取代的胺(包括天然存在的经取代的胺)；环胺；碱性离子交换树脂等。某些有机胺包括异丙胺、苄星、胆碱盐、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规的化学方法从碱或酸部分合成。通常，此类盐可以通过将这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当碱(例如na、ca、mg或k的氢氧化物，碳酸盐，碳酸氢盐等)反应来制备，或通过将这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当酸反应来制备。这样的反应通常在水或有机溶剂或两者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，希望使用非水性介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。另外的合适的盐的列表可见于例如：“remington′spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]”，第20版，mackpublishingcompany[马克出版公司]，easton[伊斯顿]，pa.[宾夕法尼亚州]，(1985)中；以及stahl和wermuth的“handbookofpharmaceuticalsalts：properties，selection，anduse[药用盐手册：特性、选择和使用]”(wiley-vch[威利-vch出版社]，weinheim[韦因海姆]，德国，2002)中。
本文给出的任何式旨在表示具有多达三个具有非天然同位素分布的原子的本发明的化合物的未标记形式以及同位素标记形式，例如，富含氘或13c或15n的位点。同位素标记的化合物具有本文给出的式所描述的结构，除了一个或多个原子被具有选定的原子质量或质量数而不是自然丰度质量分布的原子替代。可以有效的掺入本发明的化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如，分别2h、3h、11c、13c、14c、15n、18f、31p、32p、35s、36cl、125i。本发明包括本发明的各种同位素标记的化合物，例如其中存在放射性同位素(例如3h和14c)的那些，或其中存在含量远高于正常同位素分布的非放射性同位素(例如2h和13c)的那些。此类同位素标记的化合物可用于代谢研究(例如，用14c)、反应动力学研究(例如用2h或3h)、检测或成像技术(例如正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)，包括药物或底物组织分布测定)，或用于患者的放射性治疗。特别地，18f标记的本发明的化合物对于pet或spect研究可能是特别理想的。同位素标记的本发明的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实例和制备中所述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替未标记的典型使用的试剂来制备。标记的样品在极低同位素掺入的情况下可能有用，例如使用放射性标记检测痕量化合物时。
此外，用较重的同位素，特别是氘(即，2h或d)更广泛或特定位置的取代可以提供来源于更大的代谢稳定性(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少或治疗指数改善)的某些治疗优点。应当理解，在此上下文中，氘被认为是本发明的化合物的取代基，并且典型地，具有氘作为取代基的化合物的样品在一个或多个标记的位置具有至少50％的氘掺入。这种较重的同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用，术语“同位素富集因子”意指同位素丰度与特定同位素的天然丰度之间的比率。如果本发明的化合物中的取代指示氘，这样的化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)。
根据本发明的药学上可接受的溶剂化物包括其中结晶溶剂可以被同位素取代的那些，例如，d2o、d6-丙酮、d6-dmso。
含有能够充当氢键的供体和/或受体的基团的本发明的化合物可与适合的共晶形成体形成共晶体。这些共晶体可通过已知的共晶形成程序由本发明的化合物制备。此类程序包括在溶液中使本发明的化合物与共晶形成体在结晶条件下研磨、加热、共升华、共熔或接触并分离借此形成的共晶体。适合的共晶形成物包括在wo2004/078163中描述的那些。因此，本发明进一步提供包含本发明的化合物的共晶体。
使用方法
本文所述的所有方法均能够以任何合适顺序进行，除非本文中另有指示或者与上下文明显相矛盾。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。
本发明的化合物可以通过已知方法(包括口服、肠胃外、吸入等)施用。在某些实施例中，本发明的化合物以丸剂、锭剂(lozenge)、糖锭(troche)、胶囊、溶液或悬浮液口服施用。在其他实施例中，将本发明的化合物通过注射或输注施用。输注通常通过静脉内进行，通常经约15分钟和4小时之间的时间段。在其他实施例中，本发明的化合物通过鼻内或吸入施用；吸入方法对治疗呼吸道感染特别有用。本发明的化合物表现出口服生物利用度，所以有时优选口服施用。
在本发明的某些实施例中，本发明的化合物与第二种治疗剂组合使用，所述第二种治疗剂可以是抗病毒剂，例如本文命名的那些。
术语“组合”意指以一种剂量单位形式的固定组合(作为适合于同时或顺序一起使用的分开的剂型)，或作为用于组合施用的试剂盒的部分，其中本发明的化合物和组合配偶体可以同时或在一定时间间隔内分开施用，尤其是允许组合配偶体表现出协作(例如协同)作用或其任何组合。
第二抗病毒剂可以与本发明的化合物组合施用，其中第二抗病毒剂在本发明的一种或多种化合物之前、同时或之后施用。当期望将本发明的化合物与第二药剂同时施用并且施用途径相同时，则可以将本发明的化合物与第二药剂配制成相同剂型。含有本发明的化合物和第二药剂的剂型的实例是片剂或胶囊。
在一些实施例中，本发明的化合物和第二抗病毒剂的组合可以提供协同活性。本发明的化合物和第二抗病毒剂可以一起、分开但同时或顺序施用。
化合物的“有效量”是治疗或预防本文所述的病毒感染和/或疾病或病症所必需或足够的量。在实例中，具有式i的化合物的有效量是足以治疗受试者的病毒感染的量。在另一个实例中，有效量是足以在需要这种治疗的受试者中治疗hbv的量。有效量可以取决于如受试者的大小和体重、疾病的类型、或本发明的特定化合物之类的因素而变化。例如，本发明的化合物的选择会影响“有效量”的构成。本领域普通技术人员将能够研究本文中所包含的因素，并且无需过多实验即可确定本发明的化合物的有效量。
施用方案可影响有效量的构成。本发明的化合物可以在病毒感染发作之前或之后施用给受试者。此外，可以每天或连续地施用几个分开的剂量以及间隔的剂量，或者可连续地输注所述剂量，或者可以是推注。此外，本发明的一种或多种化合物的剂量可以根据治疗或预防的情形的紧急程度成比例地增加或降低。
本发明的化合物可以用于治疗如本文所述的状态、障碍或疾病，或者用于制造用于治疗这些疾病的药物组合物。本发明提供了在治疗这些疾病中使用本发明的化合物的方法、或制备具有本发明的化合物的药物组合物用于治疗这些疾病的方法。
语言“药物组合物”包括适用于对哺乳动物(例如人)施用的制剂。当将本发明的化合物作为药物向哺乳动物(例如人)施用时，它们可以本身或作为药物组合物给予，所述药物组合物含有例如与药学上可接受的载体、或者任选地两种或更多种药学上可接受的载体组合的0.1％至99.5％(更优选0.5％至90％)的至少一种具有式(i)的化合物或其任何亚类作为活性成分。
短语“药学上可接受的载体”是本领域公认的，并且包括适用于向哺乳动物施用本发明的化合物的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。载体包括液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，所述载体涉及将受试药剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的一部分。在与配制品的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物配制品中使用的其他无毒相容物质。通常，药学上可接受的载体是无菌的和/或基本上无热原的。
在组合物中还可以存在润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
本发明的配制品包括适合于口服、鼻、吸入、局部、经皮、口腔、舌下、直肠、阴道和/或肠胃外施用的那些。配制品可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之百的范围内，量的范围为从约1％至约99％的活性成分，优选从约5％至约70％，最优选从约10％至约30％。
制备这些配制品或组合物的方法包括将本发明的化合物与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。一般而言，通过将本发明的化合物与液体载体或细碎固体载体或两者均匀且紧密地结合，并且然后如果需要，使产物成形来制备配制品。
适用于口服施用的本发明的配制品可以呈胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味基质，例如通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂的形式，或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)，和/或作为漱口水等，每一形式含有预定量的本发明的化合物作为活性成分。本发明的化合物还能以大丸剂、药糖剂或糊剂形式施用。
在本发明用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、颗粒剂等)中，将活性成分与以下混合：一种或多种药学上可接受的载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下任何一种：填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；粘合剂，例如像羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如甘油；崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；溶液阻滞剂，如石蜡；吸收促进剂，例如季铵化合物；润湿剂，例如像鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；吸收剂，如高岭土和膨润土；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；和着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。还可以使用诸如乳糖(lactose或milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂，将相似类型的固体组合物用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂。
片剂可以通过压缩或模制(任选地与一种或多种辅助成分一起)来制备。可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备压缩片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。
片剂和本发明的药物组合物的其他固体剂型(如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)可任选地进行刻痕或制备有包衣和外壳，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其他包衣。也可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素将它们配制成使其中的活性成分缓慢或受控释放以提供所需的释放曲线、其他聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以例如通过细菌截留过滤器滤过，或通过并入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，这些无菌固体组合物可以在使用前立即溶解于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。这些组合物也可以任选地包含遮光剂并且可以是如下组合物，所述组合物在胃肠道的某一部分中，任选地以一种延迟的方式仅或者优先释放一种或多种活性成分。可利用的嵌入式组合物的实例包括聚合物质以及蜡。活性成分还可以是微囊化形式，如果适当的话，可包含一种或多种上述赋形剂。
用于口服施用本发明的化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂(例如像水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括辅助剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。
除了含有活性化合物外，悬浮液还可以含有悬浮剂如，例如乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂-琼脂和黄芪胶，及其混合物。
用于直肠或阴道施用的本发明药物组合物的配制品可以作为栓剂呈现，所述栓剂可以通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，并且在室温下为固体，但是在体温下是液体，并且因此，将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。
适用于阴道施用的本发明配制品还包括含有本领域已知是适当的此类载体的阴道栓、卫生棉条、霜剂、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾配制品。
用于本发明的化合物的局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可以将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体、以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂进行混合。
除本发明活性化合物外，软膏、糊剂、霜剂和凝胶还可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌、或它们的混合物。
除本发明的化合物之外，粉剂和喷雾剂还可含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉剂，或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性未经取代的烃，例如丁烷和丙烷。
经皮贴剂具有向身体提供受控递送本发明的化合物的额外优点。此类剂型可以通过将化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物经皮肤的通量。可以通过提供一种控速膜或将活性化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制流通的速率。
眼用配制品、眼用软膏、粉剂、溶液等也被考虑在本发明的范围内。
适合肠胃外施用的本发明药物组合物可以包含与一种或多种药学上可接受的载体例如以下试剂组合的一种或多种本发明的化合物：无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂或无菌粉剂，所述无菌粉剂可以在使用之前即刻于无菌注射溶液或分散体中重构，所述无菌可注射溶液或分散体可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、乙二醇醚、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)和可注射的有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可以例如通过以下方式来维持：通过使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。
这些组合物也可以含有辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、山梨酸苯酚等)确保阻止微生物起作用。还令人希望的是在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可以通过包括延迟吸收的药剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
在某些情况下，为了延长药物的作用，希望的是通过皮下或肌肉内注射减慢药物的吸收。这可通过使用水溶性低的晶体或非晶体材料的液体悬浮液实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体尺寸以及晶型。可替代地，通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中可以延迟经肠胃外施用的药物形式的吸收。
通过在生物可降解的聚合物(如聚乳酸交酯-聚乙交酯)中形成主题化合物的微胶囊基质来制得可注射的贮库形式。根据药物与聚合物的比率、以及所采用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过使药物裹入与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射贮库配制品。
本发明的制剂可以经口、经肠胃外、局部或直肠施用。它们当然以适合于每种施用途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊形式，通过注射、吸入、眼用洗剂、软膏、栓剂等施用，通过注射、输注或吸入施用；通过洗剂或软膏局部施用；和通过栓剂直肠施用。
如本文所用，短语“肠胃外施用”和“经肠胃外施用”意指除了肠道和局部施用以外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、以及胸骨内注射和输注。静脉输注有时是本发明的化合物的优选递送方法。输注可用于递送单个日剂量或多剂量。在一些实施例中，本发明的化合物通过经15分钟至4小时之间，通常0.5至3小时之间的间隔中经过输注来施用。这种输注可以每天使用一次、每天两次或每天多达三次。
如本文所用，短语“全身施用”、“经全身施用”、“外周施用”和“经外周施用”是指不同于将化合物、药物或其他材料直接向中枢神经系统施用，而是使其进入患者系统，并且从而进行代谢和其他类似过程，例如皮下给药。
可以通过任何合适的施用途径将这些化合物向人类和其他动物施用以用于治疗，这些途径包括经口、经鼻(如通过，例如，喷雾)、直肠、阴道内、肠胃外、脑池内和局部(如通过粉剂、软膏或滴剂)施用，包括经颊和舌下施用。
无论选择何种施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的化合物(其能以合适的水合形式使用)和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和施用方式的所期望的治疗应答，而对患者没有毒性。
所选剂量水平取决于多种因素，包括所用的本发明特定化合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；正在使用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史；以及医学领域中已知的类似因素。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医能以低于实现所期望的治疗效果所需的水平开始给药于药物组合物中使用的本发明的化合物，并逐渐增加剂量直至达到所期望的效果。
一般而言，本发明的化合物的合适日剂量将是所述化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。通常，当用于所示的作用时，本发明的化合物对患者的静脉内和皮下剂量范围为每天每千克体重从约0.0001至约100mg，更优选地每天每千克体重从约0.01至约50mg，并且仍更优选地每天每千克体重从约0.1至约20mg。有效量是预防或治疗病毒感染(例如hbv)的量。
用本文所述的化合物或组合物治疗可以每天重复持续足以减少或基本上消除hbv感染或病毒载量的时间段。例如，治疗可以持续一周、或两周、或3-4周、或4-8周、或8-12周、2-6个月、或更长，例如，直到病毒载量或感染的其他测量显示出病毒载量或病毒活性或hbv感染的其他体征或症状大幅下降。熟练的治疗医师可以容易地确定合适的治疗持续时间。
如果需要的话，活性化合物的有效日剂量可以在全天以适当的间隔作为单一剂量每天，或作为二、三、四、五、六个或更多个亚剂量分开施用，任选地，以单位剂型施用。口服或通过吸入递送的化合物通常每天施用一到四剂。通过注射递送的化合物通常每天一次或每隔一天一次施用。通过输注递送的化合物通常每天施用一到三剂。当一天内多次给药时，可以以约4小时、约6小时、约8小时或约12小时的间隔来施用。
尽管可以单独施用本发明的化合物，优选的是，将所述化合物作为药物组合物例如本文披露的那些施用。因此，使用本发明的化合物的方法包括将所述化合物作为药物组合物施用，其中在施用前将至少一种本发明的化合物与药学上可接受的载体混合。
与免疫调节剂组合的本发明的化合物的用途
本文所述的化合物和组合物可以与一种或多种充当免疫调节剂的治疗剂组合使用或施用，所述治疗剂例如是共刺激分子的活化剂、或免疫抑制分子的抑制剂、或疫苗。程序性死亡1(pd-1)蛋白是扩展的cd28/ctla4家族t细胞调节物的抑制成员(okazaki等人，(2002)curr.opin.immunol.[免疫学当前观点]14：391779-82；bennett等人，(2003)j.immunol.[免疫学杂志]170：711-8)。pd-1在活化的b细胞、t细胞和单核细胞上表达。pd-1是负调节tcr信号的免疫抑制蛋白(ishida，y.等人(1992)emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]11：3887-3895；blank，c.等人(2006年12月29日在线发表)immunol.immunother.[免疫学和免疫治疗]56(5)：739-745)，并在慢性感染中上调。pd-1和pd-l1之间的相互作用可以充当免疫检查点，所述相互作用可以导致例如浸润性淋巴细胞的减少、t细胞受体介导的增殖的减少和/或癌性细胞或感染的细胞的免疫逃避(dong等人，(2003)j.mol.med.[分子医学杂志]81：281-7；blank等人(2005)cancerimmunol.immunother.[癌症免疫学免疫疗法]54：307-314；konishi等人(2004)clin.cancerres.[临床癌症研究]10：5094-100)。通过抑制pd-1与pd-l1或pd-l2的局部相互作用可以逆转免疫抑制；当pd-1与pd-l2的相互作用被阻断时，效果也是累加的(iwai等人(2002)proc.nat′l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]99：12293-7；brown等人(2003)j.immunol[免疫学杂志].170：1257-66)。可以通过与免疫抑制蛋白(例如pd-1)或调节抑制蛋白的结合蛋白(例如pd-l1、pd-l2)结合来实现免疫调节。
在一个实施例中，本发明的组合疗法包括免疫调节剂，所述免疫调节剂是免疫检查点分子的抑制分子的抑制剂或拮抗剂。在另一个实施例中，免疫调节剂与天然抑制免疫抑制检查点分子的蛋白质结合。当与抗病毒化合物组合使用时，这些免疫调节剂可以增强抗病毒应答，因此相对于单独使用抗病毒化合物进行治疗而言，可以提高疗效。
术语“免疫检查点”是指cd4和cd8t细胞的细胞表面上的一组分子。这些分子可以有效地用作“制动器”以下调或抑制适应性免疫应答。免疫检查点分子包括但不限于程序性死亡1(pd-1)、细胞毒性t淋巴细胞抗原4(ctla-4)、b7h1、b7h4、ox-40、cd137、cd40和lag3，它们直接抑制免疫细胞。可以充当本发明方法中的免疫检查点抑制剂的免疫治疗剂包括但不限于pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和/或tgfrβ。抑制分子的抑制可以通过dna、rna或蛋白质水平下的抑制来进行。在一些实施例中，抑制核酸(例如，dsrna、sirna或shrna)可以用于对抑制分子的表达进行抑制。在其他实施例中，抑制信号的抑制剂是多肽，例如，可溶性配体或与抑制分子结合的抗体或其抗原结合片段。
“与……组合”并不旨在暗示必需同时施用疗法或治疗剂和/或配制其用于一起递送，尽管这些递送方法也在本文所述的范围内。免疫调节剂可以与一种或多种本发明的化合物和任选地一种或多种另外的疗法或治疗剂同时、在其之前或之后施用。可以按任何顺序施用组合中的治疗剂。一般而言，每种药剂将以针对该药剂所确定的剂量和/或时间表施用。还应理解，该组合中使用的治疗剂可以按单一组合物一起施用或按不同组合物分开施用。一般而言，预期组合中使用的每种治疗剂以不超过它们单独使用时的水平使用。在一些实施例中，组合中使用的水平将低于单独使用的水平。
在某些实施例中，本文所述的抗病毒化合物与作为pd-1、pd-l1和/或pd-l2的抑制剂的一种或多种免疫调节剂组合施用。每种这种抑制剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白、或寡肽。此类免疫调节剂的实例是本领域已知的。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是选自mdx-1106、merck3475或ct-011的抗pd-1抗体。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是免疫粘附素(例如包含融合到恒定区(例如免疫球蛋白序列的fc区)的pd-l1或pd-l2的细胞外或pd-1结合部分的免疫粘附素。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是pd-1抑制剂，例如amp-224。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是pd-l1抑制剂，例如抗pd-l1抗体。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是选自yw243.55.s70、mpdl3280a、medi-4736、msb-0010718c、或mdx-1105的抗pd-l1结合拮抗剂。mdx-1105(也称为bms-936559)是描述于wo2007/005874中的抗pd-l1抗体。抗体yw243.55.s70是描述于wo2010/077634中的抗pd-ll。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是纳武单抗(cas登记号：946414-94-4)。纳武单抗的可替代名称包括mdx-1106、mdx-1106-04、ono-4538或bms-936558。纳武单抗是特异性阻断pd-1的完全人igg4单克隆抗体。纳武单抗(克隆5c4)和特异性结合pd-1的其他人单克隆抗体在us8,008,449、ep2161336和wo2006/121168中披露。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是抗pd-1抗体派姆单抗(pembrolizumab)。派姆单抗(也称为兰布罗利珠单抗(lambrolizumab)、mk-3475、mk03475、sch-900475或
在一些实施例中，所述免疫调节剂是匹地利珠单抗(ct-011；治疗科技公司(curetech))，与pd1结合的人源化igg1k单克隆抗体。匹地利珠单抗和其他人源化抗pd-1单克隆抗体披露于wo2009/101611中。
可用作本文披露的方法中的免疫调节剂的其他抗pd1抗体包括amp514(艾普利穆恩公司(amplimmune))，和us8,609,089、us2010028330和/或us20120114649中披露的抗pd1抗体。在一些实施例中，所述抗pd-l1抗体是msb0010718c。msb0010718c(也称为a09-246-2；默克雪兰诺公司(merckserono))是与pd-l1结合的单克隆抗体。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是mdpl3280a(基因泰克公司(genentech)/罗氏公司(roche))，与pd-l1结合的人fc优化的igg1单克隆抗体。mdpl3280a和针对pd-l1的其他人单克隆抗体披露于美国专利号：7,943,743和美国公开号：20120039906中。可用作本发明方法的免疫调节剂的其他抗pd-l1结合剂包括yw243.55.s70(参见wo2010/077634)、mdx-1105(也称为bms-936559)和在wo2007/005874中披露的抗pd-l1结合剂。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是amp-224(b7-dcig；艾普利穆恩公司；例如，在wo2010/027827和wo2011/066342中披露的)是阻断pd1与b7-h1之间的相互作用的pd-l2fc融合可溶性受体。
在一些实施例中，所述免疫调节剂是抗lag-3抗体例如bms-986016。bms-986016(也称为bms986016)是与lag-3结合的单克隆抗体。bms-986016和其他人源化抗lag-3抗体披露于us2011/0150892、wo2010/019570和wo2014/008218中。
在某些实施例中，本文披露的组合疗法包括共刺激分子或抑制分子(例如共抑制配体或受体)的调节剂。
在一个实施例中，共刺激分子的共刺激调节剂(例如激动剂)选自ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体的激动剂(例如，激动性抗体或其抗原结合片段、或可溶性融合物)。
在另一个实施例中，本文披露的组合疗法包括免疫调节剂，其为共刺激分子，例如与包括cd28、cd27、icos和/或gitr的共刺激域的阳性信号相关的激动剂。
示例性gitr激动剂包括例如gitr融合蛋白和抗gitr抗体(例如，二价抗gitr抗体)，例如描述于以下中的gitr融合蛋白，美国专利号：6,111,090、欧洲专利号：090505b1、美国专利号：8,586,023、pct公开号：wo2010/003118和2011/090754，或描述于以下中的抗gitr抗体，例如在美国专利号：7,025,962、欧洲专利号：1947183b1、美国专利号：7,812,135、美国专利号：8,388,967、美国专利号：8,591,886、欧洲专利号：ep1866339、pct公开号：wo2011/028683、pct公开号：wo2013/039954、pct公开号：wo2005/007190、pct公开号：wo2007/133822、pct公开号：wo2005/055808、pct公开号：wo99/40196、pct公开号：wo2001/03720、pct公开号：wo99/20758、pct公开号：wo2006/083289、pct公开号：wo2005/115451、美国专利号：7,618,632、和pct公开号：wo2011/051726中。
在一个实施例中，所使用的免疫调节剂是可溶性配体(例如，ctla-4-ig)，或与pd-l1、pd-l2或ctla4结合的抗体或抗体片段。例如，抗pd-1抗体分子可以与例如抗ctla-4抗体(例如艾匹利木单抗(ipilimumab))组合施用。示例性抗ctla4抗体包括曲美利木单抗(tremelimumab)(igg2单克隆抗体，可从辉瑞公司(pfizer)获得，以前称为替西木单抗(ticilimumab)，cp-675,206)、和艾匹利木单抗(ctla-4抗体，也称为mdx-010，cas号477202-00-9)。
在一个实施例中，在用如本文所述的本发明的化合物治疗后，施用抗pd-1抗体分子。
在另一个实施例中，抗pd-1或pd-l1抗体分子与抗lag-3抗体或其抗原结合片段组合施用。在另一个实施例中，所述抗pd-1或pd-l1抗体分子与抗tim-3抗体或其抗原结合片段组合施用。在又其他实施例中，所述抗pd-1或pd-l1抗体分子与抗lag-3抗体和抗tim-3抗体、或其抗原结合片段组合施用。本文列举的抗体的组合可以分开地(例如作为单独的抗体)、或连接的(例如作为双特异性或三特异性抗体分子)施用。在一个实施例中，施用包括抗pd-1或pd-l1抗体分子和抗tim-3或抗lag-3抗体的双特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本文列举的抗体的组合用于治疗癌症，例如本文所述的癌症(例如实体瘤)。可以在本领域已知的动物模型中测试上述组合的功效。例如，在例如woo等人(2012)cancerres.[癌症研究]72(4)：917-27中描述了测试抗pd-1和抗lag-3协同作用的动物模型。
可以用于组合疗法的示例性免疫调节剂包括但不限于例如，阿托珠单抗(可购自
可以与本发明的抗病毒化合物组合使用的此类免疫调节剂的示例性剂量包括约1至10mg/kg，例如3mg/kg的抗pd-1抗体分子的剂量，以及约3mg/kg的抗ctla-4抗体，例如艾匹利木单抗。
将本发明的抗病毒化合物与免疫调节剂组合使用的方法的实施例的实例包括这些，它们可以与本文披露的具有式i的化合物或其任何亚属或物种一起使用：
i.一种在受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所述的具有式(i)的化合物和免疫调节剂。
ii.如实施例i所述的方法，其中所述免疫调节剂是共刺激分子的活化剂或免疫检查点分子的抑制剂。
iii.如实施例i和ii所述的方法，其中所述共刺激分子的活化剂是以下一种或多种的激动剂：ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3和cd83配体。
iv.如以上实施例i-iii中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子的抑制剂选自pd-1、pd-l1、pd-l2、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。
v.如实施例i-iii中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子的抑制剂选自pd-1、pd-l1、lag-3、tim-3或ctla4的抑制剂，或其任何组合。
vi.如实施例i-v中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点分子的抑制剂是与免疫检查点分子结合的可溶性配体或抗体或其抗原结合片段。
vii.如实施例i-vi中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段来自igg1或igg4(例如，人igg1或igg4)。
viii.如实施例i-vii中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段是改变的，例如，突变，以增加或减少以下中的一种或多种：fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。
ix.如实施例i-viii中任一项所述的方法，其中所述抗体分子是具有对pd-1或pd-l1的第一结合特异性和对tim-3、lag-3或pd-l2的第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体分子。
x.如实施例i-ix中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂是选自纳武单抗、派姆单抗或匹地利珠单抗的抗pd-1抗体。
xi.如实施例i-x中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂是选自yw243.55.s70、mpdl3280a、medi-4736、msb-0010718c、或mdx-1105的抗pd-l1抗体。
xii.如实施例i-x中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂是抗lag-3抗体分子。
xiii.如实施例xii所述的方法，其中所述抗lag-3抗体分子是bms-986016。
xiv.如实施例i-x中任一项所述的方法，其中所述免疫调节剂是抗pd-1抗体分子，通过注射(例如皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg、或约3mg/kg的剂量施用，例如每周一次至每2、3、或4周一次。
xv.如实施例xiv所述的方法，其中所述抗pd-1抗体分子以从约10至20mg/kg的剂量每隔一周施用。
xvi.如实施例xv所述的方法，其中所述抗pd-1抗体分子，例如纳武单抗以约1mg/kg至3mg/kg，例如约1mg/kg、2mg/kg或3mg/kg的剂量每两周静脉内施用。
xvii.如实施例xv所述的方法，其中所述抗pd-1抗体分子，例如纳武单抗以约2mg/kg的剂量以3周的间隔静脉内施用。
如本文所述的化合物可以通过以下的通用合成路线合成，其具体实例在实例中更详细地描述。
通用合成程序
用于合成本发明的化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产(houben-weyl第4版1952，methodsoforganicsynthesis[有机合成方法]，thieme[蒂梅出版社]，第21卷)。通过以下实例、方案1中的通用方法，以及通过公开的pct申请wo2015/113990和wo2015/173164中披露的方法，说明了合成本发明的化合物的通用方法。
缩写列表
ac乙酰基
acn乙腈
acoet/etoac乙酸乙酯
acoh乙酸
aq水性
bn苄基
bu丁基(nbu＝正丁基，tbu＝叔丁基)
cdi羰基二咪唑
dbu1，8-二氮杂双环[5.4.0]-十一-7-烯
boc2o二碳酸二叔丁酯
dce1，2-二氯乙烷
dcm二氯甲烷
diad偶氮二甲酸二异丙酯
dibal-h二异丁基氢化铝
dipean-乙基二异丙胺
dman，n-二甲基乙酰胺
dmap二甲基氨基吡啶
dmfn，n’-二甲基甲酰胺
dmso二甲亚砜
edci1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
ei电喷雾电离
et2o二乙醚
et3n三乙胺
ether二乙醚
etoac乙酸乙酯
etoh乙醇
fa甲酸
fc快速色谱法
h小时
hcl盐酸
hobt1-羟基苯并三唑
hplc高效液相色谱法
h2o水
ipa异丙醇
l升
lc-ms液相色谱质谱
lihmds双(三甲基甲硅烷基)酰胺锂
me甲基
mei碘甲烷
meoh甲醇
mg毫克
min分钟
ml毫升
ms质谱
pd/c钯炭
pg保护基团
ph苯基
ph3p三苯基膦
prep制备型
rf比移值(ratiooffronts)
rp反相
rt保留时间
rt室温
sfc超临界流体色谱法
sio2硅胶
tbaf四丁基氟化铵
tbdms叔丁基二甲基甲硅烷基
tea三乙胺
tfa三氟乙酸
thf四氢呋喃
tlc薄层色谱法
tscl甲苯磺酰氯
在本文的范围中，除非上下文另外指出，否则非本发明化合物的特定所需最终产物的成分的易于移除的基团被指定为“保护基团”。例如在以下标准参考文献中描述了通过此类保护基团、保护基团本身、和它们的切割反应对官能团的保护：例如如scienceofsynthesis：houben-weylmethodsofmoleculartransformation.[合成科学：分子转化的houben-weyl方法]，georgthiemeverlag[格奥尔格蒂梅出版社]，stuttgart[斯图加特]，德国2005.第41627页(url：http：//www.science-of-synthesis.com(电子版，48卷))；j.f.w.mcomie，“protectivegroupsinorganicchemistry[有机化学中的保护基团]”，plenumpress[plenum出版社]，伦敦和纽约1973，t.w.greene和p.g.m.wuts，“protectivegroupsinorganicsynthesis[有机合成中的保护基团]”，第三版，wiley[威利出版社]，纽约1999，“thepeptides[肽]”；第3卷(编辑：e.gross和j.meienhofer)，academicpress[学术出版社]，伦敦和纽约1981，“methodenderorganischenchemie”(methodsoforganicchemistry)[有机化学方法]，houbenweyl，第4版，第15/i卷，georgthiemeverlag[格奥尔格蒂梅出版社]，stuttgart[斯图加特]1974，h.-d.jakubke和h.jescheit，”
可以按本身已知的方式制备具有至少一个成盐基团的本发明化合物的盐。例如，例如可以通过用金属化合物，例如适合的有机羧酸的碱金属盐(如2-乙基己酸的钠盐)；用有机碱金属或碱土金属化合物(例如相应的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，如氢氧化钠或氢氧化钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾)；用相应的钙化合物或用氨或适合的有机胺；优选使用化学计量的量或仅少量过量的成盐剂处理化合物来形成具有酸基团的本发明化合物的盐。本发明化合物的酸加成盐以常规方式获得，例如通过用酸或适合的阴离子交换试剂处理化合物。包含酸和碱成盐基团(例如游离羧基基团和游离氨基基团)的本发明化合物的内盐可以例如通过将盐(例如酸加成盐)中和至等电点(如使用弱碱或通过离子交换剂处理)而形成。
盐可以常规方式转化为游离化合物；例如，通过用适合的酸和酸加成盐处理，例如，通过用适合的碱性药剂处理可以转化金属和铵盐。
可以按本身已知的方式将根据本发明可获得的异构体的混合物分离成单独的异构体；非对映异构体可以例如通过在多相溶剂混合物之间分配、重结晶和/或色谱分离例如硅胶色谱分离或通过例如使用反相柱的中压液相色谱法来分离，外消旋体可以例如通过与光学纯的成盐试剂形成盐并分离(例如利用分级结晶分离)可如此获得的非对映异构体混合物或者通过在旋光活性柱材料上进行色谱处理来分离。
可以根据标准方法，例如使用色谱法、分配法、(重)结晶等，对中间体和终产物进行后处理和/或纯化。
实例
通过以下实例说明本发明，这些实例不应解释为限制性的。用于证明具有式(i)的化合物在这些测定中的功效的测定通常被认为是受试者体内功效的预测。
通用条件：
使用电喷雾电离在uhplc-ms系统上运行质谱。这些是watersacquity单通道探测器(watersacquitysinglequarddetector)。[m+h]+是指单同位素分子量。
质谱在lc-ms系统上以下列条件之一运行：
配备了sqd检测器的watersacquityuplc-h类系统。
柱：acquityuplchssc18(50*2.1)mm，1.8u。
柱温：环境温度
流动相：a)在水中的0.1％fa+5mm乙酸铵。
b)在乙腈中的0.1％fa。
梯度：在0.40min内5％-5％溶剂b、在0.80min内5％-35％溶剂b、在1.2min内35％-55％溶剂b、在2.5min内55％-100％溶剂b。
流速：0.55ml/min。
通过waters光电二极管阵列检测器检测化合物。
配备了zq2000检测器的waterslcms系统。
柱：x-bridgec18(50*4.6)mm，3.5u。
柱温：环境温度
流动相：a)在水中的0.1％nh3。
b)在乙腈中的0.1％nh3。
梯度：在5.00min内5％-95％溶剂b。
流速：1.0ml/min。
通过waters光电二极管阵列检测器检测化合物。
watersacquityuplc系统并配备了zq2000ms系统。
柱：kinetexbyphenomenex，2.6um，2.1x50mm
柱温：50℃
梯度：经1.29min时间段，2％-88％(或00％-45％，或65％-95％)溶剂b
流速：1.2ml/min。
通过waters光电二极管阵列检测器检测化合物。
用以下柱进行手性分离：
ad：chiralpakad-h，sfc21x250mm
od：chiralpakod-h，sfc21x250mm
nmr光谱在开放式varian400或varian500nmr光谱仪上运行。光谱在298k下测量，并使用溶剂峰来参考。1hnmr的化学位移以百万分率(ppm)报告。
实例1.1：(r)-6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[1.1]的合成
步骤1：乙基3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1a]
向乙基3-异丙基-1h-吡唑-5-甲酸酯(7.7g，49.3mmol)在dmf(体积：164ml)中的溶液里添加碳酸铯(16.07g，49.3mmol)。将反应混合物冷却至0℃，随后缓慢添加1-溴-3-甲氧基丙烷(5.83ml，51.8mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌16h。用水淬灭后，将反应混合物用etoac萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱法(在庚烷中的0％至50％etoac)纯化，以给出乙基3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(4.65g，41％)。lcms(m/z)：301[m+h]+。1hnmr(400mhz，cdcl3)：6.23(s，1h)，4.38(d，j＝7.14hz，1h)，4.33-4.41(m，1h)，4.21-4.30(m，2h)，3.51-3.58(m，2h)，3.36(s，3h)，2.05(t，j＝6.28hz，2h)，1.38(t，j＝7.12hz，3h)。
步骤2：乙基4-氯-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1b]
在0℃下，向乙基3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(4.6g，20.15mmol)在mecn(40.3ml)中的溶液里添加二氯硫酰(24.18ml在dcm中的1m溶液，24.18mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌16h。将挥发性材料在真空中去除。将粗产物用etoac稀释，将其用饱和nahco3溶液、水和盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，滤出并浓缩，以给出产物4.5g(85％产率)。将粗材料不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：263[m+h]+。
步骤3：(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1c]
向乙基4-氯-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(4.5g，17.13mmol)、三苯基膦(5.39g，20.56mmol)、(r)-叔丁基(1-羟基-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯(4.84g，22.27mmol)在thf(57.1ml)中的溶液里分批添加(e)-二叔丁基二氮烯-1，2-二甲酸酯(4.73g，20.56mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌16小时。将挥发性材料在真空中去除。向剩余的材料中添加水和etoac。分离各相，并且将有机层用水和盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％-20％)纯化，以给出产物7.45g(94％产率)。lcms(m/z)：462[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：6.20(s，1h)，4.64-4.52(m，1h)，4.39(q，j＝7.0hz，2h)，4.36-4.28(m，2h)，3.81(td，j＝11.0，3.8hz，1h)，3.54(td，j＝6.3，4.0hz，3h)，3.35(s，3h)，2.10-1.99(m，2h)，1.47(s，9h)，1.42(t，j＝7.2hz，3h)，0.99(s，9h)。
步骤4：(r)-叔丁基(1-(4-氯-5-(羟甲基)-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯[1.1d]
在室温下，向(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(7.45g，16.13mmol)在me-thf(38.4ml)中的溶液里添加硼氢化钠(1.22g，32.3mmol)。将反应混合物缓慢温热至60℃并在60℃下加热后，经30min添加meoh(3.26ml，81mmol)。添加完成时，将混合物在70℃下加热90min。然后将反应混合物冷却至20℃，并用饱和nh4cl水溶液(30ml)淬灭。搅拌1.5h后，将有机层分离，并且将水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相经mgso4干燥，滤出并浓缩，以给出粗产物(6.7g，99％)。将粗材料不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：420[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：6.24(bs，1h)，4.72(m，1h)，4.59(m，2h)，4.36(m，1h)，4.30(m，2h)，3.8(m，2h)，3.56(m，2h)，3.37(s，3h)，2.11-2.05(m，2h)，1.32(s，9h)，1.02(s，9h)。
步骤5：(r)-叔丁基(1-(4-氯-5-甲酰基-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯[1.1e]
向(r)-叔丁基(1-(4-氯-5-(羟甲基)-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯(850mg，2.024mmol)在dcm(20.2ml)中的溶液里添加戴斯-马丁(dess-martin)试剂(1.03g，2.429mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加硫代硫酸钠和碳酸氢钠(1∶4，20ml)的溶液后，将反应混合物搅拌2h并用etoac萃取。将有机层用饱和nahco3水溶液、水和盐水洗涤。经na2so4干燥并滤出后，将滤液在真空中浓缩。将粗材料通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至40％)纯化，以给出产物(637mg，75％产率)。lcms(m/z)：418[m+h]+。
步骤6：(r)-6-(叔丁基)-3-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-6，7-二氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[1.f]
在0℃下，将tfa(1.8ml)添加至(r)-叔丁基(1-(4-氯-5-甲酰基-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯(220mg，0.526mmol)在dcm(3.5ml)中的溶液中。在室温下搅拌3小时后，将混合物在真空中浓缩。将粗材料不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：300[m+h]+。
步骤7：(6r)-乙基6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10，11，11a-四氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯[1.1g]
将(z)-乙基2-(乙氧基亚甲基)-3-氧代丁酸酯(93μl，0.507mmol)添加至(r)-6-(叔丁基)-3-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-6，7-二氢吡唑并[1，5-a]吡嗪(70mg，0.169mmol)在etoh(0.77ml)中的溶液中，并且将混合物在85℃下加热16小时。将反应混合物在真空中浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至100％)纯化，以给出产物(74mg，99％产率)。lcms(m/z)：440[m+h]+。
步骤8：(r)-乙基6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯[1.h]
将氯醌(41.4mg，0.168mmol)添加至(6r)-乙基6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10，11，11a-四氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯(74mg，0.168mmol)在dme(0.84ml)中的溶液中，并且将反应混合物在90℃下加热60分钟。将挥发性材料在真空中去除后，将反应混合物用etoac稀释并用饱和nahco3水溶液、水和盐水洗涤。将有机层经na2so4干燥并浓缩。将粗材料(73mg，99％产率)不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：438[m+h]+。
步骤9：(r)-6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[1.1]
向(r)-乙基6-(叔丁基)-1-氯-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯(73mg，0.167mmol)在thf(0.33ml)和meoh(0.33ml)中的溶液里添加lioh(0.3ml，1.0m在水中，0.3mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物用1.0nhcl水溶液(0.08ml)酸化，并用dcm萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗材料通过反相hplc纯化。收集并冻干纯的级分，以给出呈其tfa盐形式的产物(9.8mg，11％产率)。lcms(m/z)：410[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：8.55(s，1h)，7.56(s，1h)，4.64(d，j＝14.19hz，1h)，4.49(dd，j＝4.97，14.19hz，1h)，4.36(t，j＝6.38hz，2h)，4.14(d，j＝4.73hz，1h)，3.58(t，j＝6.15hz，2h)，3.38(s，3h)，2.16-2.39(bs，1h)，2.02-2.16(m，2h)，0.91(s，9h)。
中间体1c的替代合成路线：
步骤1.乙基3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1i]
在0℃下，向乙基5-氧代-4，5-二氢-1h-吡唑-3-甲酸酯(9.5g，60.8mmol)在dcm和dmf(体积：125.5ml，比率：7∶1)中的溶液里添加咪唑(6.21g，91mmol)和tbdmscl(10.09g，66.9mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物用水淬灭并用etoac萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤出，并在真空中干燥。将粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：271[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：6.16(s，1h)，4.37(d，j＝7.09hz，2h)，1.38(t，j＝7.09hz，3h)，0.98(s，9h)，0.27(s，6h)。
步骤2.(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1j]
在0℃下，将(e)-二叔丁基二氮烯-1，2-二甲酸酯(15.41g，66.9mmol)添加至三苯基膦(17.55g，66.9mmol)、乙基3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(14.54g，66.9mmol)、和(r)-叔丁基(1-羟基-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯(16.45g，60.8mmol)在thf(体积：203ml)中的搅拌溶液中。将混合物温热并在室温下搅拌过夜。lcms(m/z)：470(mh+)，1.35min。用水(300ml)淬灭后，将反应混合物用etoac(300mlx2)萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，滤出，并在真空中浓缩。将粗白色固体用dcm、etoac和庚烷(1∶1∶8，100ml)研磨并滤出。将滤液浓缩，以产出(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯。残余物提供了14.5g三苯基氧化膦。将粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：470[m+h]+。
步骤3.(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-羟基-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1k]
在0℃下，向(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(28.6g，60.9mmol)在mecn(体积：203ml)中的溶液里添加1mso2cl2在dcm(73.1ml，73.1mmol)中的溶液。将反应混合物温热至室温并搅拌1h。将挥发性材料在真空中去除。将粗产物用etoac稀释，将其用na2co3溶液、水和盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，滤出，并在真空中浓缩。将粗产物不经进一步纯化即用于下一步骤(产率：＞200％)。lcms(m/z)：390[m+h]+。
步骤4.(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-羟基-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.1c]
向(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-羟基-1h-吡唑-5-甲酸酯(17g，43.6mmol)在dmf(体积：145ml)中的溶液里添加碳酸铯(21.31g，65.4mmol)。将反应混合物冷却至0℃，随后添加1-溴-3-甲氧基丙烷(5.89ml，52.3mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌3h。用水淬灭后，将反应混合物用etoac萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥，滤出，并在真空中浓缩。将粗产物通过isco(0％至20％etoac在庚烷中)纯化。所需产物出现于约20％etoac，以产出(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-4-氯-3-羟基-1h-吡唑-5-甲酸酯(15.2g，75％)。lcms(m/z)：462[m+h]+。
实例1.2：(r)-6-(叔丁基)-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[1.2]的合成
按照描述于实例1.1步骤3-8中的程序由化合物1.1a合成化合物1.2。lcms(m/z)：376[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：8.52(s，1h)，6.91(s，1h)，6.10(s，1h)，4.68(d，j＝14.2hz，1h)，4.51(dd，j＝14.3，5.1hz，1h)，4.28(t，j＝6.4hz，2h)，4.13(d，j＝5.0hz，1h)，3.57(t，j＝6.2hz，2h)，3.38(s，3h)，2.07(p，j＝6.3hz，2h)，0.92(s，9h)。
实例1.3：(r)-1-溴-6-(叔丁基)-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[1.3]的合成
步骤1：乙基(r)-1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基于基)-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.3a]
按照描述于实例1.1步骤3中的程序由化合物1.1a合成化合物1.3a。lcms(m/z)：454，456[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：8.50(s，1h)，7.70(s，1h)，4.66(d，j＝14.2hz，1h)，4.51(dd，j＝14.2，5.1hz，1h)，4.38(t，j＝6.4hz，2h)，4.09(d，j＝5.0hz，1h)，3.59(td，j＝6.2，1.0hz，2h)，3.39(s，3h)，2.10(p，j＝6.3hz，2h)，0.91(s，9h)。
步骤2：(r)-乙基4-溴-1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯[1.3b]
在0℃下，将nbs(0.475g，2.67mmol)添加至(r)-乙基1-(2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3，3-二甲基丁基)-3-(3-甲氧基丙氧基)-1h-吡唑-5-甲酸酯(1.2g，2.81mmol)在mecn(9.36ml)中的溶液中，并且将所得混合物在0℃下搅拌2小时。将反应溶液用na2co3溶液淬灭，用乙酸乙酯萃取两次。将有机层用水和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在真空中浓缩。将粗材料通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷20％)纯化，以给出产物(775mg，55％产率)。lcms(m/z)：506，508[m+h]+。
步骤3：(r)-1-溴-6-(叔丁基)-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[1.3]
按照描述于实例1.1步骤4-8中的程序由化合物1.3b合成化合物1.3。lcms(m/z)：454，456[m+h]+。1hnmr(500mhz，cdcl3)：8.50(s，1h)，7.70(s，1h)，4.66(d，j＝14.2hz，1h)，4.51(dd，j＝14.2，5.1hz，1h)，4.38(t，j＝6.4hz，2h)，4.09(d，j＝5.0hz，1h)，3.59(td，j＝6.2，1.0hz，2h)，3.39(s，3h)，2.10(p，j＝6.3hz，2h)，0.91(s，9h)。
实例2.1：6-(叔丁基)-2-异丙基-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[2.1]的合成
步骤1：乙基1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-3-异丙基-1h-吡唑-5-甲酸酯
向乙基3-异丙基-1h-吡唑-5-甲酸酯(1.5g，8.23mmol)在dme(11.76ml)中的溶液里添加2，6-二甲基吡啶(1.246ml，10.70mmol)和1-溴-3，3-二甲基丁-2-酮(1.164ml，8.64mmol)。将反应混合物在微波反应器中在150℃下加热2小时。将1.0ml二甲基吡啶和0.5ml溴频哪酮添加至反应混合物中。将混合物在微波反应器中在100℃下再次加热6小时。在rt下冷却后，将反应溶液添加水并用dcm萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗产物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至30％)纯化，以给出产物(1.15g，50％产率)。lcms(m/z)：281[m+h]+。1hnmr(400mhz，cdcl3)：6.65(s，1h)，5.21(s，2h)，4.37(q，j＝7.1hz，2h)，2.57(庚，j＝7.0hz，1h)，1.37(t，j＝7.1hz，3h)，1.29-1.19(m，15h)。
步骤2：1-(5-(羟甲基)-3-异丙基-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-醇
在0℃下，向乙基1-(3，3-二甲基-2-氧代丁基)-3-异丙基-1h-吡唑-5-甲酸酯(1.7g，6.06mmol)在thf(16.17ml)中的溶液里添加libh4(0.396g，18.19mmol)，并且将所得混合物在室温下搅拌5小时。然后将反应混合物置于冰/水浴中，并通过缓慢添加饱和nh4cl水溶液来淬灭。然后将混合物用etoac萃取。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗材料不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：241[m+h]+。
步骤3：1-(5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-异丙基-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-醇[2.1c]
在0℃下，向1-(5-(羟甲基)-3-异丙基-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-醇(1.45g，6.03mmol)在dcm(57.5ml)中的溶液里添加tea(1.850ml，13.27mmol)和tbdmscl(1.091g，7.24mmol)。在rt下搅拌24小时后，将混合物用et2o稀释并用饱和nh4cl水溶液洗涤。将有机层分离，经mgso4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至100％)纯化，以给出产物(905mg，42.3％产率)。lcms(m/z)：355[m+h]+。1hnmr(400mhz，cdcl3)：5.95(s，1h)，4.68-4.56(m，3h)，4.32(dd，j＝13.7，1.8hz，1h)，3.86(dd，j＝13.7，10.0hz，1h)，3.62(dd，j＝10.0，1.8hz，1h)，2.92(庚，j＝6.9hz，1h)，1.23(dd，j＝6.9，1.0hz，6h)，1.00(s，9h)，0.89(s，9h)，0.07(d，j＝1.6hz，6h)。
步骤4：(6r)-乙基1-溴-6-(叔丁基)-2-(3-甲氧基丙氧基)-10-氧代-6，10，11，11a-四氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯[2.1d]
按照描述于实例1.1步骤5中的程序由化合物2.1c合成化合物2.1d。lcms(m/z)：353[m+h]+。1hnmr(400mhz，cdcl3)：5.98(s，1h)，5.23(s，2h)，4.52(s，2h)，2.94(庚，j＝7.1hz，1h)，1.24(d，j＝7.1hz，15h)，0.87(s，9h)。
步骤5：叔丁基(1-(5-(羟甲基)-3-异丙基-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-基)氨基甲酸酯[2.1e]
向1-(5-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-3-异丙基-1h-吡唑-1-基)-3，3-二甲基丁-2-酮(771mg，2.187mmol)在meoh(7.3ml)中的溶液里添加nh4oac(1686mg，21.87mmol)和nabh3cn(412mg，6.56mmol)。然后在rt下将所得混合物搅拌16小时。添加另一部分nabh3cn(412mg，6.56mmol)，并且将混合物在rt下再搅拌5小时。将反应通过添加饱和na2co3水溶液淬灭，并且然后用etoac萃取。将有机层用水和盐水洗涤，经mgso4干燥并浓缩。将残余物溶解在dcm(5ml)中。将boc-酸酐(1.523ml，6.56mmol)和tea(1ml)添加至上述溶液中。在rt下搅拌1h后，将混合物在真空中浓缩，并且将粗材料通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至100％)纯化，以给出产物(624mg，84％产率)。lcms(m/z)：340[m+h]+。1hnmr(400mhz，cdcl3)：6.08(s，1h)，4.61(d，j＝5.2hz，2h)，4.45-4.36(m，2h)，3.98(td，j＝11.0，4.4hz，1h)，3.81(s，1h)，2.94(dq，j＝13.9，7.1hz，1h)，1.45(s，6h)，1.30-1.20(m，9h)，1.01(s，9h)。
步骤6：6-(叔丁基)-2-异丙基-10-氧代-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[2.1]
按照描述于实例1.1步骤5-9中的程序由化合物2.1e合成化合物2.1。lcms(m/z)：330[m+h]+。nmr(400mhz，cdcl3)δ8.5(s，1h)，6.93(s，1h)，6.51(s，1h)，4.85-4.78(m，1h)，4.60-4.50(m，1h)，4.12(m，1h)，3.02(m，1h)，1.3(d，j＝6.94hz，6h)，0.86(s，9h)。
实例3.1：(r)-6-(叔丁基)-1-氯-10-氧代-2-苯基-5，6-二氢-10h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.1]的合成
步骤1：甲基(z)-4-羟基-2-氧代-4-苯基丁-3-烯酸酯[3.1a]
在0℃下，向乙酰苯(5.0g，41.614mmol)在dmf(35.0ml)中的溶液里分批添加氢化钠(1.99g，60％在矿物油中，49.93mmol)，并且将所得混合物在0℃下搅拌30分钟。在0℃下添加草酸二甲酯(5.89g，49.93mmol)，并且将混合物在rt下搅拌1小时并在50℃下搅拌30分钟。将反应通过水淬灭，并且将混合物用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将粗材料通过硅胶柱色谱法(etoac/己烷，4％)纯化，以给出产物2.0g(19.45％产率)。lcms(m/z)：207.22；[m+h]+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)：14.98(s，1h)，8.12-8.05(m，2h)，7.72(t，j＝7.4hz，1h)，7.59(t，j＝7.7hz，2h)，7.14(s，1h)，3.87(s，3h)。
步骤2：甲基3-苯基-1h-吡唑-5-甲酸酯[3.1b]
在0℃下，向甲基(z)-4-羟基-2-氧代-4-苯基丁-3-烯酸酯(1.80g，8.712mmol)在乙醇(9ml)中的溶液里逐滴添加水合肼一水合物(0.436g，8.712mmol)，随后添加催化量的乙酸。然后将混合物在80℃下搅拌5小时。在rt下冷却后，将反应混合物通过添加冰水淬灭，并且然后用dcm萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。向残余物中添加戊烷，并通过过滤收集沉淀物，以给出产物1.57g(88.9％产率)。lcms(m/z)：203.3[m+h]+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)：14.08(s，1h)，7.86(dd，j＝23.9，7.7hz，2h)，7.45(dt，j＝21.5，7.3hz，2h)，7.42-7.29(m，1h)，7.22(d，j＝2.1hz，1h)，3.85(d，j＝19.2hz，3h)。
步骤3：(r)-6-(叔丁基)-1-氯-10-氧代-2-苯基-5，6-二氢-10h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.1]
按照描述于实例1.1步骤2-8中的程序由化合物3.1b合成化合物3.1。lcms(m/z)：398.5[m+h]+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)：15.82(s，1h)，8.99(s，1h)，7.87(d，j＝7.5hz，2h)，7.52(dt，j＝15.7，7.2hz，3h)，7.43(s，1h)，4.95(d，j＝14.0hz，2h)，4.86(d，j＝13.7hz，1h)，0.79(s，9h)。
实例3.2：(r)-6-(叔丁基)-1-氯-2-(2-甲氧基苯基)-10-氧代-5，6-二氢-10h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.2]的合成
按照描述于实例3.1步骤1-3中的程序由1-(2-甲氧基苯基)乙-1-酮合成化合物3.2。lcms(m/z)：428.45[m+h]+。1hnmr(400mhz，dmso-d6)：15.87(s，1h)，8.99(s，1h)，7.50(t，j＝7.9hz，1h)，7.39-7.28(m，2h)，7.19(d，j＝8.5hz，1h)，7.07(t，j＝7.4hz，1h)，4.96-4.81(m，3h)，3.80(s，3h)，0.81(s，9h)。
实例3.3：(r)-6-异丙基-10-氧代-2-苯基-5，6-二氢-10h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.3]的合成
步骤1：(r)-2-(苄基氨基)-3-甲基丁-1-醇[3.3a]
在rt下，向(r)-2-氨基-3-甲基丁-1-醇(5.16g，50.0mmol)在thf(20ml)中的溶液里添加(溴甲基)苯(1.71g，10mmol)，并且将所得溶液在rt下搅拌4小时。然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，用水(20mlx5)洗涤，经mgso4干燥并浓缩，以得到产物。将粗材料不经进一步纯化即用于下一步骤。lcms(m/z)：194.3[m+h]+。
步骤2：(r)-2-(苄基((3-苯基-1h-吡唑-5-基)甲基)氨基)-3-甲基丁-1-醇[3.3b]
向3-苯基-1h-吡唑-5-甲醛(0.35g，2.033mmol)和(r)-2-(苄基氨基)-3-甲基丁-1-醇(0.393g，2.033mmol)在dce(6ml)中的悬浮液混合物里添加三乙酰氧基硼氢化钠(1.120g，5.29mmol)，并且将所得混合物在rt下搅拌3小时。然后将混合物用etoac稀释，并小心地添加饱和nahco3水溶液直至ph为约7。将有机层分离，用mgso4干燥并浓缩。将粗材料通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，10％-60％)纯化，以给出产物320mg(45.0％产率)。lcms(m/z)：350.4[m+h]+。
步骤3：(r)-5-苄基-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3c]
向(r)-2-(苄基((3-苯基-1h-吡唑-5-基)甲基)氨基)-3-甲基丁-1-醇(270mg，0.773mmol)和三苯基膦(709mg，2.70mmol)在thf(5ml)中的溶液里添加dead(0.428ml，2.70mmol)，并且将所得混合物在rt下搅拌3小时。然后将混合物浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，10％至60％)纯化，以给出产物157mg(61％产率)。lcms(m/z)：332.4[m+h]+。
步骤4：(r)-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3d]
将(r)-5-苄基-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪(160mg，0.483mmol)、pd碳(103mg，10％碳，0.965mmol)和nh4cooh(122mg，1.931mmol)在meoh(3m1)中的混合物在75℃下加热1小时。在rt下冷却后，将混合物过滤并且将滤液浓缩，以给出产物126mg(定量产率)。lcms(m/z)：242.3[m+h]+。
步骤5：(r)-5-氯-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3e-i]和(r)-3，5-二氯-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3e-ii]
向(r)-6-异丙基-2-苯基-4，5，6，7-四氢吡唑并[1，5-a]吡嗪(114mg，0.472mmol)在dcm(1.2ml)和meoh(0.25ml)中的溶液里添加ncs(72.5mg，0.543mmol)，并且将所得混合物在rt下搅拌3小时。然后将混合物浓缩，并且将残余物直接用于下一步骤。
3.3e-i：lcms(m/z)：276.4[m+h]+。
3.3e-ii：lcms(m/z)：310.3[m+h]+。
步骤6：(r)-6-异丙基-2-苯基-6，7-二氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3f-i]和(r)-3-氯-6-异丙基-2-苯基-6，7-二氢吡唑并[1，5-a]吡嗪[3.3f-ii]
将来自前一步骤的粗产物溶解于dcm(5ml)中，并且然后添加dbu(0.071ml，0.472mmol)。在rt下搅拌10分钟后，将混合物浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，0％至70％)纯化，以给出产物3.3f-i和3.3f-ii。
3.3f-i：60mg(53％产率)。lcms(m/z)：240.4[m+h]+。
3.3f-ii：14mg(11％产率)。lcms(m/z)：274.4[m+h]+。
步骤7：(r)-乙基6-异丙基-10-氧代-2-苯基-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯[3.3g]
将(r)-6-异丙基-2-苯基-6，7-二氢吡唑并[1，5-a]吡嗪(30mg，0.125mmol)和(z)-乙基2-(乙氧基亚甲基)-3-氧代丁酸酯(70.0mg，0.376mmol)在etoh(0.7ml)中的混合物在110℃下加热16小时。在rt下冷却后，将混合物在真空中浓缩。将残余物溶解于dme(0.5ml)中，并添加对氯醌(30.7mg，0.125mmol)。将所得混合物在110℃下加热2小时。在rt下冷却后，将混合物在真空中浓缩，并且将残余物通过硅胶柱色谱法(etoac/庚烷，20％至100％)纯化，以给出产物18mg(0.048mmol，38.2％产率)。lcms(m/z)：378.4[m+h]+。
步骤8：(r)-6-异丙基-10-氧代-2-苯基-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.3]
将lioh在水(0.191ml，1.0m，0.191mmol)中的溶液添加至(r)-乙基6-异丙基-10-氧代-2-苯基-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸酯(18mg，0.048mmol)在thf(1.0ml)中的溶液中，并且将所得溶液在rt下搅拌2小时。然后将混合物浓缩并通过添加3.0nhcl水溶液酸化至ph＝4。将沉淀物通过过滤收集并且然后用水洗涤，以给出产物8.0mg(47％产率)。lcms(m/z)：350.4[m+h]+。1hnmr(400mhz，cd3cn)：8.63(s，1h)，7.95-7.80(m，2h)，7.56-7.26(m，4h)，7.10(s，1h)，4.87-4.59(m，2h)，4.48(dd，j＝8.7，4.0hz，1h)，1.93-1.86(m，1h)，0.97(d，j＝6.7hz，3h)，0.84(d，j＝6.8hz，3h)。
实例3.4：(r)-1-氯-6-异丙基-10-氧代-2-苯基-6，10-二氢-5h-吡唑并[1，5-a]吡啶并[2，1-c]吡嗪-9-甲酸[3.4]
按照描述于实例3.3步骤7-8中的程序由化合物3.3f-ii合成化合物3.4。lcms(m/z)：384.5[m+h]+。1hnmr(400mhz，cd3cn)：8.66(s，1h)，7.90(t，j＝6.7hz，2h)，7.52(t，j＝7.1hz，4h)，4.87-4.57(m，2h)，4.48(d，j＝9.0hz，1h)，1.90-1.77(m，1h)，1.06-0.73(m，6h)。
生物学实例
hbv细胞系
基于tet诱导型hepad38细胞系并稍加修饰生成hepg2-clone42(具有稳定整合的1.3merhbvayw株拷贝的tet诱导型hbv表达细胞系)。ladnersk等人，antimicrobialagentsandchemotherapy.[抗微生物剂与化疗]41(8)：1715-1720(1997)。在补充有10％胎牛血清(美国生命技术公司(lifetechnologies))、终浓度为0.5mg/ml的g-418(康宁公司(corning)，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)、和5μg/ml多西环素(西格玛公司(sigma)，圣路易斯市，密苏里州，美国)的dmem/f-12+glutamaxtm(美国生命技术公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)中培养hepg2-clone42细胞，并维持在37℃下5％co2中。
hbsag测定
将hepg2-clone42细胞以6.0x104个细胞/孔的浓度接种至黑色透明底部96孔板中。接种后24小时，将细胞用200μl/孔的培养基处理，所述培养基含有化合物在dmso中的五倍连续稀释液。单独使用dmso作为无药物对照。在所有孔中的最终dmso浓度为0.5％。
使用hbsagelisa试剂盒(阿尔法诊断国际公司(alphadiagnosticinternational)，圣安东尼奥，得克萨斯州，美国，目录号4110)确定所分泌的hbvsag的水平(半定量)。按照所描述的制造商的方案进行hbsagelisa测定。
步骤1.将100μl每种化合物或经dmso处理的样品移液到hbsagelisa板中。密封板并在室温下孵育60分钟。
步骤2.抽吸样品并用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μl抗体-hrp缀合物分配至每个孔。在室温下孵育30分钟。
步骤3.抽吸样品并用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μltmb底物添加至所有孔中，并在室温下孵育15分钟。
步骤4.将100μl终止溶液分配至每个孔。测量elisa板在450nm处的吸光度。
剂量反应曲线
生成剂量-反应曲线，并且将ec50值定义为与dmso对照相比hbsag分泌减少50％的化合物浓度。
确定如下ec50值：
确定hbsag分泌抑制的百分比。使用以下公式计算hbsag分泌抑制的抑制百分比：
(xc-mb)/(md-mb)
其中xc是来自经化合物处理的孔的吸光度信号；mb是第12列(无细胞+hbsagelisa样品缓冲液)的平均吸光度信号(背景信号)，并且md是来自经dmso处理的孔的平均吸光度信号。然后使用四参数曲线逻辑方程式通过非线性回归计算ec50值。
所采用的曲线拟合模型是xlfit剂量反应单位点模型204：y＝(a+((b-a)/(1+(10^((c-x)*d)))))，其中a是最小y值，b是最大y值，c是对数ec50值，并且d是斜率因子。+++意指＜1nm；++意指≥1nm且≤10nm，以及+意指＞10nm。
表1.所选的具有式(i)的化合物的体外活性。