治疗淋巴瘤的方法与流程

文档序号：21697910发布日期：2020-07-31 22:49阅读：956来源：国知局

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年10月6日提交的新加坡临时申请第10201708262r号的优先权的权益，其内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

本发明总体上涉及分子生物学领域。具体地，本发明涉及生物标记物用于检测和治疗癌症的用途。

发明背景

自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)是一种少见的侵袭性恶性肿瘤，常见于亚洲人、墨西哥人和南美人群体。除日本之外，它是亚洲最常见的成熟t细胞淋巴瘤。瘤性细胞总是被爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)感染，且特征在于细胞毒性表型。

免疫检查点抑制剂已经改变了治疗许多癌症(包括一些血液恶性肿瘤)的局面。对若干实体瘤(包括非小细胞肺癌、黑素瘤和膀胱癌)的研究通常得出以下结论：免疫组织化学(ihc)pd-l1阳性与对pd-1/pd-l1阻断的应答的更大可能性一致。然而，pd-l1阴性肿瘤患者也有较低但明确的应答率。这些观察结果突出了采用基于每个患者单一肿瘤样本的pd-l1免疫组织化学作为pd-1阻断疗法的绝对选择标准的许多缺陷。

结外自然杀伤细胞/t细胞鼻型淋巴瘤(enkl)是一种少见的侵袭性恶性肿瘤，常见于亚洲人、墨西哥人和南美人群体。到目前为止，还没有可用于治疗enkl的靶向疗法。鉴于基于蒽环类的enkl方案与不良结果相关联，所以基于l-天冬酰胺酶的方案，如smile(地塞米松、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、l-天冬酰胺酶、依托泊苷)方案具有显著改善的临床结果，特别是对于患有播散性疾病的患者具有显著改善的临床结果。然而，在高达40％至50％的病例中，smile或smile类似方案仍然失败，并且与smile相关的毒性也妨碍了其在老年患者中的使用。

此外，仍然没有fda批准的靶向方案来应对自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)，因为该疾病较为罕见，并且使得鉴定对疗法应答的生物标记物具有挑战性。因此，存在对鉴定自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法和治疗其的方法的未满足的需要。

技术实现要素：

在一个方面，本发明涉及治疗受试者中的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的派姆单抗(pembrolizumab)，其中受试者的特征在于存在至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排。

在另一方面，本发明涉及一种测定患有自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的受试者对派姆单抗治疗的应答的方法，该方法包括从该受试者获得样品；检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失；其中至少一种jak激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在指示该受试者将对派姆单抗治疗应答。

在另一方面，本发明涉及用于检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失的试剂盒，该试剂盒包含检测试剂和至少一对引物；其中引物针对jak3和pd-l1基因的基因组区域富集。

在另一方面，本发明涉及用于下一代测序的检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失的试剂盒。

在另一方面，本发明涉及用于根据本文公开的方法的本文公开的试剂盒。

附图说明

当结合非限制性实例和附图考虑时，参考详细描述将更好地理解本发明，在附图中：

图1示出11种来自患者的经预处理的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤肿瘤的基因组图谱，患者随后用派姆单抗治疗。图1a示出在11对nktl-正常全基因组测序数据中发现的再发性和互斥的非沉默基因组改变的梯型图。梯型图的顶部表示非沉默突变的数目。图1b示出在本研究中验证的pd-l1结构重排的示意图。图1c示出nktl1患者的正电子发射断层摄影-计算机断层摄影的正面和侧面扫描，该患者在用派姆单抗治疗之前和在用派姆单抗治疗之后已经获得了来自派姆单抗的完全应答。

图2示出十一例结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者的治疗时间线，患者在多条治疗线失败后施用派姆单抗。

图3是指在11例派姆单抗治疗的患者的初始肿瘤中再发的体细胞突变基因。从上到下的基因排序的优先顺序是通过由派姆单抗治疗获得完全应答的患者队列中的基因的再发性和互斥性。使用来自wannovar’s1k基因组和exac数据库的1％的maf作为截止值。

图4示出对派姆单抗完全应答的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者中鉴定的pd-l1重排和jak3激活突变的验证。使用sanger测序确认每个pd-l1结构重排的断点和通过全基因组测序鉴定的jak3突变。野生型(wt)pd-l1的基因结构在顶部示出作为参考。下面示出了涉及每个预测的重排pd-l1的断点。白色箭头表示内含子和转录取向。所有肿瘤均为施用派姆单抗前的活组织检查。nktl1、nktl26、nktl28和nktl31携带重排的pd-l1。验证nktl29和nktl30携带g>a突变，翻译为jak3p.a573v。

图5示出从全基因组测序数据推断的破坏nktl26中pd-l1的3’utr的串联复制的示意图。9p24.1内的野生型区域已分为三块(q、r和s)，每块以不同的颜色示出。q-r和r-s之间的边界表示串联复制的断点。该重排是杂合的，并且示意图显示匹配正常样品中的野生型等位基因以及肿瘤中的野生型和突变等位基因。肿瘤中pd-l1的总拷贝数为三；突变等位基因具有3’utr被破坏的pd-l1。野生型等位基因含有q+r+s，而突变等位基因含有q+r1+r+s。当突变等位基因的r1+r+s的基因组区域被转录时，3’utr被破坏的pd-l1和野生型pd-l1将分别从r1和r转录。两条点线表示野生型基因组规模上串联复制的边界。

图6是指来自sciclone的克隆性簇状图。建议sciclone仅分析从拷贝数为2的基因组区域调用的单个核苷酸变异，而不发生杂合性丧失(loh)。因此，使用canvas获得拷贝数和loh信息。因为仅分析了杂合突变，因此针对100％癌细胞分数的肿瘤所建立的克隆最多只能产生一个簇，该簇位于来自sciclone的簇状图的50％标记附近。

图7示出来自32对肿瘤-正常结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤样品的通过全基因组测序(wgs)数据揭示的频繁的体细胞pd-l1结构重排(sr)。图7a示出32个结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤未处理样品的扩展队列中的再发性突变基因的梯型图。影响每个基因的突变类型附在梯型图的底部。图7b是指在新鲜冷冻的wgs样品中检测到的体细胞sr的3-轨迹circos表示。最外侧的轨迹代表来自hs37参考基因组的主要人类染色体。中间轨迹是从最小零(内部轨迹)到最大八(外部轨迹)描绘在相应基因组区域中具有sr断点的唯一样品数量的直方图。内部轨迹具有黑色弧线，每个弧线是破坏pd-l1的3’utr的sr。图7c示出在32个未处理样品的队列中验证的pd-l1结构重排的示意图。

图8涉及32个未处理nktl样品队列中鉴定的pd-l1重排的sanger验证。使用sanger测序来确认通过全基因组测序鉴定的每个pd-l1结构重排的断点(以虚线表示)。野生型(wt)pd-l1的基因结构在顶部示出作为参考。sanger测序的sr的色谱图伴随重排的pd-l1的示意图。白色箭头表示内含子和转录取向。所有肿瘤均为施用派姆单抗前的活组织检查。nktl6携带具有3’utr缺失和上游73bp反向内含子序列插入的组合的重排(复合物*)。nktl1、nktl26、nktl28和nktl31是来自派姆单抗-治疗队列的样品。nktl4、nktl6、nktl11、nktl15、nktl16和nktl17是患病率未处理队列中的样品。所有肿瘤是在施用任何治疗之前的初始活组织检查。

图9示出pd-l1的异常融合转录物。版面‘nktl16’示出样品nktl16中易位至染色体6的pd-l1的基因组和转录组结构。版面‘nktl6’示出样品nktl6中复杂的染色体内重排，其中3’utr缺失伴随着上游73bp反向内含子序列的插入。版面‘nktl15’示出样品nktl15中的串联复制。版面‘nktl4’示出样品nktl4中的染色体内缺失。版面‘nktl17’也示出样品nktl17中的染色体内缺失。虚线和箭头分别指示断点和融合取向。q、r和s块代表转录物块。三角形表示转录的取向，而多腺苷酸化(polya)信号用黑色箭头表示。异常和野生型pd-l1mrna转录水平从全转录组测序数据获得，并且分别以深灰色和浅灰色呈现。对于串联复制事件，还示出伴随的拷贝数(cn)改变。用sanger测序对嵌合cdna进行断点验证，并且显示每种情况下的色谱图。

具体实施方式

近年来，免疫检查点(icp)抑制剂已经在许多恶性肿瘤的治疗中显示出有前景的客观应答率(orr)。值得注意的是，一个结果示出在复发性或难治性(rr)霍奇金淋巴瘤(hl)中使用程序性死亡-1(pd-1或cd279)抑制剂的80％客观应答率。目前，涉及非小细胞肺癌、黑素瘤和膀胱癌的临床研究通常得出以下结论：程序性死亡-配体1(pd-l1)的免疫组织化学(ihc)阳性与对pd-1/pd-l1阻断的应答的更大可能性一致。有趣的是，在pd-l1阴性肿瘤患者中也存在较低但明确的应答率。这些观察结果表明，可以从肿瘤中利用更多的信息并且扩大选择用于pd-1阻断疗法的患者的当前事实标准。

本发明人已经在已经用程序性细胞死亡1(pd-1)阻断疗法实现完全应答(cr)的复发性或难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(rrnktl)患者中鉴定了再发性遗传改变。

随着测序技术的进步，已经在自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)患者中发现了改变jak-stat通路的再发体细胞突变、表观遗传修饰物、ddx3x基因和hla-dpb1基因的种系遗传易感性，但是这些研究都没有使用全基因组测序(wgs)技术。为了以高测序通量和全基因组方式探索自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤基因组的可靶向基因组改变，使用全基因组测序数据研究11种预处理的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤肿瘤的体细胞改变，所述肿瘤具有对派姆单抗治疗的后续临床应答数据。

通过配对自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)肿瘤-正常样品的全基因组测序，显示体细胞断点簇存在于在36％的(11个中的4个)肿瘤中高度再发的程序性细胞死亡配体1(pd-l1/cd274)基因内。证实这些结构重排(sr)破坏pd-l1基因的3’非翻译区(utr)，导致pd-l1嵌合转录物的异常表达。

在一个实例中，在11例用派姆单抗治疗的患有复发性或难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)的个体中，在所有四个应答者中发现pd-l13’utr结构重排，但在四个无应答者中不存在。不受理论的约束，认为pd-l13’utr结构重排与对pd-1阻断的应答和降低的m2-巨噬细胞标记相关，从而允许将pd-1阻断疗法用于pd-l1重排的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，并进而改善这些患者的治疗结果。

本文公开了治疗受试者中的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的派姆单抗，其中受试者的分子基因组图谱的特征在于存在至少一种pd-l1结构重排。在一个实例中，公开了治疗受试者中的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的派姆单抗，其中受试者的特征在于存在至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排。

因此，在一个实例中，结构重排破坏pd-l1基因的3’非翻译区(3’utr)。在另一个实例中，pd-l1结构重排是pd-l1基因中的突变。在又一个实例中，pd-l1基因中的突变破坏pd-l1基因的3’utr。

在一个实例中，jak3激活突变为但不限于以下突变中的任何一种或多种：m511i、a572v、a573v、r657q、v722i、v674a、l857p、r403h、q501h、e958k。在另一个实例中，jak3激活突变是jak3基因(jak3refseqgeneid:nm_000215)中的单核苷酸取代(p.a572v或p.a573v)。换言之，在一个实例中，jak3激活突变是a572v。术语“jak3激活”突变”和“jak3突变”被认为是可互换的。

如本文所用，术语“突变”是指生物体或遗传因子的基因组的核苷酸序列的永久改变。突变可以为，但不限于，插入、缺失、取代、易位、倒位、微倒位、复制、串联重复、断点(突变)及其组合。

如本文所用，术语“结构重排”是指导致相关核酸序列的整体结构改变的一个或多个突变。“结构重排”跨越基因组区域，且该突变的边界称为断点。例如，在断点存在于基因中的情况下，如本文所公开的突变导致所述基因的结构改变。这种结构重排还可以指包含兴趣基因或核酸序列的染色体结构的改变。因此，在一个实例中，突变是微倒位、倒位、易位、串联重复或断点(突变)或其组合。

如本文所用，术语“倒位”是指特定序列内的核酸序列的倒位，由此该序列被切除并以与其之前的方向相反的方向插入。换句话说，由于突变，兴趣核酸序列是端到端反向的。术语“微倒位”指长度为50-1000bp(碱基对)的核酸序列。在一个实例中，突变是长度在150至250bp之间的微倒位。在一个实例中，突变是长度在200至210bp之间的微倒位。在另一个实例中，突变是长度为约206bp的微倒位。

如本文所用，术语“复发”或“再发作”是指过去病症(诸如，举例而言，医学病症)的再发。存在已知具有延长的复发期的医学病症(例如，疟疾)。在本文中，术语“复发”是指其中先前存在的医学病症(例如，特定疾病的存在)，其过去已经被治疗或不再存在于受试者中，现在已经在受试者中复发或重新出现的情形。

如本文所用，术语“难治性”是指对任何尝试的治疗形式均无应答的疾病或病症。例如，当癌症对癌症治疗无应答(或对癌症治疗有抗性)时，认为癌症是难以治疗的。难治性癌症也称为抗性癌症。

因此，在一个实例中，本文描述的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤是复发性和/或难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤。在一个实例中，自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤是复发性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤。在另一个实例中，自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤是难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤。

复发性或难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)患者对派姆单抗的应答

十一例来自新加坡、中国和香港的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者，他们对含有l-天冬酰胺酶的化疗方案是复发性的或难治性的(rr)，在中位数两个疗程(1至5个疗程之间)后纳入本研究(表1)。这十一例派姆单抗治疗的患者诊断时的中值年龄为42岁(年龄范围在27至66岁之间)，并且自用派姆单抗治疗以来的中值随访时间为十一个月(范围在2至25个月之间)。百分之六十四(64％；11例中的7例)的患者实现完全应答(cr)，而36％(11例中的4例)患者患有进行性疾病(pd)。两例患者(nktl26与nktl31)保持由派姆单抗的缓解超过两年，这被认为是复发性或难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(rrnktl)中的罕见事件。最近的派姆单抗治疗病例(nktl28)实现了持续至少6个月的缓解。对派姆单抗(对应答患者而言)应答的中值持续时间为14个月。

因此，在一个实例中，受试者先前对smile(地塞米松、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、l-天冬酰胺酶和依托泊苷)疗法没有应答。在另一个实例中，受试者先前已经对smile应答。也就是说，受试者先前对smile疗法有应答，然而，疾病已经再发或复发。在另一个实例中，受试者先前已经用以下化合物中的任何一种或多种治疗：地塞米松、甲氨蝶呤、异环磷酰胺、l-天冬酰胺酶或依托泊苷或其组合。

在自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)患者中，pd-l1阳性不能将对派姆单抗的应答分类(stratify)

为了验证自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)肿瘤中的pd-l1阳性是否能够预测对派姆单抗的应答，使用免疫组织化学(ihc)来测定所有11个预处理的nktl肿瘤中的pd-l1阳性。相同的病理学家在本研究中评估所有肿瘤中的pd-l1阳性以确保一致性(表2)。在实现完全应答和进行性疾病的患者中，肿瘤细胞中的pd-l1阳性变化很大。完全应答患者的预处理肿瘤中的pd-l1阳性范围为6％至100％，而进行性疾病患者中的pd-l1染色强度范围为35％至90％。因此，pd-l1染色强度不能区分实现完全应答的患者和患有进行性疾病的患者。有趣的是，nktl29仅有6％的肿瘤细胞对pd-l1染色呈阳性，但实现了来自派姆单抗的完全应答。除了该pd-l1低完全应答病例之外，所有四例进行性疾病病例均对pd-l1强染色，其中平均69％(范围：50％至90％)的肿瘤细胞对pd-l1染色呈阳性。这与临床试验一致，临床试验报道在具有低基线pd-l1阳性的黑素瘤和非小细胞肺癌患者中也观察到来自pd-1阻断疗法的抗肿瘤活性。相反，本文公开的方法显示一些具有低pd-l1阳性的患者可能对pd-1阻断具有良好应答。总之并且不受理论的束缚，这与本领域已知的相反，如基于本领域所示的免疫组织化学染色，较之未与之相关的那些，实现对pd-1阻断的完全应答的受试者应在其肿瘤中与更高的pd-l1阳性显著相关。

表2在11例患者的经预处理的nktl肿瘤中的膜pd-l1免疫组织化学染色等级、pd-l1h-得分和pd-l1阳性细胞，所述患者随后用派姆单抗治疗。免疫组织化学(ihc)染色等级：0，否；1+，弱；2+，中度；3+，强。cr，完全应答；pd，进行性疾病。

十一例复发性/难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)派姆单抗治疗患者的全基因组测序(wgs)及分析

为了鉴定自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)中对pd-1阻断疗法应答的基因组生物标志物，对从随后用派姆单抗治疗的十一例患者获得的肿瘤正常配对样品进行全基因组测序。将自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)肿瘤和全血或口腔拭子测序至平均深度分别为66.1x和37.5x(表3)。每个配对样品的体细胞变异调用产生平均1.15个单核苷酸变异(snv)和microindels/mb。每个样品鉴定了平均39个(范围：1至80个)体细胞非沉默蛋白编码变异，且与先前关于新鲜冷冻的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)样品(范围：41至42)的全外显子测序的报道相当。共发现10个基因发生了再发突变(图3)。其中仅有pd-l1结构重排(sr)和jak3激活突变(p.a573v)在实现完全应答的患者的初始肿瘤中再发且互斥。此外，pd-l1结构重排是在对派姆单抗实现完全应答的患者的七例初始肿瘤中的四例(57％)中鉴定的最频繁的体细胞改变(图1a)。这些pd-l1结构重排由破坏pd-l1的3’utr的染色体内易位(nktl28与nktl31)、串联复制(nktl26)和微倒位(nktl1)组成(图1b)。在派姆单抗治疗之前和治疗之后，已经实现对派姆单抗的完全应答的索引患者nktl1的示范性正电子发射断层摄影-计算机断层摄影(pet-ct)扫描证实了该患者的治疗结果(图1c)。

表3：本申请中全基因组测序数据的统计。

因此，在一个实例中，公开了治疗受试者中的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的派姆单抗，其中所述受试者的特征在于存在至少一种jak3激活体细胞突变。在另一个实例中，至少一种jak3激活突变是激活的体细胞突变。在另一个实例中，存在一种jak3激活突变。在另一个实例中，jak3激活突变是p.a573v。

因此，在一个实例中，本文提及的突变是微倒位、倒位、易位、串联重复或断点(突变)。在另一个实例中，突变是易位、串联重复(或串联复制)或微倒位。

在nktl28和nktl31中，分别地，pd-l1的外显子7易位到2q24.2，而pd-l1的内含子6易位到6p12.2(图4)。在nktl26中，串联复制的右断点位于pd-l1的3’utr内，并且左断点被验证为上游约32kbp(图4)。该复制事件产生了3’utr被破坏的拷贝和pd-l1的野生型拷贝(图5)。nktl1中最终的pd-l1结构重排由完全位于pd-l1的3’utr内的206bp微倒位组成(图4)。这些体细胞改变在派姆单抗治疗后患有进行性疾病的四例患者的初始肿瘤中不存在。

除通过本发明人的基因组管道进行序列分析外，还对自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)的已知再发突变基因进行目视检查以避免假象。在分析的队列中没有发现与抗原呈递和干扰素γ通路相关的基因中的突变，已知这些与对黑素瘤中免疫检查点阻断的抗性相关。

自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)中pd-l13’utr的调节活性

除跨越206bp并完全位于pd-l1的3’utr内的微倒位外，预测所有四个pd-l1结构重排均丧失pd-l13’utr或pd-l13’utr功能的全部或一部分。为了确定这种微倒位在调节pd-l1表达中的功能意义，将野生型和突变(具有206bp倒位)的pd-l13’utr克隆到荧光素酶报告子测定系统中并转染到淋巴瘤和白血病细胞系中，即nk-s1、k-562和jurkat(图10a)。结果表明，野生型pd-l13’utr可以有效地抑制报道蛋白的荧光素酶活性，且鉴定的微倒位可以缓解在nk-s1、k-562和jurkat细胞系中的这种抑制(p＝0.01，p＝0.01和p＝0.03，双尾t检验；图10b)。在携带pd-l13’utrsr的这四种肿瘤中观察到中至高水平(范围：20％至100％)的pd-l1阳性(表2)。不受理论的约束，认为这些结果直接解释了这些自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)肿瘤如何通过上调pd-l1表达来逃避免疫监视。

自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)中pd-l1结构重排和jak3激活突变是克隆性的

尽管对pd-l13’utr结构重排和jak3-激活突变的pd-1阻断的应答机制仍有待阐明，但研究了这些改变的克隆性是否可以支持来自派姆单抗的单药剂方案的患者的完全应答，患者在其治疗前的肿瘤中已经具有pd-l1和jak3改变。从体细胞单核苷酸变异中，有可能获得10例克隆结构的解决方案(sciclone没有针对nktl1的克隆性解决方案)。五例，四例完全应答病例和一例进行性疾病病例，具有克隆架构(表4和图6)。鉴定的体细胞pd-l1和jak3突变位于他们相应的预处理肿瘤的建立克隆中。根据这些结果，认为克隆性分析确实支持由派姆单抗治疗的单药剂方案实现完全应答的患者的应答程度。

表4：在本研究队列的预处理的肿瘤中对派姆单抗应答的基因组相关性的克隆性驻留(clonalresidency)。cr，完全应答；pd，进行性疾病。

表5：在血液恶性肿瘤中描述的pd-l1和pd-l2改变。atll，成人t细胞白血病/淋巴瘤；dlbcl，弥漫性大b细胞淋巴瘤；hl，霍奇金(hodgkin)淋巴瘤；nktl，自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤；pcnsl，原发性中枢神经系统淋巴瘤；pmbl，原发性纵隔b细胞淋巴瘤；ptl，原发性睾丸淋巴瘤；utr，非翻译区。

免疫疗法，特别是pd-1阻断疗法，已经显示出治疗包括自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的若干癌症的前景。结果表明，七例nktl患者中的四例(57％)实现对pd-1阻断完全应答，在其肿瘤中具有pd-l13’utr结构重排的克隆结构。pd-l13’utr结构重排最近也在单例卵巢癌中被鉴定，其中患者实现派姆单抗的完全应答，进一步支持其作为自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤中对pd-1阻断疗法应答的潜在生物标记物的作用。

本文还公开了确定患有自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的受试者对派姆单抗治疗的应答的方法，该方法包括从所述受试者获得样品；检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失。在另一个实例中，至少一种jak激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在指示受试者将对治疗应答。在另一个实例中，治疗是如本文所公开的化合物或治疗。在又一个实例中，治疗是派姆单抗。

如本文所用，术语“应答”还可与对治疗的易感性互换使用。术语“易感性”是指某物(例如疾病)可能受某物(例如所述疾病的治疗)影响的倾向。这种作用可以是积极的或消极的，这取决于所提及的特征或治疗。例如，如果受试者对特定治疗敏感，则所述受试者对特定治疗的易感性是积极作用。术语“易感性”可以与例如反应性或敏感性互换。

因此，在一个实例中，本文公开的方法是确定患有自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的受试者对派姆单抗治疗的易感性的方法。

所有自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤在诊断上是eber+(指示存在eb病毒)，且eb病毒(ebv)蛋白，lmp1可被认为组成型上调pd-l1。不受理论限制，推测自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤将对pd-1抑制剂应答，因为它们是先天的pd-l1+。的确，在先前的临床研究中复发性/难治性自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者对派姆单抗具有初步应答。

因此，在一个实例中，公开了治疗受试者中的自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的方法。在另一个实例中，该方法包括向受试者施用选自由以下组成的组的抑制剂：pd-1抑制剂、cd279抑制剂、pd-l1抑制剂、cd274抑制剂及其组合。在又一个实例中，向受试者施用选自由以下组成的组的抑制剂：pd-1抑制剂、cd279抑制剂、pd-l1抑制剂、cd274抑制剂及其组合。

本文还公开了本文公开的化合物或抑制剂在制备用于治疗自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的药物中的用途。

如本文所用，术语“抑制剂”是指能够抑制或阻断特定受体或一组相关受体的活性的化合物。各种化合物和药物不限于单一作用，并且因此可以被认为是相同受体的抑制剂，即使它们在结构上和/或化学上不同。也就是说，在使用多于一种抑制剂的实例中，特异性受体的抑制是这些化合物的特征。

因此，在一个实例中，如本文公开的抑制剂是导致阻断pd-1/pd-l1轴的抑制剂。在另一个实例中，抑制剂为但不限于pd-1抑制剂、cd279抑制剂、pd-l1抑制剂、cd274抑制剂及其组合。在又一个实例中，如本文公开的方法包括向受试者施用抑制剂，该抑制剂为但不限于pd-1抑制剂、cd279抑制剂、pd-l1抑制剂、cd274抑制剂及其组合。

如本文所用，术语“治疗”是指预防性抑制初始感染或疾病以及治疗性干预以改变未经治疗的感染或疾病过程(例如肿瘤生长或细菌感染)的自然进程。治疗疾病还指在疾病或病理状况已经开始发展后抑制或压制例如肿瘤生长、消除肿瘤、改善疾病或病理状况的至少一种体征或症状或干扰病理生理学过程的疗法干预。

在一个实例中，向受试者施用的治疗或化合物是阻碍pd-1/pd-l1轴的化合物。换言之，这些化合物靶向对受试者对治疗的应答有影响的免疫检查点。在一个实例中，这些靶标免疫检查点是共抑制性免疫检查点分子。在另一个实例中，这些共抑制性免疫检查点分子为但不限于ctla-4、cd80/cd86、pd1、pd-l1/pd-l2、cd80、pd-l1、btla、hvem、tim3和gal9。在另一个实例中，待施用至受试者的治疗或化合物是pd1/pd-l1阻断疗法。在又一个实例中，pd1/pd-l1阻断疗法是pd-1阻断疗法。

因此，在一个实例中，向受试者施用的治疗或化合物是阻碍pd-1/pd-l1轴的化合物。在另一个实例中，向受试者施用的治疗或化合物是靶向pd-1的化合物。这些化合物可以为但不限于纳武单抗(nivolumab)(opdivo)、派姆单抗(keytruda)、阿特朱单抗(atezolizumab)(tecentriq)、阿维鲁单抗(avelumab)(bavencio)、度伐单抗(durvalumab)(imfinzi)、匹迪珠单抗(pidilizumab)(curetech)、amp-224(glaxosmithkline)、amp-514(glaxosmithklin)、pdr001(norvartis)、西米普利单抗(cemiplimab)(regeneron和sanofi)及其组合。在一个实例中，待施用的化合物是派姆单抗(keytruda)与本文公开的任何其他化合物的组合。在另一个实例中，所述化合物是派姆单抗(keytruda)。

随后，十一例患者中有四例已进展并死于疾病。在这些进行性病例中并没有发现pd-l1和jak3基因的改变。不受理论的约束，认为该初始“伪缓解”可归因于外源因素，诸如爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)上调pd-l1，pd-l1被初始剂量的派姆单抗瞬时阻断。因此，肿瘤中的高pd-l1阳性不一定等同于对pd-1阻断的良好应答。此外，在该队列内，pd-l1免疫组织化学得分也有很大变化(6％，2+至100％，3+)，并且受试者nktl25和nktl27均患进行性疾病，尽管他们的预处理肿瘤具有高pd-l1染色等级，导致出现单独使用pd-l1阳性作为对自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤中pd-1阻断应答的生物标记物的有效性的问题。在pd-l2基因内没有鉴定到重排，并且pd-l1总是作为关于结构重排的5’重排配偶体。这与其他血液恶性肿瘤不同，在其他血液恶性肿瘤中，pd-l1和/或pd-l2的过表达是通过如基因组扩增、jak2或pd-l2易位等不同机制实现的(表5)，表明不同的肿瘤已经进化出免疫逃逸的替代机制。

为了测定pd-l1和jak3改变的患病率，对32种配对更多的肿瘤-正常自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)肿瘤和相应的外周血淋巴细胞进行全基因组测序(wgs)，其临床病理学信息列于表6中。通过将测序数据映射到ebv基因组来验证在这些样品的相应外周血中不存在恶性细胞，因为已知致病病毒存在于瘤性细胞中。与11例派姆单抗治疗患者的队列类似，在该32个nktl样品的扩展队列中，没有后续派姆单抗治疗；还发现pd-l1是队列中最再发改变的基因(图7a)。在结构重排方面，pd-l1也显着地表现为重排最多的基因(图7b)。在这些自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl肿瘤)中对pd-l1的改变形式涉及pd-l1的基因组区域内的结构断点簇，其在25％的病例(32例中的8例)中存在(图7c)。使用sanger测序验证在pd-l1基因座内发现的所有结构重排(图8)。生物信息学分析还重新鉴定了诸如tp53、ddx3x、stat3、fat4和jak3的基因中的再发性非沉默短变异(6.3％，32例中的2例)，表明与先前研究队列相似的病理。

表6：患者的临床病理信息

在携带pd-l13’utr结构重排(sr)的肿瘤中确定异常转录物的存在。对于每个pd-l1sr，利用可用的全转录组测序(wts)数据，有可能通过sanger测序鉴定和验证pd-l1嵌合转录物(图9)。

本文还公开了用于实施本文所述方法的试剂盒。因此，在一个实例中，公开了用于检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失的试剂盒，该试剂盒包含检测剂和至少一对引物。在另一个实例中，公开了用于检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失的试剂盒，该试剂盒包含检测剂和至少一对引物；其中该引物针对jak3和pd-l1基因的基因组区域富集。

在一个实例中，该至少一对引物为但不限于本说明书的表8和表9中所列的引物对。在另一个实例中，该引物对为但不限于seqidno：1和2、seqidno：3和4、seqidno：5和6、seqidno：7和8、seqidno：9和10、seqidno：11和12、seqidno：13和14、seqidno：15和16、seqidno：17和18、seqidno：19和20、seqidno：21和22、seqidno：23和24、seqidno：25和26、seqidno：27和28、seqidno：29和30、seqidno：31和32、seqidno：33和34、seqidno：35和36、seqidno：37和38、seqidno：39和40、seqidno：41和42、seqidno：43和44、seqidno：45和46，以及seqidno：47和48。在另一个实例中，公开了用于下一代测序的检测至少一种jak3激活突变或至少一种pd-l1结构重排的存在或缺失的试剂盒。在又一个实例中，本文公开的试剂盒用于根据本文公开的方法。

总之，在43例自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)样品的全队列中(11个样品随后用派姆单抗治疗，而32个样品未用派姆单抗治疗)，显示结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤中频繁(27.9％，43例中的12例)的体细胞pd-l13’utr结构重排可以解释一些结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤如何逃避免疫监视，从而为使用pd-1抑制剂更好地治疗这些患者提供了基础。

所描述的完全应答病例中再发性jak3-激活突变的存在也与显示具有jak3-激活突变的单一肺癌患者中pd-1阻断的长期益处的报道一致。

利用全基因组测序数据显示，自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤的基因组特征与pd-1阻断疗法的应答相关，并表明通过基因组筛选可以更好地选择pd-1阻断疗法。

本文说明性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广义而非限制性地理解。另外，本文使用的术语和表达已经用作描述而非限制的术语，并且使用这些术语和表达并非意图排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应认识到，在所要求保护的本发明的保护范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对在此公开的本发明实施例进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在本发明的保护范围内。

如在本申请中所使用的，单数形式“一种(a、an)”和“所述(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。例如，术语“遗传标记物”包括多种遗传标记物，包括其混合物和组合。

如本文所用，在制剂组分浓度的上下文中，术语“约”通常是指所述值的+/-5％、更通常是指所述值的+/-4％、更通常是指所述值的+/-3％、更通常是指所述值的+/-2％、甚至更通常是指所述值的+/-1％，并且甚至更典型地为所述值的+/-0.5％。

贯穿本公开，某些实施方案可以范围形式公开。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对所公开的范围的刻板限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5、6。这与范围的宽度无关。

在此还可以广泛地和一般性地描述某些实施方案。属于一般公开内容的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本公开内容的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题名称的附带条件或否定限制的实施方案的一般性描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。

本文已经广泛地和一般性地描述了本发明。属于一般公开内容的较窄种类和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括具有从该类中去除任何主题名称的附带条件或否定限制的本发明的一般性描述，而不管所删除的材料是否在本文中具体叙述。

其他实施方案在所附权利要求书和非限制性实施例内。此外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此在本发明中也以马库什组的任何单个成员或成员的子组进行了描述。

实验部分

以下实施例说明可实践本发明的方面的方法或可制备适于实践本发明的某些实施方案的材料。

实施例1-材料和方法

患者和方法

用派姆单抗治疗十一例复发性或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者。用recist标准通过放射扫描评估应答。使用全基因组测序(wgs)对十一例患者的所有预派姆单抗肿瘤和匹配正常进行分子分析。

研究设计

对于复发性或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，研究队列由来自新加坡、中国和香港的11例复发或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者组成，这些患者基于l-天冬酰胺酶的化疗方案均无效。从之前的研究包括以前未测序的nktl1、nktl25、nktl26、nktl43、nktl44和nktl45。根据2008年世界卫生组织的分类，患者被诊断出患有自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，具有细胞毒性、cd3ε+和eber+表型。收集了43例结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者的初始肿瘤和血/口腔拭子样品，其中11例基于l-天冬酰胺酶的化疗方案失败的患者随后用派姆单抗治疗。使用pet/ct或ct/mri或ebvpcr的组合进行应答评估。全基因组测序用于对所有预派姆单抗肿瘤和匹配的正常对进行分子分析。从开始派姆单抗的日期到进行性或死亡的日期计算应答持续时间(dor)。使用kaplan-meier方法估计中值dor。来自singhealth(2004/407/f)、新加坡国立大学(nus-irb-10-250)和中山大学肿瘤防治中心(yb2015-015-01)的机构审查委员会批准了该研究。本研究中的所有受试者均提供书面知情同意。本研究也遵守《赫尔辛基宣言》。

对于结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，本研究中的所有受试者均提供书面知情同意。根据2008年世界卫生组织分类，诊断出结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，具有细胞毒性、cd3ε+和eber+表型³。来自singhealth(2004/407/f)、新加坡国立大学(nus-irb-10-250)和中山大学肿瘤防治中心(yb2015-015-01)的机构审查委员会批准了该研究。收集40例结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤患者的初始肿瘤和血液样品，其中六例在进展到复发或难治性(rr)状态后也用派姆单抗治疗。该派姆单抗治疗的患者中的四例患者来自新加坡，其余两例患者来自中国。使用体征(例如外周血ebv负荷和pet或ct扫描)的组合来确定派姆单抗治疗患者的临床应答。在这六例患者中，针对一例患者，可获得新鲜冷冻的肿瘤，针对五例患者可获得福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织。对所有40个肿瘤-血液样品产生wgs数据。测序和比对统计可见于表7。

表7：测序和比对统计

基因组dna提取

如前所述，从速冻和福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)肿瘤组织和全血提取基因组dna。根据制造商的说明书使用e.z.n.a组织dna试剂盒(omegabio-tek)来纯化口腔拭子基因组dna。如别处所述评估质量和数量。

nk细胞分离和激活

以静息和激活的nk细胞为基线，比较肿瘤样品中pd-l1的相对表达。使用从新加坡的健康科学机构获得的人单采血液成分术锥形血(coneblood)进行nk细胞分离。通过使用ficoll-paqueplus(gehealthcare)以400×g密度离心30分钟获得外周血单核细胞。根据制造商的方案，使用easysep人nk细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)分离nk细胞。由流式细胞术通过cd3-和cd56+的表达确定nk细胞的纯度大于90％。

将分离的细胞悬浮于含或不含200u/mlil-2(proleukin)的x-vivo15培养基(lonza)中，该培养基补充有5％热灭活人血清(innovabiosciences)。将1×10⁶个细胞接种在48-孔板上，48小时后通过流式细胞术以cd25-fitc(克隆：m-a251；bdbiosciences)和cd69-bv421(克隆：fn50；biolegend)的上调确定nk细胞的激活。

使用从新加坡的健康科学机构获得的人单采血液成分术锥形血进行nk细胞分离。通过使用ficoll-paqueplus(gehealthcare)以400×g密度离心30分钟获得外周血单核细胞。通过以120×g缓慢离心10分钟来除去血小板。根据制造商的方案，使用easysep人nk细胞分离试剂盒(stemcelltechnologies)分离nk细胞，起始细胞浓度为1×10⁸细胞/ml。

将分离的nk细胞用live/deadaqua活性染料(thermofisherscientific)染色，然后用对cd3-v500(克隆：ucht1；bdbiosciences)特异性的单克隆抗体和对cd56-pecy7(克隆：b159；bdbiosciences)特异性的单克隆抗体进行表面染色以测定分离效率。由流式细胞术通过cd3-cd56+的表达确定nk细胞的纯度大于90％。

将分离的细胞重悬浮于含或不含200u/mlil-2(proleukin)的x-vivo15培养基(lonza)中，该培养基补充有5％热灭活人血清(innovabiosciences)。将1×10⁶个细胞接种在48-孔板上，48小时后通过流式细胞术以cd25-fitc(克隆：m-a251；bdbiosciences)和cd69-bv421(克隆：fn50；biolegend)的上调确定nk细胞的激活。

全基因组测序

所有测序文库均使用truseq纳米dna文库制备试剂盒(illumina)制备。在hiseq2000或hiseqxten系统(illumina)上进行配对末端测序，分别为2×101bp或2×151bp。由于来自ffpe材料的基因组dna的高片段化，在ffpe肿瘤样品的文库制备之前进行尺寸选择步骤。将来自ffpe样品的约200bp的可扩增dna片段用于测序文库构建，以避免在pd-l1基因内针对sr的发现中确信的假阴性。

或者，对于结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤而言，对本研究中描述的所有40对肿瘤-正常样品进行全基因组测序(wgs)。所有测序文库均使用truseq纳米dna文库制备试剂盒(truseqnanodnalibraryprepkit)(illumina)制备。由于ffpe材料中的基因组dna的高片段化，在ffpe肿瘤样品的文库制备之前进行尺寸选择步骤。在hiseq2000或hiseqxten系统(illumina)上进行配对末端测序，分别为2×101bp或2×151bp。肿瘤和正常的平均wgs数据覆盖度分别为68.9x和42.2x。

全转录组测序

如前所述进行rna提取以及质量和数量评估。使用具有ribo-zero的truseqstrandedtotalrna文库制备试剂盒(truseqstrandedtotalrnalibraryprepkit)(illumina)制备测序文库，并且在hiseq2500、hiseq3000或hiseqxten系统(illumina)上分别以2×101bp、2×151bp或2×151bp读段长度进行全转录组测序(wts)。

rna转录物的定量和归一化

使用star以2次通过模式将rna读段与hs37d5和ebv-1的组合参考进行比对。用deseq2将基因计数归一化，并使用双尾分析秩和检验来计算差异表达的显著性。统计显著性被认为是p<0.05。

cdna合成和实时

使用superscriptiii逆转录酶(invitrogen)对具有可用rna的样品进行逆转录。

全基因组和全转录组测序

针对结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，为从结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤样本产生wgs数据用于本研究，如先前描述，提取来自速冻和ffpe肿瘤组织和全血的基因组dna。根据制造商的说明书使用e.z.n.a组织dna试剂盒(omegabio-tek)来纯化口腔拭子基因组dna。如别处所述评估质量和数量。对所有肿瘤和本研究中描述的全血或口腔拭子样品进行全基因组测序。所有测序文库均使用truseq纳米dna文库制备试剂盒(illumina)制备。在文库制备前对ffpe肿瘤样品进行大小选择步骤。如前所述进行rna提取以及质量和数量评估²²。使用具有ribo-zero的truseqstrandedtotalrna文库制备试剂盒(illumina)制备测序文库。

体细胞变异的检测和过滤

使用bwa-mem将测序读段与hs37d5人参考基因组比对。使用strelka2和muse检测体细胞短变异。随后通过wannovar注释短变异。

结构重排的基因组分析

在所有下游分析之前，使用bwa-mem将gdna测序读段与hs37d5人参考基因组比对，并通过sambamba标记pcr重复(duplicates)。为了鉴定体细胞结构重排(sr)，对肿瘤-血液配对样品的比对gdna读段应用manta。用sanger测序验证了pd-l1基因区内所有预测的sr。为了确定从gdna测序数据预测的sr是否产生转录产物，使用用于基于pcr的验证和sanger测序的superscriptiii逆转录酶(invitrogen)从可用的相应rna获得cdna。

结构变异的检测和过滤

使用bwa-mem将dna读段与hs37d5人参考基因组进行比对，通过sambamba除去pcr重复。如果读段对没有以预期取向和/或在预期的插入物大小内比对至参考基因组，则它们被标记为不一致。当读段的任一端都与参考基因组不匹配时，读段被标记为剪切。

manta对体细胞结构重排(sr)进行检测，并且对每个候选sr遵循以下过滤标准：1)sr由至少3个不一致的读段对和至少3个软剪切读段支持，并且所有支持读段的总和为至少10；2)匹配正常样品中存在的零不一致和软剪切读段；3)在两个肿瘤和匹配正常样品中至少20x覆盖度；4)sr大小至少为1000bp。

用1mbp的平均滑动窗口，以100kbp的步长，沿着hs37d5的主染色体制表了在基因组区域内具有sr的独特样品的直方图，即sr景观(landscape)。将假定的sr的断点转换为bedpe格式，并与sr景观一起使用circos可视化为链接。

体细胞变异的检测

使用freebayes⁶(–x–u–c5–m30–q20)分析wgs数据，并过滤出得分小于30的变异。只有当从肿瘤调用单核苷酸变异而不是匹配正常数据时，才预测单核苷酸变异是体细胞的。

体细胞单核苷酸变异和插入缺失的检测

wgs数据中的体细胞单核苷酸变异和插入缺失使用freebayes调用。滤除得分小于30的候选变异。只有当从肿瘤中调用变异而不是从匹配正常数据中调用时，才预测变异是体细胞的。

肿瘤克隆性分析

使用sciclone分析肿瘤的克隆性架构。canvas用于分析每个肿瘤的拷贝数和杂合信息的丧失，用作sciclone的克隆性分析的输入。

pcr和sanger测序

针对对于复发性或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，先前描述了关于pcr条件和测序的细节。使用primer3软件设计引物，针对11例派姆单抗治疗的nktl患者的发现队列的序列列于表6中。将sanger序列与hs37参考基因组进行比对并用blat证实。可选地，针对随后未用派姆单抗治疗的32例nktl患者的患病率队列的引物序列也列于表7中。

表8：用于验证在随后用派姆单抗治疗的患者的发现队列中的pd-l1结构重排和jak3激活的引物对。

表9：用于验证随后未用派姆单抗治疗的患者的患病率队列中的pd-l1结构重排的引物对。

组织学研究和得分

针对对于复发性或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，用抗pd-l1兔单克隆抗体(sp263，ventana)进行pd-l1ihc分析。将pd-l1阳性评价为细胞膜上阳性染色的肿瘤细胞的百分比。或者，针对结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，将pd-l1表达评价为在细胞膜处的染色并基于阳性肿瘤细胞的百分比和染色强度进行评分。使用以下分级：0，无染色，1+，弱染色，2+中等染色和3+强染色。同一病理学家评估了所有pd-l1ihc染色。本研究中使用的样品的可用h-得分列在表10中。

表10：样品的可用h-得分。

^a通过免疫组织化学评估。

^b在kwong等，血液(blood)2017中报道的临床应答。

细胞系和构建体

k-562和jurkat细胞系购自atcc，而nk-s1内部产生。lgc标准认证了k-562和jurkat细胞系。将jurkat细胞维持在补充有10％fbs(hyclone)的rpmi1640(gibco)中，并使k-562和nk-s1在补充有10％fbs(hyclone)、10％马血清(gibco)和2mml-谷氨酰胺(gibco)的dmem(gibco)中生长。细胞在37℃、5％co2存在下生长，并使用mycoalert支原体检测试剂盒(lonza)常规检查支原体污染。

对于结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，使用来自atcc的k-562和jurkat细胞系以及内部nk-s1细胞系以研究队列调研在pd-l1的3’utr内发现的最小结构重排的调节作用。

将来自snk6细胞系的野生型pd-l13’utr(enst00000381573.8)克隆到psicheck-2载体(promega)的xhoi和noti位点。针对概述样品nktl1中鉴定的重排的部分倒位3’utr，从野生型样品(snk6)扩增具有突出端的三个单独的片并通过pcr连接在一起。使用q5高保真度2x主混合物(q5high-fidelity2xmastermix)(newenglandbiolabs)进行克隆。用于克隆全长野生型和突变pd-l13’utr的所有克隆引物在表11中描述。

表11：用于克隆具有和不具有206bp长度的微倒位的pd-l1的全长3’utr的克隆引物。

转染和荧光素酶测定

对于复发性或难治性(rr)自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，对于k-562和jurkat，分别将5×10⁴细胞和6×10⁴细胞一式三份接种在48孔板上，并使用脂质体3000试剂(lipofectamine3000reagent)(invitrogen)以250ng质粒dna进行转染。对于nk-s1细胞，使用neon转染系统(invitrogen)在24孔板上用1μg质粒dna一式三份电穿孔2×10⁵个细胞。使用的脉冲参数如下：电压1300，宽度10，3号。可替换地，对于结外自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤，对于k-562细胞，将2.5×10⁵个细胞一式三份接种在48孔板上，并使用脂质体3000试剂(lipofectamine3000reagent)(invitrogen)以250ng质粒dna进行转染。对于nk-s1和jurkat细胞，使用neon转染系统(invitrogen)在24孔板上以1μg质粒dna一式三份电穿孔2.5×10⁵细胞。

48小时后用被动裂解缓冲液(promega)裂解细胞。使用双荧光素酶报告子测定系统(promega)和glomax-multi+检测系统(promega)测量发光。将海肾(renilla)荧光素酶活性除以萤火虫荧光素酶活性，并将结果归一化至空载体对照(模拟)。通过双侧t检验计算统计显著性。统计显著性为p<0.05。所有实验重复至少两次。

数据可用性

将43例自然杀伤细胞/t细胞淋巴瘤(nktl)-正常/血液对的wgs数据和28例nktl的全转录测序(wts)数据保存在欧洲基因组档案(ega)中，研究登记号为：egas00001002420。

表12：附加序列

*表示断点

序列表

<110>新加坡保健服务集团有限公司

<120>治疗淋巴瘤的方法

<130>32644sg46

<160>78

<170>patentin第3.5版

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl1-倒位正向引物

<400>1

acataaatactgtcccgttcca22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl1-倒位反向引物

<400>2

gaggctccttgttcagaagt20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl1-倒位正向引物

<400>3

tgtcacaggcgtcgatgag19

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl1-倒位反向引物

<400>4

caaccacactcacatgacaaga22

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl26-复制正向引物

<400>5

cagatacacatttggaggagacg23

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl26-复制反向引物

<400>6

ctttggccctgtttgtgtcc20

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl28-易位正向引物

<400>7

attcaagtttcctttccagaagca24

<210>8

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl28-易位反向引物

<400>8

aagacttttggttggtattttctgt25

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl31-易位正向引物

<400>9

ccatgcacggtatctcatttaat23

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl31-易位反向引物

<400>10

tcagtatctcatcccacctgac22

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl29-jak3-错义正向引物

<400>11

ggggctctcactgtctcca19

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl29-jak3-错义反向引物

<400>12

aagaaacccacgcatcttctct22

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl30-jak3-错义正向引物

<400>13

ggggctctcactgtctcca19

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl30-jak3-错义反向引物

<400>14

aagaaacccacgcatcttctct22

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl27-arid1b-插入正向引物

<400>15

catgtgctgtgactgcttgt20

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl27-arid1b-插入反向引物

<400>16

cctcttcctacagtactcccc21

<210>17

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl4-删除正向引物

<400>17

caagtttcattctgtggccca21

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl4-删除反向引物

<400>18

ttgggtcaaagcggaatgtg20

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6-复合正向引物

<400>19

cagatacacatttggaggagacg23

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6-复合反向引物

<400>20

atggatagggctgcaggtga20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl11-复制正向引物

<400>21

gctcatcctaggaagacggg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl11-复制反向引物

<400>22

aactggagtcgaaggtcaca20

<210>23

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl15-复制正向引物

<400>23

gagaaaacagagggtcaagaagat24

<210>24

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl15-复制反向引物

<400>24

gaaaccaaaagcaagcaggagtag24

<210>25

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl16-易位正向引物

<400>25

tccctgacaattctaaatcgagt23

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl16-易位反向引物

<400>26

acccgacttaacctctgcaa20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl17-删除正向引物

<400>27

gcccgtcattttcagttgca20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl17-删除反向引物

<400>28

caggagaatggcgtgaactc20

<210>29

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl35-删除正向引物

<400>29

ccagaccacttcccatgaaattaa24

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl35-删除反向引物

<400>30

tactcatacatttggcctcagttg24

<210>31

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位正向引物

<400>31

tataccaagagatccagtgatggt24

<210>32

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位反向引物

<400>32

aatcatgtttcagtaccattggct24

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位正向引物

<400>33

ctactctccagcccatctattgag24

<210>34

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位反向引物

<400>34

atctattgagggctgatctggg22

<210>35

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl4-删除正向引物

<400>35

acttggtaattctgggagcca21

<210>36

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl4-删除反向引物

<400>36

ccaccttctgaacagtgacc20

<210>37

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6-复合正向引物

<400>37

acttggtaattctgggagcca21

<210>38

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6-复合反向引物

<400>38

ggccagctgaggtctttatt20

<210>39

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl15-复制正向引物

<400>39

caacacaacaactaatgagattttctactg30

<210>40

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl15-复制反向引物

<400>40

cctcccatgacatctctcctcttatg26

<210>41

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl16-易位正向引物

<400>41

aatgaaaggactcacttggtaattct26

<210>42

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl16-易位反向引物

<400>42

gttttgcagctagaattcagttgtaa26

<210>43

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl17-删除正向引物

<400>43

cctccaaatgaaaggactcact22

<210>44

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl17-删除反向引物

<400>44

gcaggtttggcaattctgattc22

<210>45

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl35-删除正向引物

<400>45

cagcattggaacttctgatcttca24

<210>46

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl35-删除反向引物

<400>46

ggcctcagttgtcacagtatttt23

<210>47

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位正向引物

<400>47

tgaaaggactcacttggtaattctg25

<210>48

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl37-倒位反向引物

<400>48

aggtataataatgctgcctgagat24

<210>49

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_xhoi_f引物

<400>49

cgtagtctcgagtccagcattggaacttctga32

<210>50

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_noti_r引物

<400>50

caattagcggccgcaactttctccactgggatgt34

<210>51

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_f引物

<400>51

tccagcattggaacttctgatcttcaag28

<210>52

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-a-r引物

<400>52

tgactgagagtctcaaggtctccctccaggctccc35

<210>53

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>倒位-悬垂-f引物

<400>53

cctggagggagaccttgagactctcagtcatgcag35

<210>54

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>倒位-悬垂-r引物

<400>54

gtcccgttccaacactgatactttcaaatgcctga35

<210>55

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-c-f和f2引物

<400>55

catttgaaagtatcagtgttggaacgggacagtat35

<210>56

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_r引物

<400>56

aactttctccactgggatgttaaactg27

<210>57

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_f引物

<400>57

tccagcattggaacttctgatcttcaag28

<210>58

<211>35

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>倒位-悬垂-r引物

<400>58

gtcccgttccaacactgatactttcaaatgcctga35

<210>59

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_xhoi_f引物

<400>59

cgtagtctcgagtccagcattggaacttctga32

<210>60

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>cd274-3utr_noti_r引物

<400>60

caattagcggccgcaactttctccactgggatgt34

<210>61

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl1验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(17)..(18)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>61

ggcatttgaaagtatcagtgttggaacgggacag34

<210>62

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl11验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>62

tgtcatgtgagtgtggttgtgaacagttcctgaactctga40

<210>63

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl15验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>63

taagaagaaagttatattataatatagtttgcttttacaa40

<210>64

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6(复杂病例)1验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>64

agcgtgacaagaggaaggaatgtgccaccatgcccagcta40

<210>65

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl6(复杂病例)2验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>65

cgtattggccaggatagtctagaaaattttgctaaagcag40

<210>66

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl4验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>66

tgtgttgtaaagctaagtagctcaggtactttgctatccc40

<210>67

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl17验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>67

catttaagatgagtcagagttttttgagacggagtctcgc40

<210>68

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl16验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>68

caggagaatgggtatggatgagaacacatacttcctctcc40

<210>69

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl26验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(21)..(22)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>69

ctgatcttcaagcaggggattgatgtgctttgttaaacaga41

<210>70

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl28验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>70

atgttaaaagcacgtattttgaataaaatgttactttgtc40

<210>71

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nktl31验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>71

ctccctccctttctctctctctctctctctttggtaatgg40

<210>72

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fln375验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>72

cgtgggatgcaggcaatgtggaatataacaaataaagcaa40

<210>73

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fln377验证的sanger序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(20)..(21)

<223>参考残基之间的断点突变

<400>73

aatatggaaggggattccaaatctgaagggacctcagggg40

<210>74

<211>3375

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>jak3cdna野生型

<400>74

atggcacctccaagtgaagagacgcccctgatccctcagcgttcatgcagcctcttgtcc60

acggaggctggtgccctgcatgtgctgctgcccgctcggggccccgggcccccccagcgc120

ctatctttctcctttggggaccacttggctgaggacctgtgcgtgcaggctgccaaggcc180

agcggcatcctgcctgtgtaccactccctctttgctctggccacggaggacctgtcctgc240

tggttccccccgagccacatcttctccgtggaggatgccagcacccaagtcctgctgtac300

aggattcgcttttacttccccaattggtttgggctggagaagtgccaccgcttcgggcta360

cgcaaggatttggccagtgctatccttgacctgccagtcctggagcacctctttgcccag420

caccgcagtgacctggtgagtgggcgcctccccgtgggcctcagtctcaaggagcagggt480

gagtgtctcagcctggccgtgttggacctggcccggatggcgcgagagcaggcccagcgg540

ccgggagagctgctgaagactgtcagctacaaggcctgcctacccccaagcctgcgcgac600

ctgatccagggcctgagcttcgtgacgcggaggcgtattcggaggacggtgcgcagagcc660

ctgcgccgcgtggccgcctgccaggcagaccggcactcgctcatggccaagtacatcatg720

gacctggagcggctggatccagccggggccgccgagaccttccacgtgggcctccctggg780

gcccttggtggccacgacgggctggggctgctccgcgtggctggtgacggcggcatcgcc840

tggacccagggagaacaggaggtcctccagcccttctgcgactttccagaaatcgtagac900

attagcatcaagcaggccccgcgcgttggcccggccggagagcaccgcctggtcactgtt960

accaggacagacaaccagattttagaggccgagttcccagggctgcccgaggctctgtcg1020

ttcgtggcgctcgtggacggctacttccggctgaccacggactcccagcacttcttctgc1080

aaggaggtggcaccgccgaggctgctggaggaagtggccgagcagtgccacggccccatc1140

actctggactttgccatcaacaagctcaagactgggggctcacgtcctggctcctatgtt1200

ctccgccgcagcccccaggactttgacagcttcctcctcactgtctgtgtccagaacccc1260

cttggtcctgattataagggctgcctcatccggcgcagccccacaggaaccttccttctg1320

gttggcctcagccgaccccacagcagtcttcgagagctcctggcaacctgctgggatggg1380

gggctgcacgtagatggggtggcagtgaccctcacttcctgctgtatccccagacccaaa1440

gaaaagtccaacctgatcgtggtccagagaggtcacagcccacccacatcatccttggtt1500

cagccccaatcccaataccagctgagtcagatgacatttcacaagatccctgctgacagc1560

ctggagtggcatgagaacctgggccatgggtccttcaccaagatttaccggggctgtcgc1620

catgaggtggtggatggggaggcccgaaagacagaggtgctgctgaaggtcatggatgcc1680

aagcacaagaactgcatggagtcattcctggaagcagcgagcttgatgagccaagtgtcg1740

taccggcatctcgtgctgctccacggcgtgtgcatggctggagacagcaccatggtgcag1800

gaatttgtacacctgggggccatagacatgtatctgcgaaaacgtggccacctggtgcca1860

gccagctggaagctgcaggtggtcaaacagctggcctacgccctcaactatctggaggac1920

aaaggcctgccccatggcaatgtctctgcccggaaggtgctcctggctcgggagggggct1980

gatgggagcccgcccttcatcaagctgagtgaccctggggtcagccccgctgtgttaagc2040

ctggagatgctcaccgacaggatcccctgggtggcccccgagtgtctccgggaggcgcag2100

acacttagcttggaagctgacaagtggggcttcggcgccacggtctgggaagtgtttagt2160

ggcgtcaccatgcccatcagtgccctggatcctgctaagaaactccaattttatgaggac2220

cggcagcagctgccggcccccaagtggacagagctggccctgctgattcaacagtgcatg2280

gcctatgagccggtccagaggccctccttccgagccgtcattcgtgacctcaatagcctc2340

atctcttcagactatgagctcctctcagaccccacacctggtgccctggcacctcgtgat2400

gggctgtggaatggtgcccagctctatgcctgccaagaccccacgatcttcgaggagaga2460

cacctcaagtacatctcacagctgggcaagggcaactttggcagcgtggagctgtgccgc2520

tatgacccgctaggcgacaatacaggtgccctggtggccgtgaaacagctgcagcacagc2580

gggccagaccagcagagggactttcagcgggagattcagatcctcaaagcactgcacagt2640

gatttcattgtcaagtatcgtggtgtcagctatggcccgggccgccagagcctgcggctg2700

gtcatggagtacctgcccagcggctgcttgcgcgacttcctgcagcggcaccgcgcgcgc2760

ctcgatgccagccgcctccttctctattcctcgcagatctgcaagggcatggagtacctg2820

ggctcccgccgctgcgtgcaccgcgacctggccgcccgaaacatcctcgtggagagcgag2880

gcacacgtcaagatcgctgacttcggcctagctaagctgctgccgcttgacaaagactac2940

tacgtggtccgcgagccaggccagagccccattttctggtatgcccccgaatccctctcg3000

gacaacatcttctctcgccagtcagacgtctggagcttcggggtcgtcctgtacgagctc3060

ttcacctactgcgacaaaagctgcagcccctcggccgagttcctgcggatgatgggatgt3120

gagcgggatgtccccgccctctgccgcctcttggaactgctggaggagggccagaggctg3180

ccggcgcctcctgcctgccctgctgaggttcacgagctcatgaagctgtgctgggcccct3240

agcccacaggaccggccatcattcagcgccctgggcccccagctggacatgctgtggagc3300

ggaagccgggggtgtgagactcatgccttcactgctcacccagagggcaaacaccactcc3360

ctgtccttttcatag3375

<210>75

<211>3375

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>jak3cdna单突变1

<400>75