肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的治疗的制作方法

相关申请的交叉引用本申请要求2017年10月16日提交的标题为“肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗”的临时专利申请号62/572,702的权益，其内容通过引用整体并入本文。参考序列表本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为“20571047pctsl.txt”的文件提供，其创建于2018年10月16日并且大小为93,286个字节。序列表的电子形式的信息通过引用整体并入本文。发明领域本发明涉及多核苷酸的组合物，设计、制备、制造和/或配制该多核苷酸的方法和工艺，该多核苷酸包括aav载体、小干扰rna(sirna)双链体、shrna、微rna或其前体，其靶向超氧化物歧化酶1(sod1)基因或编码靶向超氧化物歧化酶1(sod1)基因的分子，以干扰sod1基因表达和/或sod1酶生产。在一些实施方案中，多核苷酸被插入到重组腺相关病毒(aav)载体中。还公开了在患有神经退行性疾病的受试者中抑制sod1基因表达的方法。该方法任选地将至少一种多核苷酸引入患有所述神经退行性疾病的受试者中。特别地，该疾病是肌萎缩性侧索硬化症(als)。发明背景肌萎缩性侧索硬化症(als)，也称为lougehrig病，是一种致命的进行性神经退行性疾病，其特征是主要运动皮层、脑干和脊髓中运动神经元(mn)的大量丧失。运动神经元的丧失破坏基本的基础运动，例如呼吸，并且通常会导致患者在诊断后2至5年内死亡。患者中运动功能的逐渐恶化严重破坏他们的呼吸能力，需要某种形式的呼吸辅助来使患者存活。其他症状还包括手、臂、腿或吞咽肌肉的肌无力。一些患者(例如ftd-als)也可能发展额颞叶痴呆。根据als协会，美国每年约有5,600人被诊断出患有als。als的发病率是每10万人2例，并且据估计，在任何给定时间，多达30,000名美国人可能患有该病。已经描述了两种形式的als：一种是偶发性als(sals)，其是美国最常见的als形式，占诊断出的所有病例的90％至95％。另一个是家族性als(fals)，其主要发生在家族谱系中，具有显性遗传，并且仅占美国所有病例的约5％至10％。sals和fals在临床上无法区分。病理研究表明，在疾病发作后发生某些细胞过程，包括内质网应激增加、自由基(即活性氧物质(ros))生成、线粒体功能障碍、蛋白质聚集、细胞凋亡、炎症和谷氨酸兴奋性中毒，特别是在运动神经元(mn)中。als的病因复杂且多样。通常，als被认为是一种复杂的遗传疾病，其中多个基因与环境暴露的结合使人易感。已发现与als相关的超过十几种基因，包括sod-1(cu2+/zn2+超氧化物歧化酶)、tdp-43(tardbp，tardna结合蛋白-43)、fus(融合于肉瘤/在肉瘤中易位)、ang(血管生成素)、atxn2(ataxin-2)、含缬酪肽的蛋白(vcp)、optn(optineurin)和在9号染色体开放阅读框72(c9orf72)中的非编码ggggcc六核苷酸重复序列的扩增。但是，运动神经元退化的确切机制仍然难以捉摸。目前，没有针对als的治愈性疗法。唯一被fda批准的药物是利鲁唑，其拮抗谷氨酸反应，以减少als的病理发展。然而，仅报道了早期阶段的als患者大约有三个月的寿命延长，而在晚期阶段的als患者中未观察到治疗益处，这表明患者缺乏治疗选择(bensimong等人，jneurol.2002年，249，609-615)。因此，仍然需要能够有效预防该疾病进展的新治疗策略。i型cu2+/zn2+超氧化物歧化酶(sod1)基因的突变是fals的最常见原因，占所有fals病例的约20％至30％。最近的报道表明，在所有sals病例中也有约4％可能与sod1突变相关联(robberecht和philip，nat.rev.neurosci.,2013，14，248-264)。与sod1关联的fals十分可能不是由正常sod1活性的丧失引起，而是由毒性功能的获得引起。与突变sod1关联的fals毒性的假说之一提出，异常的sod1酶导致小分子，例如过氧亚硝酸盐或过氧化氢产生破坏性自由基。突变sod1神经毒性的其他假说包括蛋白酶体活性的抑制、线粒体损伤、rna加工的破坏和细胞内聚集物的形成。als中突变型sod1变体和/或野生型sod1的异常积累形成被识别为病理包涵体的不溶性纤维状聚集体。聚集的sod1蛋白可诱导线粒体应激(vehvilainenp等人，frontcellneurosci.，2014，8，126)和对细胞特别是对运动神经元的其他毒性。这些发现表明，sod1可能是家族性和偶发性als的潜在治疗靶标。可以减少als患者中枢神经系统中产生的sod1蛋白(无论是野生型还是突变型)的疗法可能减轻患者的als症状，例如运动神经元退化、肌无力和萎缩。旨在防止野生型和/或突变型sod1蛋白聚集的试剂和方法可预防疾病进展并改善als症状。rna干扰(rnai)介导的基因沉默近年来引起了研究人员的兴趣。本领域已经教导了靶向sod1基因的小双链rna(小干扰rna)分子在治疗als方面的潜力(参见，例如，美国专利号7,632,938和美国专利公开号20060229268)。本发明开发了一种基于rna干扰或敲低的方法来抑制或预防als患者中sod1基因的表达，以治疗该疾病。本发明提供了新的多核苷酸，包括双链rna(dsrna)构建体和/或sirna构建体、shrna构建体和/或microrna构建体及其设计方法。另外，这些sirna构建体可以是在用于递送至细胞中的表达载体(一条或两条链)中编码的合成分子。此类载体包括但不限于腺相关病毒载体，例如任何aav血清型的载体基因组或其他病毒递送载体，例如慢病毒等。技术实现要素：本发明提供了编码靶向sod1的多核苷酸以干扰sod1基因表达和/或sod1蛋白生产的aav载体及其使用方法。本发明还包括治疗运动神经元退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症的方法。在一个实施方案中，与未治疗的受试者相比，在用编码靶向sod1的多核苷酸的aav治疗的受试者中sod1被抑制30％。可以以预定剂量水平以输注或推注(bolus)的形式给受试者施用aav。作为非限制性实例，在c1至l7腹角区域中见到抑制。本发明涉及rna分子介导的对基因表达和蛋白生产的基因特异性干扰。本发明还包括治疗运动神经元退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化症的方法。本文中特征性的组合物中包括的sirna包含具有反义链(反义链)的dsrna，该反义链具有长度为30个核苷酸或更少，通常19-24个核苷酸，且与sod1基因的mrna转录本的至少一部分基本互补的区域。本发明提供靶向sod1mrna以干扰sod1基因表达和/或sod1蛋白生产的短双链rna分子，例如小干扰rna(sirna)双链体。本发明的sirna双链体可以干扰sod1基因的两个等位基因，而不论sod1基因中的任何具体突变为何，并且可以特别地与在als疾病中发现的那些相互作用。在一些实施方案中，将这样的sirna分子或sirna分子的单链插入腺相关病毒载体中以引入细胞，特别是运动神经元和/或中枢神经系统中的其他周围细胞。本发明的sirna双链体包含反义链和有义链，两者杂交在一起形成双链体结构，其中所述反义链与所靶向的sod1基因的核酸序列互补，并且其中所述有义链与所靶向的sod1基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5'端具有5'磷酸基团，并且有义链的3'端包含3'羟基。在其他方面，在每条链的3'端没有悬突或者具有一个或两个核苷酸的突出。根据本发明，靶向sod1基因的sirna双链体的每条链的长度为约19-25个核苷酸，优选长度约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸。在一些方面，sirna可以是未修饰的rna分子。在其他方面，sirna可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。在一个实施方案中，sirna或dsrna包含至少两条彼此互补的序列。dsrna包含具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含与编码sod1的mrna的至少一部分基本上互补的核苷酸序列，并且互补区域长度为30个核苷酸或更少，且至少15个核苷酸。通常，dsrna的长度为19至24，例如19至21个核苷酸。在一些实施方案中，dsrna的长度为约15至约25个核苷酸，并且在其他实施方案中，dsrna的长度为约25至约30个核苷酸。dsrna与表达sod1的细胞接触或在表达sod1的细胞内转录后，抑制或压制sod1基因的表达至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更高，例如通过本文所述方法进行测定时。根据本发明，产生了包含编码靶向sod1基因的sirna双链体、所述sirna双链体的一条链或dsrna的核酸的aav载体，所述aav载体的血清型可以是aav1、aav2、aav2g9、aav3、aav3a、aav3b、aav3-3、aav4、aav4-4、aav5、aav6、aav6.1、aav6.2、aav6.1.2、aav7、aav7.2、aav8、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84、aav9.9、aav10、aav11、aav12、aav16.3、aav24.1、aav27.3、aav42.12、aav42-1b、aav42-2、aav42-3a、aav42-3b、aav42-4、aav42-5a、aav42-5b、aav42-6b、aav42-8、aav42-10、aav42-11、aav42-12、aav42-13、aav42-15、aav42-aa、aav43-1、aav43-12、aav43-20、aav43-21、aav43-23、aav43-25、aav43-5、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav1-7/rh.48、aav1-8/rh.49、aav2-15/rh.62、aav2-3/rh.61、aav2-4/rh.50、aav2-5/rh.51、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3-9/rh.52、aav3-11/rh.53、aav4-8/r11.64、aav4-9/rh.54、aav4-19/rh.55、aav5-3/rh.57、aav5-22/rh.58、aav7.3/hu.7、aav16.8/hu.10、aav16.12/hu.11、aav29.3/bb.1、aav29.5/bb.2、aav106.1/hu.37、aav114.3/hu.40、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aav33.12/hu.17、aav33.4/hu.15、aav33.8/hu.16、aav52/hu.19、aav52.1/hu.20、aav58.2/hu.25、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aava3.7、aavc1、aavc2、aavc5、aav-dj、aav-dj8、aavf3、aavf5、aavh2、aavrh.72、aavhu.8、aavrh.68、aavrh.70、aavpi.1、aavpi.3、aavpi.2、aavrh.60、aavrh.44、aavrh.65、aavrh.55、aavrh.47、aavrh.69、aavrh.45、aavrh.59、aavhu.12、aavh6、aavlk03、aavh-1/hu.1、aavh-5/hu.3、aavlg-10/rh.40、aavlg-4/rh.38、aavlg-9/hu.39、aavn721-8/rh.43、aavch.5、aavch.5r1、aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5r1、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aavhu.1、aavhu.2、aavhu.3、aavhu.4、aavhu.5、aavhu.6、aavhu.7、aavhu.9、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.13、aavhu.15、aavhu.16、aavhu.17、aavhu.18、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44r1、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48r1、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.14/9、aavhu.t19、aavrh.2、aavrh.2r、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.20、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.46、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.61、aavrh.64、aavrh.64r1、aavrh.64r2、aavrh.67、aavrh.73、aavrh.74、aavrh8r、aavrh8ra586r突变体、aavrh8rr533a突变体、aaav、baav、羊aav、牛aav、aavhe1.1、aavher1.5、aavher1.14、aavher1.8、aavher1.16、aavher1.18、aavher1.35、aavher1.7、aavher1.36、aavher2.29、aavher2.4、aavher2.16、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher1.23、aavher3.1、aav2.5t、aav-paec、aav-lk01、aav-lk02、aav-lk03、aav-lk04、aav-lk05、aav-lk06、aav-lk07、aav-lk08、aav-lk09、aav-lk10、aav-lk11、aav-lk12、aav-lk13、aav-lk14、aav-lk15、aav-lk16、aav-lk17、aav-lk18、aav-lk19、aav-paec2、aav-paec4、aav-paec6、aav-paec7、aav-paec8、aav-paec11、aav-paec12、aav-2-pre-mirna-101、aav-8h、aav-8b、aav-h、aav-b、aavsm10-2、aav穿梭100-1、aav穿梭100-3、aav穿梭100-7、aav穿梭10-2、aav穿梭10-6、aav穿梭10-8、aav穿梭100-2、aavsm10-1、aavsm10-8、aavsm100-3、aavsm100-10、bnp61aav、bnp62aav、bnp63aav、aavrh.50、aavrh.43、aavrh.62、aavrh.48、aavhu.19、aavhu.11、aavhu.53、aav4-8/rh.64、aavlg-9/hu.39、aav54.5/hu.23、aav54.2/hu.22、aav54.7/hu.24、aav54.1/hu.21、aav54.4r/hu.27、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav128.1/hu.43、真型aav(ttaav)、upennaav10、日本aav10血清型、aavcbr-7.1、aavcbr-7.10、aavcbr-7.2、aavcbr-7.3、aavcbr-7.4、aavcbr-7.5、aavcbr-7.7、aavcbr-7.8、aavcbr-b7.3、aavcbr-b7.4、aavcbr-e1、aavcbr-e2、aavcbr-e3、aavcbr-e4、aavcbr-e5、aavcbr-e5、aavcbr-e6、aavcbr-e7、aavcbr-e8、aavcht-1、aavcht-2、aavcht-3、aavcht-6.1、aavcht-6.10、aavcht-6.5、aavcht-6.6、aavcht-6.7、aavcht-6.8、aavcht-p1、aavcht-p2、aavcht-p5、aavcht-p6、aavcht-p8、aavcht-p9、aavckd-1、aavckd-10、aavckd-2、aavckd-3、aavckd-4、aavckd-6、aavckd-7、aavckd-8、aavckd-b1、aavckd-b2、aavckd-b3、aavckd-b4、aavckd-b5、aavckd-b6、aavckd-b7、aavckd-b8、aavckd-h1、aavckd-h2、aavckd-h3、aavckd-h4、aavckd-h5、aavckd-h6、aavckd-n3、aavckd-n4、aavckd-n9、aavclg-f1、aavclg-f2、aavclg-f3、aavclg-f4、aavclg-f5、aavclg-f6、aavclg-f7、aavclg-f8、aavclv-1、aavclv1-1、aavclv1-10、aavclv1-2、aavclv-12、aavclv1-3、aavclv-13、aavclv1-4、aavclv1-7、aavclv1-8、aavclv1-9、aavclv-2、aavclv-3、aavclv-4、aavclv-6、aavclv-8、aavclv-d1、aavclv-d2、aavclv-d3、aavclv-d4、aavclv-d5、aavclv-d6、aavclv-d7、aavclv-d8、aavclv-e1、aavclv-k1、aavclv-k3、aavclv-k6、aavclv-l4、aavclv-l5、aavclv-l6、aavclv-m1、aavclv-m11、aavclv-m2、aavclv-m5、aavclv-m6、aavclv-m7、aavclv-m8、aavclv-m9、aavclv-r1、aavclv-r2、aavclv-r3、aavclv-r4、aavclv-r5、aavclv-r6、aavclv-r7、aavclv-r8、aavclv-r9、aavcsp-1、aavcsp-10、aavcsp-11、aavcsp-2、aavcsp-3、aavcsp-4、aavcsp-6、aavcsp-7、aavcsp-8、aavcsp-8.10、aavcsp-8.2、aavcsp-8.4、aavcsp-8.5、aavcsp-8.6、aavcsp-8.7、aavcsp-8.8、aavcsp-8.9、aavcsp-9、aav.hu.48r3、aav.vr-355、aav3b、aav4、aav5、aavf1/hsc1、aavf11/hsc11、aavf12/hsc12、aavf13/hsc13、aavf14/hsc14、aavf15/hsc15、aavf16/hsc16、aavf17/hsc17、aavf2/hsc2、aavf3/hsc3、aavf4/hsc4、aavf5/hsc5、aavf6/hsc6、aavf7/hsc7、aavf8/hsc8、aavf9/hsc9、aav-php.b、aav-php.a、g2b-26、g2b-13、th1.1-32、th1.1-35、aavphp.b2、aavphp.b3、aavphp.n/php.b-dgt、aavphp.b-est、aavphp.b-ggt、aavphp.b-atp、aavphp.b-att-t、aavphp.b-dgt-t、aavphp.b-ggt-t、aavphp.b-sgs、aavphp.b-aqp、aavphp.b-qqp、aavphp.b-snp(3)、aavphp.b-snp、aavphp.b-qgt、aavphp.b-nqt、aavphp.b-egs、aavphp.b-sgn、aavphp.b-egt、aavphp.b-dst、aavphp.b-dst、aavphp.b-stp、aavphp.b-pqp、aavphp.b-sqp、aavphp.b-qlp、aavphp.b-tmp、aavphp.b-ttp、aavphp.s/g2a12、aavg2a15/g2a3、aavg2b4、aavg2b5及其变体。根据本发明，靶向als中的sod1基因的sirna双链体或dsrna选自表4中列出的sirna双链体。优选地，靶向als中的sod1基因的sirna双链体或dsrna选自由sirna双链体d-4000至d-4025组成的组。本发明还提供了药物组合物，其包含至少一种靶向sod1基因的sirna双链体和药学上可接受的载体。在一些方面，将编码sirna双链体的核酸序列插入aav载体。在一些实施方案中，本发明提供了抑制/沉默细胞中sod1基因表达的方法。因此，sirna双链体或dsrna可用于基本上抑制细胞，特别是运动神经元中的sod1基因表达。在一些方面，sod1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，所靶向基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选地至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。sod1基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的突变型sod1基因。因此，sod1蛋白是野生型蛋白或具有至少一个突变的突变型多肽。在一些实施方案中，本发明提供了在需要治疗的受试者中治疗或改善与异常sod1基因和/或sod1蛋白相关的肌萎缩性侧索硬化症的方法，该方法包括向该受试者施用药学有效量的至少一种靶向sod1基因的sirna双链体，将所述sirna双链体递送至靶细胞，抑制sod1基因表达和蛋白生产，并改善受试者中als的症状。在一些实施方案中，将包含编码靶向sod1基因的至少一种sirna双链体的核酸序列的aav载体施用于需要治疗和/或改善als的受试者。aav载体血清型可以选自由以下组成的组：aav1、aav2、aav2g9、aav3、aav3a、aav3b、aav3-3、aav4、aav4-4、aav5、aav6、aav6.1、aav6.2、aav6.1.2、aav7、aav7.2、aav8、aav9、aav9.11、aav9.13、aav9.16、aav9.24、aav9.45、aav9.47、aav9.61、aav9.68、aav9.84、aav9.9、aav10、aav11、aav12、aav16.3、aav24.1、aav27.3、aav42.12、aav42-1b、aav42-2、aav42-3a、aav42-3b、aav42-4、aav42-5a、aav42-5b、aav42-6b、aav42-8、aav42-10、aav42-11、aav42-12、aav42-13、aav42-15、aav42-aa、aav43-1、aav43-12、aav43-20、aav43-21、aav43-23、aav43-25、aav43-5、aav44.1、aav44.2、aav44.5、aav223.1、aav223.2、aav223.4、aav223.5、aav223.6、aav223.7、aav1-7/rh.48、aav1-8/rh.49、aav2-15/rh.62、aav2-3/rh.61、aav2-4/rh.50、aav2-5/rh.51、aav3.1/hu.6、aav3.1/hu.9、aav3-9/rh.52、aav3-11/rh.53、aav4-8/r11.64、aav4-9/rh.54、aav4-19/rh.55、aav5-3/rh.57、aav5-22/rh.58、aav7.3/hu.7、aav16.8/hu.10、aav16.12/hu.11、aav29.3/bb.1、aav29.5/bb.2、aav106.1/hu.37、aav114.3/hu.40、aav127.2/hu.41、aav127.5/hu.42、aav128.3/hu.44、aav130.4/hu.48、aav145.1/hu.53、aav145.5/hu.54、aav145.6/hu.55、aav161.10/hu.60、aav161.6/hu.61、aav33.12/hu.17、aav33.4/hu.15、aav33.8/hu.16、aav52/hu.19、aav52.1/hu.20、aav58.2/hu.25、aava3.3、aava3.4、aava3.5、aava3.7、aavc1、aavc2、aavc5、aav-dj、aav-dj8、aavf3、aavf5、aavh2、aavrh.72、aavhu.8、aavrh.68、aavrh.70、aavpi.1、aavpi.3、aavpi.2、aavrh.60、aavrh.44、aavrh.65、aavrh.55、aavrh.47、aavrh.69、aavrh.45、aavrh.59、aavhu.12、aavh6、aavlk03、aavh-1/hu.1、aavh-5/hu.3、aavlg-10/rh.40、aavlg-4/rh.38、aavlg-9/hu.39、aavn721-8/rh.43、aavch.5、aavch.5r1、aavcy.2、aavcy.3、aavcy.4、aavcy.5、aavcy.5r1、aavcy.5r2、aavcy.5r3、aavcy.5r4、aavcy.6、aavhu.1、aavhu.2、aavhu.3、aavhu.4、aavhu.5、aavhu.6、aavhu.7、aavhu.9、aavhu.10、aavhu.11、aavhu.13、aavhu.15、aavhu.16、aavhu.17、aavhu.18、aavhu.20、aavhu.21、aavhu.22、aavhu.23.2、aavhu.24、aavhu.25、aavhu.27、aavhu.28、aavhu.29、aavhu.29r、aavhu.31、aavhu.32、aavhu.34、aavhu.35、aavhu.37、aavhu.39、aavhu.40、aavhu.41、aavhu.42、aavhu.43、aavhu.44、aavhu.44r1、aavhu.44r2、aavhu.44r3、aavhu.45、aavhu.46、aavhu.47、aavhu.48、aavhu.48r1、aavhu.48r2、aavhu.48r3、aavhu.49、aavhu.51、aavhu.52、aavhu.54、aavhu.55、aavhu.56、aavhu.57、aavhu.58、aavhu.60、aavhu.61、aavhu.63、aavhu.64、aavhu.66、aavhu.67、aavhu.14/9、aavhu.t19、aavrh.2、aavrh.2r、aavrh.8、aavrh.8r、aavrh.10、aavrh.12、aavrh.13、aavrh.13r、aavrh.14、aavrh.17、aavrh.18、aavrh.19、aavrh.20、aavrh.21、aavrh.22、aavrh.23、aavrh.24、aavrh.25、aavrh.31、aavrh.32、aavrh.33、aavrh.34、aavrh.35、aavrh.36、aavrh.37、aavrh.37r2、aavrh.38、aavrh.39、aavrh.40、aavrh.46、aavrh.48、aavrh.48.1、aavrh.48.1.2、aavrh.48.2、aavrh.49、aavrh.51、aavrh.52、aavrh.53、aavrh.54、aavrh.56、aavrh.57、aavrh.58、aavrh.61、aavrh.64、aavrh.64r1、aavrh.64r2、aavrh.67、aavrh.73、aavrh.74、aavrh8r、aavrh8ra586r突变体、aavrh8rr533a突变体、aaav、baav、羊aav、牛aav、aavhe1.1、aavher1.5、aavher1.14、aavher1.8、aavher1.16、aavher1.18、aavher1.35、aavher1.7、aavher1.36、aavher2.29、aavher2.4、aavher2.16、aavher2.30、aavher2.31、aavher2.36、aavher1.23、aavher3.1、aav2.5t、aav-paec、aav-lk01、aav-lk02、aav-lk03、aav-lk04、aav-lk05、aav-lk06、aav-lk07、aav-lk08、aav-lk09、aav-lk10、aav-lk11、aav-lk12、aav-lk13、aav-lk14、aav-lk15、aav-lk16、aav-lk17、aav-lk18、aav-lk19、aav-paec2、aav-paec4、aav-paec6、aav-paec7、aav-paec8、aav-paec11、aav-paec12、aav-2-pre-mirna-101、aav-8h、aav-8b、aav-h、aav-b、aavsm10-2、aav穿梭100-1、aav穿梭100-3、aav穿梭100-7、aav穿梭10-2、aav穿梭10-6、aav穿梭10-8、aav穿梭100-2、aavsm10-1、aavsm10-8、aavsm100-3、aavsm100-10、bnp61aav、bnp62aav、bnp63aav、aavrh.50、aavrh.43、aavrh.62、aavrh.48、aavhu.19、aavhu.11、aavhu.53、aav4-8/rh.64、aavlg-9/hu.39、aav54.5/hu.23、aav54.2/hu.22、aav54.7/hu.24、aav54.1/hu.21、aav54.4r/hu.27、aav46.2/hu.28、aav46.6/hu.29、aav128.1/hu.43、真型aav(ttaav)、upennaav10、日本aav10血清型、aavcbr-7.1、aavcbr-7.10、aavcbr-7.2、aavcbr-7.3、aavcbr-7.4、aavcbr-7.5、aavcbr-7.7、aavcbr-7.8、aavcbr-b7.3、aavcbr-b7.4、aavcbr-e1、aavcbr-e2、aavcbr-e3、aavcbr-e4、aavcbr-e5、aavcbr-e5、aavcbr-e6、aavcbr-e7、aavcbr-e8、aavcht-1、aavcht-2、aavcht-3、aavcht-6.1、aavcht-6.10、aavcht-6.5、aavcht-6.6、aavcht-6.7、aavcht-6.8、aavcht-p1、aavcht-p2、aavcht-p5、aavcht-p6、aavcht-p8、aavcht-p9、aavckd-1、aavckd-10、aavckd-2、aavckd-3、aavckd-4、aavckd-6、aavckd-7、aavckd-8、aavckd-b1、aavckd-b2、aavckd-b3、aavckd-b4、aavckd-b5、aavckd-b6、aavckd-b7、aavckd-b8、aavckd-h1、aavckd-h2、aavckd-h3、aavckd-h4、aavckd-h5、aavckd-h6、aavckd-n3、aavckd-n4、aavckd-n9、aavclg-f1、aavclg-f2、aavclg-f3、aavclg-f4、aavclg-f5、aavclg-f6、aavclg-f7、aavclg-f8、aavclv-1、aavclv1-1、aavclv1-10、aavclv1-2、aavclv-12、aavclv1-3、aavclv-13、aavclv1-4、aavclv1-7、aavclv1-8、aavclv1-9、aavclv-2、aavclv-3、aavclv-4、aavclv-6、aavclv-8、aavclv-d1、aavclv-d2、aavclv-d3、aavclv-d4、aavclv-d5、aavclv-d6、aavclv-d7、aavclv-d8、aavclv-e1、aavclv-k1、aavclv-k3、aavclv-k6、aavclv-l4、aavclv-l5、aavclv-l6、aavclv-m1、aavclv-m11、aavclv-m2、aavclv-m5、aavclv-m6、aavclv-m7、aavclv-m8、aavclv-m9、aavclv-r1、aavclv-r2、aavclv-r3、aavclv-r4、aavclv-r5、aavclv-r6、aavclv-r7、aavclv-r8、aavclv-r9、aavcsp-1、aavcsp-10、aavcsp-11、aavcsp-2、aavcsp-3、aavcsp-4、aavcsp-6、aavcsp-7、aavcsp-8、aavcsp-8.10、aavcsp-8.2、aavcsp-8.4、aavcsp-8.5、aavcsp-8.6、aavcsp-8.7、aavcsp-8.8、aavcsp-8.9、aavcsp-9、aav.hu.48r3、aav.vr-355、aav3b、aav4、aav5、aavf1/hsc1、aavf11/hsc11、aavf12/hsc12、aavf13/hsc13、aavf14/hsc14、aavf15/hsc15、aavf16/hsc16、aavf17/hsc17、aavf2/hsc2、aavf3/hsc3、aavf4/hsc4、aavf5/hsc5、aavf6/hsc6、aavf7/hsc7、aavf8/hsc8、aavf9/hsc9、aav-php.b、aav-php.a、g2b-26、g2b-13、th1.1-32、th1.1-35、aavphp.b2、aavphp.b3、aavphp.n/php.b-dgt、aavphp.b-est、aavphp.b-ggt、aavphp.b-atp、aavphp.b-att-t、aavphp.b-dgt-t、aavphp.b-ggt-t、aavphp.b-sgs、aavphp.b-aqp、aavphp.b-qqp、aavphp.b-snp(3)、aavphp.b-snp、aavphp.b-qgt、aavphp.b-nqt、aavphp.b-egs、aavphp.b-sgn、aavphp.b-egt、aavphp.b-dst、aavphp.b-dst、aavphp.b-stp、aavphp.b-pqp、aavphp.b-sqp、aavphp.b-qlp、aavphp.b-tmp、aavphp.b-ttp、aavphp.s/g2a12、aavg2a15/g2a3、aavg2b4、aavg2b5及其变体。在一些方面，als是与sod1突变相关联的家族性als。在其他方面，als是偶发性als，其特征在于sod1蛋白的异常聚集或sod1蛋白功能或定位的破坏，尽管不一定是基因突变的结果。通过本方法改善的als的症状可以包括运动神经元退化、肌无力、肌肉僵硬、言语含糊和/或呼吸困难。在一些实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或dsrna或包含编码此类sirna的分子的aav载体可以直接引入受试者的中枢神经系统，例如通过颅内注射。在一些实施方案中，本发明的药物组合物用作单独疗法。在其他实施方案中，本发明的药物组合物用于联合疗法。联合疗法可以与一种或多种神经保护剂例如小分子化合物、生长因子和激素组合，所述神经保护剂已经被测试了它们对运动神经元退化的神经保护作用。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体来治疗或改善肌萎缩性侧索硬化症(als)的方法。als可以是家族性als或偶发性als。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体来治疗或改善犬类退行性脊髓病(dm)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体以降低受试者中神经丝轻链(nf-l)水平来治疗或改善肌萎缩性侧索硬化症(als)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体以降低受试者中神经丝轻链(nf-l)水平来治疗或改善犬类退行性脊髓病(dm)的方法。在一些实施方案中，本发明提供了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的质粒或aav载体降低受试者中神经丝轻链(nf-l)的水平的方法。附图简要说明通过以下对本发明的如附图所示的具体实施方案的描述，前述和其他目的、特征和优点将变得显而易见。附图不一定按比例绘制，而是将重点放在说明本发明的各种实施方案的原理上。图1示出了nf-l的quanterixsimoahnf-l(β)测定的校准曲线。图2a与图2b示出了在正常犬的csf中nf-l的稳定性。图2a示出了以pg/ml为单位的nf-l的稳定性，并且图2b示出了以-80℃对照的百分比为单位的稳定性。图3a和图3b示出了在正常犬的血清中nf-l的稳定性。图3a示出了以pg/ml为单位的nf-l的稳定性，图3b示出了以-80℃对照的百分比为单位的稳定性。图4a和图4b是示出dm犬中nf-l水平的直方图。图4a示出了csf中的nf-l水平，图4b示出了血清中的nf-l水平。图5a、图5b和图5c是示出了dm狗中pnf-h水平的直方图。图5a示出了在dm狗的csf中pnf-h水平升高。图5b示出了csf中的pnf-h水平与疾病严重程度无关。图5c示出了csf中的pnf-h对dm是特异性的。具体实施方案本发明涉及作为治疗剂的靶向sod1的多核苷酸。rna干扰介导的基因沉默可以特异性抑制基因表达。因此，本发明提供了靶向sod1基因的多核苷酸，例如小双链rna(dsrna)分子(小干扰rna，sirna)、shrna、microrna及其前体，包含此类多核苷酸的药物组合物，以及设计它们的方法。本发明还提供了它们抑制sod1基因表达和蛋白生产，治疗神经退行性疾病，尤其是肌萎缩性侧索硬化症(als)的用途。本发明的一个或多个实施方案的细节在以下所附的描述中阐明。尽管与本文所述的材料或方法相似或等同的任何材料和方法都可以用于本发明的实施或测试中，现在描述优选的材料和方法。通过描述，本发明的其他特征、目的和优点将是显而易见的。在描述中，单数形式也包括复数，除非上下文另外明确指出。除非另有定义，否则如本文所用，所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，以本说明书为准。肌萎缩性侧索硬化症(als)和sod1肌萎缩性侧索硬化症(als)是一种成年发病的神经退行性疾病，是一种进行性的致命疾病，其特征在于运动皮层、脑干和脊髓中运动神经元的选择性死亡。被诊断为als的患者会发展出进行性肌肉表型，其特征是痉挛、反射亢进或反射不足、肌束震颤、肌肉萎缩和麻痹。这些运动损伤由运动神经元丧失导致的肌肉去神经支配引起。als的主要病理特征包括皮质脊髓束的退化和下位运动神经元(lmn)或前角细胞的大量丧失(ghatak等人，jneuropatholexpneurol.，1986，45，385-395)，贝茨细胞和初级运动皮层中其他锥体细胞的退化和丧失(udaka等人，actaneuropathol.，1986，70，289-295；maekawa等人，brain，2004，127，1237-1251)和运动皮层与脊髓中的反应性神经胶质增生(kawamata等人，amjpathol.，1992，140，691-707；和schiffer等人，jneurolsci.，1996，139，27-33)。由于呼吸缺陷和/或炎症，als通常在诊断后3至5年内致命(rowlandlp和shneibderna，nengl.j.med.，2001，344，1688-1700)。als的细胞标志是退化的运动神经元和周围细胞(例如，星形胶质细胞)中存在蛋白质的泛素化的胞质包涵体(inclusion)。泛素化的包涵体(即，lewy体样包涵体或丝状包涵体)是als中最常见的特定类型的包涵体，并且发现于脊髓和脑干的lmn以及皮质脊髓上部运动神经元(umn)(matsumoto等人，jneurolsci.，1993，115，208-213；以及sasak和maruyama，actaneuropathol.，1994，87，578-585)。已经鉴定出一些蛋白质是包涵体的成分，包括泛素、cu/zn超氧化物歧化酶1(sod1)、外围蛋白和dorfin。神经丝状包涵体通常见于als中脊髓运动神经元的透明簇生包涵体(hyalineconglomerateinclusion，hci)和轴突“球体”中。其他类型的不太特异性的包涵体包括皮质上层的bunina体(含胱抑素c的包涵体)和月牙形包涵体(sci)。在als中观察到的其他神经病理学特征包括高尔基体片段化、线粒体空泡化和突触末端的超微结构异常(fujita等人，actaneuropathol.2002，103，243-247)。此外，在额颞叶痴呆als(ftd-als)中，还观察到皮质萎缩(包括额叶和颞叶)，其可能导致ftd-als患者的认知障碍。als是一种复杂的多因素疾病，并且假定为引起als发病机理的多种机制包括蛋白质降解功能障碍、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧化应激、炎症、蛋白折叠错误和聚集、异常的rna代谢和改变的基因表达。约10％的als病例有该疾病的家族史，并且这些患者被称为家族性als(fals)或遗传性的患者，通常具有遗传的孟德尔主导模式和高外显率。剩余的(大约90％-95％)被归类为偶发性als(sals)，因为它们没有记录的家族史，其被认为是其他危险因素导致，包括环境因素、遗传多态性、体细胞突变以及可能的基因-环境相互作用。在大多数情况下，家族性(或遗传性)als作为常染色体显性遗传病而遗传，但存在具有常染色体隐性和x连锁遗传和不完全外显性的系谱。偶发形式和家族形式在临床上无法区分，这表明了共同的发病机理。als中运动神经元的选择性死亡的确切原因仍然难以捉摸。在了解fals中的遗传因素方面的进展可能会阐明该疾病的两种形式。近来，als的遗传病因的激增已经发现在超过10个已知导致fals的不同基因中的突变。在编码cu/zn超氧化物歧化酶1(sod1；～20％)的基因(rosendr等人，nature，1993，362，59-62)、融合于肉瘤/在脂肪肉瘤中易位的基因(fus/tls；1-5％)和tdp-43(tardbp；1-5％)中发现了最常见的突变。最近，c9orf72基因中的六核苷酸重复扩增(ggggcc)n被鉴定为西方人群中fals的最常见原因(约40％)(由renton等人，nat.neurosci.，2014，17，17-23综述)。在als中发生突变的其他基因包括alsin(als2)、senataxin(setx)、囊泡相关膜蛋白(vapb)、血管生成素(ang)。fals基因控制着不同的细胞机制，这表明als的发病机制是复杂的并可能与最终导致运动神经元退化的几种不同过程有关。sod1是在哺乳动物中鉴定和表征的三种人类超氧化物歧化酶之一：铜-锌超氧化物歧化酶(cu/znsod或sod1)、锰超氧化物歧化酶(mnsod或sod2)和细胞外超氧化物歧化酶(ecsod或sod3)。sod1是一个153个残基的多肽的32kda同二聚体，每个亚基具有一个铜和一个锌结合位点，其由人染色体21上的sod1基因(ncbi参考序列nm_000454.4；seqidno：1)编码(见表10)。sod1在结合的铜离子处催化超氧阴离子(o2-)转变为分子氧(o2)和过氧化氢(h2o2)。sod1的细胞内浓度高(范围从10到100μm)，占中枢神经系统(cns)总蛋白含量的1％。该蛋白不仅位于真核细胞的细胞质中，还位于细胞核、溶酶体、过氧化物酶体和线粒体膜间空间中(lindenauj等人，glia，2000，29，25-34)。15-20％的fals患者和1-2％的全部als病例携带sod1基因中的突变。目前，分布在整个153个氨基酸的sod1多肽中的至少170个不同的突变已被发现导致als，并且更新的列表可以在als在线遗传数据库(alsod)中找到(wroer等人，amyotrophlateralscler.,2008，9，249-250)。表1列出了als中sod1中突变的一些示例。这些突变主要是单个氨基酸取代(即错义突变)，尽管也发生缺失、插入和c端截短。不同的sod1突变显示不同的地理分布谱图。例如，由sod1基因突变引起的患有als的所有美国人中，大约一半具有特定的突变ala4val(或a4v)。a4v突变通常与较严重的体征和症状相关。迄今为止，i113t突变是英国最常见的突变。在欧洲，最普遍的突变是d90a取代。表1.als中sod1突变的示例为了研究与sod1基因缺陷相关的神经元死亡的机制，本领域开发了几种与sod1相关联的als的啮齿动物模型，其表达具有不同突变的人sod1基因，包括错义突变、小缺失或插入。als小鼠模型的一些示例包括sod1g93a、sod1a4v、sod1g37r、sod1g85r、sod1d90a、sod1l84v、sod1i113t、sod1h36r/h48q、sod1g127x、sod1l126x和sod1l126deltt。有两种带有两种不同的人sod1突变的转基因大鼠模型：sod1h46r和sod1g93r。这些啮齿动物als模型可发展出类似于人als患者的肌无力以及其他反映人类疾病若干特征的致病特征，特别是脊髓运动神经元的选择性死亡、运动神经元中蛋白质包涵体的聚集和小神经胶质细胞活化。本领域中众所周知，转基因啮齿动物是人的与sod1相关的als疾病的良好模型，并且提供了用于研究疾病发病机理和发展疾病治疗的模型。在动物和细胞模型中的研究显示，sod1致病性变体通过功能获得导致als。也就是说，当被sod1突变改变时，超氧化物歧化酶获得新的但有害的性质。例如，als中一些sod1突变的变体通过破坏氧化还原循环增加氧化应激(例如，增加的毒性超氧化物自由基的累积)。其他研究也表明，als中一些sod1突变的变体可能获得独立于其正常生理功能的有毒性质(如错误折叠的sod1变体的异常聚集)。在异常氧化还原化学模型中，突变体sod1是不稳定的，并通过异常化学与导致活性氧物质(ros)过生产的非常规底物相互作用。在蛋白毒性模型中，不稳定的、错误折叠的sod1聚集在细胞质包涵体中，隔绝对细胞过程关键的蛋白。这两个假说不是相互排斥的。已经表明，在活性位点中结合金属的选定组氨酸残基的氧化介导了sod1聚集。聚集的突变体sod1蛋白还可诱导线粒体功能障碍(vehvilainenp等，frontcellneurosci.，2014，8，126)、轴突运输受损、异常rna代谢、神经胶质细胞病理学和谷氨酸兴奋毒性。在一些偶发性als病例中，在患病的运动神经元中发现了错误折叠的野生型sod1蛋白，其形成类似于家族性als相关联的sod1变体的“毒性构象”(rotunnoms和boscoda，frontcellneurosci.，2013，16，7，253)。这些证据表明，als是一种蛋白折叠疾病，类似于其他神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。当前，没有针对患有als的患者的治疗方法。唯一获fda批准的药物利鲁唑(也称为力如太(rilutek))，是一种谷氨酸释放的抑制剂，对als具有中等作用，如果服用18个月只能延长2-3个月的生存期。不幸的是，服用利鲁唑的患者没有任何疾病进展减慢或肌肉功能改善。因此，利鲁唑不能提供治愈，或者甚至不是有效的治疗。研究人员继续寻找更好的治疗药物。抑制异常sod1蛋白聚集的一个方法是沉默/抑制als中sod1基因的表达。据报道，用于等位基因的特异性基因沉默突变的小干扰rna对fals的治疗具有治疗上的益处(例如，ralghgs等人,nat.medicine，2005，11(4)，429-433；和raoulc等人，nat.medicine，2005，11(4)，423-428；和maxwellmm等人，pnas，2004，101(9)，3178-3183；和dingh等人，chinesemedicalj.，2011，124(1)，106-110；和scharzds等人，plosgenet.，2006，2(9)，e140；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。本领域教导了许多靶向als中的sod1基因和调节sod1表达的其他rna治疗剂，此类基于rna的试剂包括反义寡核苷酸和双链小干扰rna。参见，例如，wangh等人，jbiol.chem.，2008，283(23)，15845-1585)；美国专利号7,498,316；7,632,938；7,678,895；7,951,784；7,977,314；8,183,219；8,309,533和8,586,554；以及美国专利公开号2006/0229268和2011/0263680；其每一个的内容通过引用整体并入本文。本发明使用诸如腺相关病毒(aav)载体的病毒载体来高效率地递送sirna双链体或靶向sod1的多核苷酸至细胞。包含本发明的rnai分子例如sirna分子的aav载体可以增加活性剂至运动神经元的递送。靶向sod1的多核苷酸可能能够显著抑制细胞内sod1基因的表达(例如mrna水平)；因此，改善细胞内sod1表达诱导的应激，例如蛋白质聚集和包涵体形成、自由基增加、线粒体功能障碍和rna代谢。此类靶向sod1的多核苷酸抑制可用于治疗als。根据本发明，用于治疗和/或改善患者中als的方法包括对患者施用有效量的至少一种编码一种或多种sirna双链体的靶向sod1的多核苷酸至细胞中并允许抑制/沉默sod1的基因表达。本发明的组合物载体在一些实施方案中，本文所述的sirna分子可插入载体如质粒或病毒载体或由载体如质粒或病毒载体编码。优选地，将sirna分子插入病毒载体或由病毒载体编码。病毒载体可以是疱疹病毒(hsv)载体，逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体等。在一些具体的实施方案中，病毒载体是aav载体。逆转录病毒载体在一些实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体可以由逆转录病毒载体编码(参见，例如，美国专利号5,399,346；5,124,263；4,650,764和4,980,289；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。腺病毒载体腺病毒是可以被修饰以将核酸有效地体内递送至多种细胞类型的真核dna病毒，并且已广泛用于基因治疗方案中，包括用于将基因靶向神经细胞。已描述了用于核酸治疗的各种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(参见，例如，pct专利公开号wo199426914、wo199502697、wo199428152、wo199412649、wo199502697和wo199622378；其每一个的内容通过引用整体并入全文)。此类腺病毒载体也可以用于将本发明的sirna分子递送至细胞。腺相关病毒(aav)载体aav是依赖细小病毒。与其他细小病毒一样，aav是一种单链、无包膜的dna病毒，其基因组长约5000个核苷酸，包含两个开放阅读框，这些开放阅读框编码负责复制的蛋白(rep)和衣壳的结构蛋白(cap)。开放阅读框的侧翼是两个反向末端重复(itr)序列，其充当病毒基因组复制的起点。此外，aav基因组含有包装序列，允许将病毒基因组包装为aav衣壳。aav载体需要共辅助病毒(例如腺病毒)以在感染的细胞中进行生产性感染。在没有这类辅助功能的情况下，aav病毒粒主要进入宿主细胞并整合到细胞的基因组中。由于aav载体的几个独特特征，研究了aav载体用于sirna递送。这些特征包括(i)感染分裂和非分裂细胞的能力；(ii)包括人类细胞在内的广泛的感染性宿主范围；(iii)野生型aav从未与任何疾病相关，并且不能在受感染的细胞中复制；(iv)缺乏针对该载体的细胞介导的免疫应答以及(v)整合入宿主染色体或游离存在的能力，从而为长期表达创造了可能性。此外，用aav载体进行的感染对改变细胞基因表达的模式具有最小的影响(stilwell和samulski等人，biotechniques，2003，34，148)。通常，用于sirna递送的aav载体可以是重组病毒载体，其由于在病毒基因组中缺乏编码功能性rep和cap蛋白的序列而是复制缺陷的。在某些情况下，缺陷型aav载体可缺少所有编码序列中的大多数，并且基本上仅包含一条或两条aavitr序列和一条包装序列。aav载体还可包含自互补aav载体(scaav)。scaav载体包含两条退火在一起形成双链dna的dna链。通过跳过第二链合成，scaav可在细胞中快速表达。本领域公开了产生/修饰aav载体的方法，例如假型aav载体(pct专利公开号wo200028004；wo200123001；wo2004112727；wo2005005610和wo2005072364，其每一个的内容通过引用整体并入本文)。用于将sirna分子递送到哺乳动物细胞中的aav载体可以从多种血清型的aav制备或衍生，包括但不限于aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj。在某些情况下，可以将不同血清型的aav混合在一起或与其他类型的病毒混合，以产生嵌合aav载体。可以修饰用于递送sirna的aav载体以增强递送效率。此类含有sirna表达盒的修饰的aav载体可以有效地包装，并且可以用于以高频率和最小的毒性成功地感染靶细胞。在一些实施方案中，用于递送本发明的sirna双链体的aav载体可以是人血清型aav载体。这样的人aav载体可以衍生自任何已知的血清型，例如衍生自血清型aav1-aav11中的任何一种。作为非限制性实例，aav载体可以是在aav1衍生的衣壳中包含aav1衍生的基因组的载体；aav2衍生的基因组中包含aav2衍生的基因组的载体；在aav4衍生的衣壳中包含aav4衍生的基因组的载体；在aav6衍生的衣壳中包含aav6衍生的基因组的载体或在aav9衍生的衣壳中包含aav9衍生的基因组的载体。在其他实施方案中，用于递送本发明的sirna双链体的aav载体可以是假型aav载体，其包含起源自至少两种不同的aav血清型的序列和/或组分。假型aav载体可以是包含衍生自一种aav血清型的aav基因组和至少部分衍生自不同的aav血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性实例，此类假型aav载体可以是在aav1衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav6衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav4衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav9衍生的衣壳中的aav2衍生的基因组。在其他实施方案中，aav载体可用于将sirna分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。在一些方面，用于递送本发明的sirna双链体的aav载体可以进一步包含修饰的衣壳，所述衣壳包括来自非病毒来源的肽。在其他方面，aav载体可包含cns特异性嵌合衣壳，以促进sirna双链体向脑和脊髓的递送。例如，可以构建来自显示cns向性的aav变体的cap核苷酸序列的比对，以鉴定可变区(vr)序列和结构。病毒基因组在一个实施方案中，如所示，aav颗粒包括具有有效载荷区的病毒基因组。病毒基因组大小在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是单链或双链病毒基因组。病毒基因组的大小可以是小、中、大或最大大小。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是小的单链病毒基因组。小的单链病毒基因组的大小可以是2.7至3.5kb，例如大小为约2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性实例，小的单链病毒基因组的大小可以是3.2kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是小的双链病毒基因组。小的双链病毒基因组的大小可以是1.3到1.7kb，例如大小为约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性实例，小的双链病毒基因组的大小可以是1.6kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是中等单链病毒基因组。中等单链病毒基因组的大小可以是3.6至4.3kb，例如大小为约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性实例，中等单链病毒基因组的大小可以是4.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是中等双链病毒基因组。中等双链病毒基因组的大小可以是1.8至2.1kb，例如大小为约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性实例，中等双链病毒基因组的大小可以是2.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是大的单链病毒基因组。大的单链病毒基因组的大小可以是4.4至6.0kb，例如大小为约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大的单链病毒基因组的大小可以是4.7kb。作为另一个非限制性实例，大的单链病毒基因组的大小可以是4.8kb。作为又一个非限制性实例，大的单链病毒基因组的大小可以是6.0kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。在一个实施方案中，包含本文所述的有效载荷的病毒基因组可以是大的双链病毒基因组。大的双链病毒基因组的大小可以是2.2至3.0kb，例如大小为约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大的双链病毒基因组的大小可以是2.4kb。另外，病毒基因组可包含启动子和polya尾。病毒基因组组分：反向末端重复序列(itr)本发明的aav颗粒包含具有至少一个itr区和有效载荷区的病毒基因组。在一实施方案中，病毒基因组具有两个itr。这两个itr位于有效载荷区域的5'和3'端侧翼。itr的功能是作为包含复制识别位点的复制起点。itr包含可以互补和对称排列的序列区。引入本发明的病毒基因组中的itr可以包含天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列。itr可以衍生自与衣壳相同的血清型，选自本文的任何血清型或其衍生物。itr可能与衣壳具有不同的血清型。在一个实施方案中，aav颗粒具有一个以上的itr。在非限制性实例中，aav颗粒具有包含两个itr的病毒基因组。在一个实施方案中，itr的血清型彼此相同。在另一个实施方案中，itr具有不同的血清型。非限制性实例包括具有与衣壳相同血清型的零个、一个或两个itr。在一个实施方案中，aav颗粒的病毒基因组的两个itr均为aav2itr。独立地，每个itr的长度可以是约100至约150个核苷酸。itr的长度可以为100-105个核苷酸，长度为106-110个核苷酸，长度为111-115个核苷酸，长度为116-120个核苷酸，长度为121-125个核苷酸，长度为126-130个核苷酸，长度为131-135个核苷酸，长度为136-140个核苷酸，长度为141-145个核苷酸或长度为146-150个核苷酸。在一个实施方案中，itr的长度为140-142个核苷酸。itr长度的非限制性实例是长度为102、140、141、142、145个核苷酸，以及与其具有至少95％同一性的核苷酸。在一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flipitr的5'端附近。在另一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flipitr的3'端附近。在又一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flopitr的5'端附近。在又一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flopitr的3'端附近。在一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flipitr的5'端和flopitr的3'端之间。在一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中flipitr的3'端和flipitr的5'端之间(例如，在flipitr的5'端与flopitr的3'端之间或在flopitr的3'端与flipitr的5'端之间的中间)。作为非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端下游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可以位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端下游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可以位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端上游1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端上游前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或多于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，其可位于表达载体中itr(例如flip或flopitr)5'或3'端下游前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％内。病毒基因组组分：启动子在一个实施方案中，病毒基因组的有效载荷区包含至少一个增强转基因靶标特异性和表达的元件(参见例如powell等，viralexpressioncassetteelementstoenhancetransgenetargetspecificityandexpressioningenetherapy，2015；其内容通过引用整体并入本文)。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性mirna、转录后调控元件(pre)、聚腺苷酸化(polya)信号序列和上游增强子(use)、cmv增强子和内含子。本领域技术人员可以认识到，本发明的多肽在靶细胞中的表达可能需要特定的启动子，包括但不限于物种特异性的、可诱导的、组织特异性的或细胞周期特异性的启动子(parr等人，nat.med.3：1145-9(1997)；其内容通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，当启动子驱动在aav颗粒的病毒基因组的有效载荷区中编码的多肽的表达时，认为该启动子是有效的。在一个实施方案中，启动子是被认为有效驱动调节性多核苷酸表达的启动子。在一个实施方案中，启动子是当其在靶向细胞中驱动表达时被认为是有效的启动子。在一个实施方案中，启动子驱动有效载荷在靶组织中表达一段时间。启动子驱动的表达的时间可以是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。在一个实施方案中，启动子驱动有效载荷的表达持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超过65年。启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。驱动或促进在大多数组织中表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α亚基(ef1α)、巨细胞病毒(cmv)即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)及其衍生的cag、β葡糖醛酸酶(gusb)或泛素c(ubc)。组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，例如但不限于肌肉特异性启动子、b细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或神经系统启动子，其可用于将表达限制于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。肌肉特异性启动子的非限制性例子包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(mck)启动子、哺乳动物结蛋白(des)启动子、哺乳动物肌钙蛋白i(tnni2)启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(aska)启动子(参见例如美国专利公开号us20110212529，其内容通过引用整体并入本文)神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇酶(nse)、血小板衍生的生长因子(pdgf)、血小板衍生的生长因子b链(pdgf-β)、突触蛋白(syn)，甲基-cpg结合蛋白2(mecp2)、ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)、代谢型谷氨酸受体2(mglur2)、轻神经丝(nfl)或重神经丝(nfh)、β-珠蛋白微基因nβ2、前脑啡肽原(ppe)、脑啡肽(enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(eaat2)启动子。星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性例子包括神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和eaat2启动子。少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓鞘碱性蛋白(mbp)启动子。在一个实施方案中，启动子可以小于1kb。启动子的长度可以为200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或多于800核苷酸。启动子的长度可以在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。在一个实施方案中，启动子可以是相同或不同的起始或亲本启动子的两种或更多种组分的组合，例如但不限于cmv和cba。每个组分的长度可以为200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、800或多于800。每个组分的长度可以在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。在一个实施方案中，启动子是382个核苷酸的cmv-增强子序列和260个核苷酸的cba-启动子序列的组合。在一个实施方案中，病毒基因组包含遍在启动子。遍在启动子的非限制性实例包括cmv、cba(包括衍生物cag、cbh等)、ef-1α、pgk、ubc、gusb(hgbp)和ucoe(hnrpa2b1-cbx3的启动子)。yu等人(molecularpain2011，7:63；其内容通过引用整体并入本文)使用慢病毒载体评估了在cag、efiα、pgk和ubc启动子下egfp在大鼠drg细胞和原代drg细胞中的表达并发现ubc的表达较其他3个启动子弱，并且所有启动子仅见到10-12％的胶质细胞表达。soderblom等人(e.neuro2015；其内容通过引用整体并入本文)评价了在运动皮层注射后，egfp在具有cmv和ubc启动子的aav8中和在具有cmv启动子的aav2中的表达。鼻内施用包含ubc或efiα启动子的质粒显示持续气道表达大于包含cmv启动子的表达(参见例如gill等人，genetherapy2001，vol.8，1539-1546；其内容通过引用整体并入本文)。husain等人(genetherapy2009；其内容通过引用整体并入本文)评估了具有hgusb启动子、hsv-1lat启动子和nse启动子的hβh构建体，并且发现该hβh构建体在小鼠脑中的表达较nse弱。passini和wolfe(j.virol.2001，12382-12392，其内容通过引用整体并入本文)评估了新生小鼠脑室内注射后hβh载体的长期作用，并发现存在至少一年的持续表达。xu等人(genetherapy2001，8，1323-1332；其内容通过引用整体并入本文)发现，与cmv-lacz、cmv-luc、ef、gfap、henk、nachr、ppe、ppe+wpre、nse(0.3kb)、nse(1.8kb)和nse(1.8kb+wpre)相比，使用nfl和nfh启动子时，在所有脑区域中表达都低。xu等人发现启动子活性的降序是nse(1.8kb)、ef、nse(0.3kb)、gfap、cmv、henk、ppe、nfl和nfh。nfl是一个650个核苷酸的启动子，并且nfh是一个920个核苷酸的启动子，二者在肝脏中都不存在，但nfh在感觉本体感受神经元、脑和脊髓中含量丰富，而nfh存在于心脏中。scn8a是一个470核苷酸的启动子，其在整个drg、脊髓和脑中表达，在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮层、丘脑和下丘脑中表达尤其高(参见例如，drews等人，identificationofevolutionaryconserved,functionalnoncodingelementsinthepromoterregionofthesodiumchannelgenescn8a，mammgenome(2007)18：723-731；和raymond等人，expressionofalternativelysplicedsodiumchannelα-subunitgenes,journalofbiologicalchemistry(2004)279(44)46234-46241；其内容通过引用整体并入本文)。由前述yu、soderblom、gill、husain、passini、xu、drews或raymond教导的任何启动子都可以用于本发明。在一个实施方案中，启动子不是细胞特异性的。在一个实施方案中，启动子是泛素c(ubc)启动子。ubc启动子的大小可以为300-350个核苷酸。作为非限制性实例，ubc启动子是332个核苷酸。在一个实施方案中，启动子是β-葡醛酸糖酶(gusb)启动子。gusb启动子的大小可以为350-400个核苷酸。作为非限制性实例，gusb启动子是378个核苷酸。在一个实施方案中，启动子是轻神经丝(nfl)启动子。nfl启动子的大小可以为600-700个核苷酸。作为非限制性实例，nfl启动子是650个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自互补的，并且aav可以是dj血清型。在一个实施方案中，启动子是重神经丝(nfh)启动子。nfh启动子的大小可以为900-950个核苷酸。作为非限制性实例，nfh启动子为920个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自互补的，并且aav可以是dj血清型。在一个实施方案中，启动子是scn8a启动子。scn8a启动子的大小可以为450-500个核苷酸。作为非限制性实例，scn8a启动子为470个核苷酸。作为非限制性实例，构建体可以是aav-启动子-cmv/珠蛋白内含子-调节性多核苷酸-rbg，其中aav可以是自身互补的，并且aav可以是dj血清型。在一个实施方案中，病毒基因组包含poliii启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含p1启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含fxn启动子。在一个实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶1(pgk)启动子。在一个实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一个实施方案中，启动子是cag启动子，其是包含与鸡β-肌动蛋白(cba)启动子融合的巨细胞病毒(cmv)增强子的构建体。在一个实施方案中，启动子是巨细胞病毒(cmv)启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含h1启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含u6启动子。在一个实施方案中，启动子是肝或骨骼肌启动子。肝启动子的非限制性实例包括人α-1-抗胰蛋白酶(haat)和甲状腺素结合珠蛋白(tbg)。骨骼肌启动子的非限制性实例包括结蛋白、mck或合成的c5-12。在一个实施方案中，启动子是rnapoliii启动子。作为非限制性实例，rnapoliii启动子是u6。作为非限制性实例，rnapoliii启动子是h1。在一个实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性实例，启动子是ef1α启动子和cmv启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5'utr内含子。增强子元件在本文中也称为“增强子”，可以是但不限于cmv增强子，启动子可以是但不限于cmv、cba、ubc、gusb、nse、突触蛋白、mecp2和gfap启动子并且5'utr/内含子可以是但不限于sv40和cba-mvm。作为非限制性实例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)cmv增强子、cmv启动子、sv405'utr内含子；(2)cmv增强子、cba启动子、sv405'utr内含子；(3)cmv增强子、cba启动子、cba-mvm5'utr内含子；(4)ubc启动子；(5)gusb启动子；(6)nse启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)mecp2启动子，(9)gfap启动子，(10)h1启动子；和(11)u6启动子。在一个实施方案中，病毒基因组包含工程化的启动子。在另一个实施方案中，病毒基因组包含来自天然表达的蛋白的启动子。病毒基因组组分：非翻译区(utr)根据定义，基因的野生型非翻译区(utr)被转录但不被翻译。通常，5'utr在转录起始位点开始并在起始密码子处终止，并且3'utr在终止密码子紧后开始并一直持续至转录终止信号。通常在特定靶器官的大量表达的基因中发现的特征可以被工程化为utr中以增强稳定性和蛋白生产。作为非限制性实例，来自肝脏中正常表达的mrna(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白a、载脂蛋白a/b/e、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子viii)的5'utr可用于本发明的aav颗粒的病毒基因组中，以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。尽管不希望受到理论的束缚，但是野生型5'非翻译区(utr)包括在翻译起始中起作用的特征。kozak序列通常已知参与核糖体由之启动许多基因翻译的过程，该序列通常包含在5'utr中。kozak序列具有共有的ccr(a/g)ccaugg，其中r是起始密码子(atg)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“g”。在一个实施方案中，病毒基因组中的5'utr包含kozak序列。在一个实施方案中，病毒基因组中的5'utr不包含kozak序列。尽管不希望受到理论的束缚，已知野生型3'utr具有嵌入其中的一段腺苷和尿苷。这些富含au的标记在具有高周转率的基因中特别普遍。基于其序列特征和功能性质，可将富含au的元件(are)分为三类(chen等人，1995，其内容通过引用整体并入本文)：i类are，例如，但不限于c-myc和myod，在富含u的区域内包含数个auuua基序的分散拷贝。ii类are，例如但不限于gm-csf和tnf-a，具有两个或多个重叠的uuauuua(u/a)(u/a)九聚体。iii类ares的定义不太明确，例如但不限于c-jun和肌形成蛋白。这些富含u的区域不包含auuua基序。已知大多数与are结合的蛋白都会使信使不稳定，而elav家族的成员(最引人注目的是hur)已被证明可以增加mrna的稳定性。hur结合所有三类are。将hur特异性结合位点工程化到核酸分子的3'utr中将导致hur结合，从而在体内稳定信使。引入、去除或修饰富含au元件(are)的3'utr可用于调节多核苷酸的稳定性。当工程化特定的多核苷酸，例如病毒基因组的有效载荷区时，可以引入一个或多个拷贝的are，以使多核苷酸的稳定性降低，并从而减少翻译并降低所得蛋白质的产量。同样，可以鉴定并去除或突变are，以增加细胞内稳定性，并从而增加所得蛋白质的翻译和产量。在一个实施方案中，病毒基因组的3'utr可包含寡聚(dt)序列，用于模板化添加poly-a尾。在一个实施方案中，病毒基因组可包含至少一个mirna种子、结合位点或全序列。microrna(或mirna或mir)是19-25个核苷酸的非编码rna，其结合核酸靶标的位点并通过降低核酸分子稳定性或抑制翻译来下调基因表达。microrna序列包含“种子”区，即成熟microrna的位置2-8的区域中的序列，该序列与核酸的mirna靶序列具有完美的沃森-克里克互补性。在一个实施方案中，可以对病毒基因组进行工程化以包括、改变或去除至少一个mirna结合位点、序列或种子区。来自本领域已知的任何基因的任何utr可以被引入到aav颗粒的病毒基因组中。可以将这些utr或其部分置于与从其选择它们的基因相同的方向，或者可以改变它们的方向或位置。在一个实施方案中，可以将aav颗粒的病毒基因组中使用的utr倒置、缩短、延长，用本领域已知的一种或多种其他5'utr或3'utr制成。如本文所用，术语“改变的”在涉及utr时表示相对于参考序列已经以某种方式改变了utr。例如，可以通过如上教导的方向或位置的改变来相对于野生型或天然utr改变3'或5'utr，或者可以通过包含额外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转座来改变3'或5'utr。在一个实施方案中，aav颗粒的病毒基因组包含至少一种不是野生型utr的变体的人工utr。在一个实施方案中，aav颗粒的病毒基因组包含utr，所述utr选自其蛋白具有共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。病毒基因组组分：聚腺苷酸化序列在一个实施方案中，本发明的aav颗粒的病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化序列。aav颗粒的病毒基因组可以在有效载荷编码序列的3'端与3'itr的5'端之间包含聚腺苷酸化序列。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列或“polya序列”的长度范围可以从不存在至约500个核苷酸。聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499和500个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-100个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-150个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-160个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-200个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-100个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-150个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-160个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-200个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-100个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-150个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-160个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-200个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-100个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-150个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-160个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-200个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-100个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-150个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-160个核苷酸。在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-200个核苷酸。在一个实施方案中，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。此外，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可以位于表达载体中启动子的下游，所述启动子例如但不限于cmv、u6、cag、cba或具有sv40内含子或人β珠蛋白内含子的cba启动子。作为非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，所述核酸序列可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，aav颗粒包含编码sirna分子的核酸序列，该核酸序列可位于表达载体中启动子的下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％。在一个实施方案中，aav颗粒包含兔珠蛋白聚腺苷酸化(polya)信号序列。在一个实施方案中，aav颗粒包含人生长激素聚腺苷酸化(polya)信号序列。病毒基因组组分：内含子在一个实施方案中，有效载荷区包括至少一个增强表达的元件，例如一个或多个内含子或其部分。内含子的非限制性实例包括mvm(67-97bp)、f.ix截短的内含子1(300bp)、β珠蛋白sd/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、sv40晚期剪接供体/剪接受体(19s/16s)(180bp)和杂合的腺病毒剪接供体/igg剪接受体(230bp)。在一个实施方案中，内含子或内含子部分的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可以介于80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含启动子，例如但不限于cmv或u6。作为非限制性实例，包含本发明的sirna分子的核酸序列的aav的启动子是cmv启动子。作为另一个非限制性实例，包含本发明的sirna分子的核酸序列的aav的启动子是u6启动子。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含cmv启动子。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含u6启动子。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含cmv和u6启动子。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含h1启动子。在一个实施方案中，aav病毒基因组可包含cba启动子。在一个实施方案中，编码的sirna分子可以位于表达载体中启动子的下游，所述启动子例如但不限于cmv、u6、h1、cba、cag或具有内含子如sv40或本领域已知的其他内含子的cba启动子。此外，编码的sirna分子还可以位于表达载体中聚腺苷酸化序列的上游。作为非限制性实例，编码的sirna分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或多于30个核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的sirna分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的1-5、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、10-15、10-20、10-25、10-30、15-20、15-25、15-30、20-25、20-30或25-30个核苷酸内。作为非限制性实例，编码的sirna分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％或大于25％的核苷酸内。作为另一个非限制性实例，编码的sirna分子可以位于表达载体中启动子下游和/或聚腺苷酸化序列上游的前1-5％、1-10％、1-15％、1-20％、1-25％、5-10％、5-15％、5-20％、5-25％、10-15％、10-20％、10-25％、15-20％、15-25％或20-25％。病毒基因组组分：填充序列在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为包装的最佳大小。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列，以减少载体基因组的发夹结构(例如，本文所述的调节性多核苷酸)在表达和/或包装过程中可能被读作反向末端重复序列(itr)的可能性。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，其长度约为0.1kb-3.8kb，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb或3.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为3.1kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为2.7kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。在一个实施方案中，病毒基因组是自互补(sc)病毒基因组，并且包含一个或多个填充序列，其长度约在0.1kb至1.5kb之间，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。在一个实施方案中，病毒基因组包含填充序列的任何部分。病毒基因组可包含填充序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为约4.6kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于5'itr序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3'itr序列的5'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'itr序列的3'，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5'，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'itr序列的3'，并且第二填充序列位于5'itr序列的5'。在一个实施方案中，病毒基因组是自互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于5'itr序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3'itr序列的5'。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'itr序列的3'，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5'，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3'。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5'itr序列的3'，并且第二填充序列位于5'itr序列的5'。在一个实施方案中，病毒基因组可以在病毒基因组的多个区域之一之间包含一个或多个填充序列。在一个实施方案中，填充区可以位于例如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(itr)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区的区域之前。在一个实施方案中，填充区可以位于例如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(itr)、启动子区域、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区的区域之后。在一个实施方案中，填充区可以位于例如但不限于有效载荷区、反向末端重复序列(itr)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区和/或外显子区之前和之后。在一个实施方案中，病毒基因组可包含一个或多个将病毒基因组的至少一个区域分叉的填充序列。病毒基因组的分叉区域可包含填充序列区5'的区域的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的10％位于填充序列的5’，并且该区域的90％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使该区域的20％位于填充序列的5’，并且该区域的80％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的30％位于填充序列的5'，并且该区域的70％位于填充序列的3'。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的40％位于填充序列的5'，并且该区域的60％位于填充序列的3'。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的50％位于填充序列的5’，并且该区域的50％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的60％位于填充序列的5’，并且该区域的40％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的70％位于填充序列的5’，并且该区域的30％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的80％位于填充序列的5'，并且该区域的20％位于填充序列的3'。作为非限制性实例，填充序列可分叉至少一个区域，使得该区域的90％位于填充序列的5’，并且该区域的10％位于填充序列的3’。在一个实施方案中，病毒基因组在5'itr之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效载荷区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在3'itr之前包含填充序列。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和启动子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和有效载荷区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5'itr和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和有效载荷区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之，例如但不限于启动子区和3'itr。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效载荷区和3'itr。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和3'itr。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和3'itr。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和3'itr。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于外显子区和3'itr。本发明的有效载荷本公开的aav颗粒包含至少一个有效载荷区。如本文所用，“有效载荷”或“有效载荷区”是指由病毒基因组编码或位于病毒基因组内的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区域，或此类多核苷酸或多核苷酸区域的表达产物，例如转基因、编码多肽或多重多肽的多核苷酸或调节性(modulatory)核酸或调节(regulatory)核酸。本发明的有效载荷通常编码调节性多核苷酸或其片段或变体。有效载荷区可以以反映类似于或镜像mrna的天然组织的区域的方式进行构建。有效载荷区可包含编码和非编码核酸序列的组合。在一些实施方案中，aav有效载荷区可以编码编码性rna或非编码性rna。在一个实施方案中，aav颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，该有效载荷区包含编码sirna、mirna或其他rnai剂的核酸序列。在这样的实施方案中，编码一种以上多肽的病毒基因组可以被复制，并包装到病毒颗粒中。用病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞内表达编码的sirna、mirna或其他rnai剂。调节性多核苷酸在一个实施方案中，可将调节性多核苷酸，例如rna或dna分子，用于治疗神经退行性疾病，特别是肌萎缩性侧索硬化症(als)。如本文所用，“调节性多核苷酸”是起到调节(增加或降低)靶基因的水平或量(例如mrna或蛋白质水平)的作用的任何核酸序列。在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含编码至少一种sirna分子的至少一种核酸序列。如果有一种以上，则核酸可以独立地编码1、2、3、4、5、6、7、8、9或多于9种的sirna分子。在一个实施方案中，分子支架可以位于cmv启动子、其片段或变体的下游。在一个实施方案中，分子支架可以位于cba启动子、其片段或变体的下游。在一个实施方案中，分子支架可以是位于cmv启动子下游的天然pri-mirna支架。作为非限制性实例，天然pri-mirna支架衍生自人mir155支架。在一个实施方案中，分子支架可以是位于cba启动子下游的天然pri-mirna支架。在一个实施方案中，通过比较pri-mirna中调节性多核苷酸的方法来确定分子支架和调节性多核苷酸的选择(参见例如，miniarikova等人,design,characterization,andleadselectionoftherapeuticmirnastargetinghuntingtinfordevelopmentofgenetherapyforhuntington’sdisease.moleculartherapy-nucleicacids(2016)5,e297和国际公开号wo2016102664描述的方法；其每个的内容通过引用整体并入本文)。为了评估调节性多核苷酸的活性，可以使用的分子支架是人pri-mirna支架(例如，mir155支架)，并且启动子可以是cmv。可以使用hek293t细胞和报道分子(例如，萤光素酶)在体外确定活性。为了评估调节性多核苷酸的最佳分子支架，将调节性多核苷酸用于具有cag启动子的pri-mirna支架中。将所述构建体与报道分子(例如，萤光素酶报道分子)以50ng共转染。以50ng共转染时敲低大于80％的构建体被认为是有效的。在一个方面，优选具有强引导链活性的构建体。分子支架可以通过ngs在hek293t细胞中进行加工，以确定引导过客比以及加工变异性。为了在体内评估分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在aav中(例如，血清型可以是aav5(参见例如wo2015060722中描述的方法和构建体，其内容通过引用整体并入本文))并施用于体内模型，并且可以在模型的不同区域(例如，组织区域)中确定引导-过客比、5'和3'端加工、引导链与过客链的比以及敲低。在一个实施方案中，通过比较天然pri-mirna和合成pri-mirna中的调节性多核苷酸的方法，来确定分子支架和调节性多核苷酸的选择。调节性多核苷酸可以但不限于靶向除外显子1外的外显子。为了评估调节性多核苷酸的活性，将分子支架与cba启动子一起使用。一方面，可以使用hek293t细胞、hela细胞和报道分子(例如，萤光素酶)在体外确定活性，并且敲低有效的调节性多核苷酸在测试的细胞中显示至少80％的sod1敲低。另外，被认为最有效的调节性多核苷酸显示低至无显著的过客链(p链)活性。在另一方面，通过使用hek293t细胞、hela细胞和报道分子的体外转染来评估内源性sod1敲低功效。有效的调节性多核苷酸显示大于50％的内源性sod1敲低。在另一方面，通过感染(例如，aav2)在不同细胞类型(例如，hek293、hela、原代星形胶质细胞、u251星形胶质细胞、sh-sy5y神经元细胞和来自als患者的成纤维细胞)中评估内源性sod1敲低功效。有效的调节性多核苷酸显示超过60％的内源性sod1敲低。为了在体内评估分子支架和调节性多核苷酸，将包含调节性多核苷酸的分子支架包装在aav中并施于体内模型，并且可以在模型的不同区域(例如组织区域)中确定引导-过客比、5'和3'端加工、过客和引导链的比和敲低。可以通过ngs从体内样品加工分子支架，以确定引导-过客比以及加工变异性。在一个实施方案中，使用以下性质中的至少一种设计调节性多核苷酸：环变体、种子错配/凸出/摆动变体、茎错配、环变体和附属茎错配变体(vassalstemmismatchvariant)、种子错配和基部茎错配变体、茎错配和基部茎错配变体、种子摆动和基部茎摆动变体或茎序列变体。本发明部分涉及用于治疗神经退行性疾病的rna干扰(rnai)诱导的基因表达抑制。提供靶向sod1基因的sirna双链体或dsrna。此类sirna双链体或dsrna可以沉默细胞(例如运动神经元)中sod1基因的表达，从而改善als的症状，例如运动神经元死亡和肌肉萎缩。sod1sirna可以在重组aav载体的多核苷酸中编码。可以将靶向特定mrna的sirna双链体或dsrna设计和合成为体外靶向sod1的靶多核苷酸的一部分，并引入细胞中以激活rnai过程。sirna分子本发明涉及用于治疗神经退行性疾病的rna干扰(rnai)诱导的基因表达抑制。本文提供了靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna(本文统称为“sirna分子”)。此类sirna双链体或编码的dsrna可减少或沉默细胞中的基因表达，例如但不限于中型多棘神经元、皮层神经元和/或星形胶质细胞。rnai(也称为转录后基因沉默(ptgs)、压制或共抑制)是转录后基因沉默过程，其中rna分子以序列特异性方式抑制基因表达，通常是通过引起特定mrna分子的破坏。rnai的活性组分是短/小的双链rna(dsrna)，称为小干扰rna(sirna)，其典型地含有15-30个核苷酸(例如，19至25、19至24或19至21个核苷酸)和2-核苷酸3'悬突并且与靶基因的核酸序列匹配。这些短的rna物种可能是由dicer介导的较大dsrna的裂解在体内天然产生的，并且它们在哺乳动物细胞中具有功能。天然表达的小rna分子，称为microrna(mirna)，通过调节mrna的表达引起基因沉默。包含mirna的rna诱导沉默复合物(risc)靶向与mirna的5'区域中的核苷酸2-7(其称为种子区域)和3'区域的其他碱基对呈现完美序列互补性的mrna。mirna介导的基因表达下调可能是由靶标mrna的切割、靶标mrna的翻译抑制或mrna衰减引起的。mirna靶向序列通常位于靶标mrna的3'-utr中。单个mirna可以靶向来自多种基因的100多个转录本，而一个mrna可以被不同的mirna靶向。靶向特定mrna的sirna双链体或dsrna可以在体外设计和合成，并引入细胞中以激活rnai过程。elbashir等证明了21个核苷酸的sirna双链体(称为小干扰rna)能够在哺乳动物细胞中实现有效且特异的基因敲低而不会诱导免疫应答(elbashirsm等人，nature，2001，411，494-498)。自这份初步报告发表以来，通过sirna进行转录后基因沉默迅速成为哺乳动物细胞中遗传分析的有力工具，并具有产生新疗法的潜力。在美国专利号9,169,483和9,181,544和国际专利公开号wo2015179525(其每一个的内容通过引用整体并入本文)中描述了设计用于靶向对抗编码引起多谷氨酰胺扩增疾病例如亨廷顿氏病的聚谷氨酰胺重复蛋白的核酸序列的rnai分子。美国专利号9,169,483和9,181,544以及国际专利公开号wo2015179525各自提供了分离的rna双链体，其包含第一链rna(例如15个连续核苷酸)和第二链rna(例如与第一条的至少12个连续核苷酸互补)，其中rna双链体的长度为约15至30个碱基对。第一链rna和第二链rna可以通过rna环(～4至50个核苷酸)有效地连接以形成发夹结构，该发夹结构可以插入表达盒中。环部分的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：9-14(其内容通过引用整体并入本文)。可用于(完整序列或部分序列)形成rna双链体的rna链的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：1-8和美国专利号9,181,544的seqidno：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221(其每一个的内容通过引用整体并入本文)。rnai分子的非限制性实例包括美国专利号9,169,483的seqidno：1-8，美国专利号9,181,544的seqidno：1-11、33-59、208-210、213-215和218-221，和国际专利公开号wo2015179525的seqidno：1、6、7和35-38(其每一个的内容通过引用整体并入本文)。可以将体外合成的sirna分子引入细胞以激活rnai。与内源dsrna相似，将外源sirna双链体引入细胞时，其可以组装形成rna诱导沉默复合物(risc)，这是一种多单位复合物，可与和sirna双链体的两条链之一互补的rna序列(即反义链)相互作用。在此过程中，sirna的有义链(或过客链)从复合物中丢失，而sirna的反义链(或引导链)与其互补rna匹配。尤其是，包含sirna的risc复合物的靶标是具有完美序列互补性的mrna。然后，通过切割、释放和降解靶标，发生sirna介导的基因沉默。与使用单链(ss)-sirna(例如反义链rna或反义寡核苷酸)相比，由与靶标mrna同源的有义链和与靶标mrna互补的反义链组成的sirna双链体在靶rna破坏的效率方面具有多得多的优势。在许多情况下，需要更高浓度的ss-sirna才能获得相应双链体的有效基因沉默能力。任何前述分子均可以由病毒基因组编码。靶向目的基因的sirna双链体的设计和序列本发明提供靶向mrna以干扰基因表达和/或蛋白生产的小干扰rna(sirna)双链体(和编码它们的调节性多核苷酸)。本发明的编码的sirna双链体包含杂交在一起形成双链体结构的反义链和有义链，其中反义链与靶基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5'端具有5'磷酸基团，并且有义链的3'端包含3'羟基。在其他方面，在每条链的3'端没有突出端、有一个核苷酸或2核苷酸的悬突。在本领域中已经提出了一些用于设计sirna的指南。这些指南通常建议生成一个19个核苷酸的双链区域、对称的2-3个核苷酸的3'悬突、5'-磷酸和3'-羟基，靶向要沉默的基因中的区域。其他可能影响sirna序列偏好的规则包括但不限于：(i)反义链5'端的a/u；(ii)有义链5'端的g/c；(ⅲ)反义链5'端三分之一中至少5个a/u残基；和(iv)不存在任何长度超过9个核苷酸的gc片段。根据这样的考虑以及靶基因的特定序列，可以容易地设计压制哺乳动物靶基因表达所必需的高效sirna分子。根据本发明，设计靶向目的基因的sirna分子(例如，sirna双链体或编码的dsrna)。这样的sirna分子可以特异性地压制基因表达和蛋白生产。在一些方面，设计sirna分子并用于选择性“敲除”细胞中的基因变体，即突变的转录物。在一些方面，设计sirna分子并用于选择性“敲低”细胞中的基因变体。在其他方面，sirna分子能够抑制或压制目的基因的野生型和突变形式。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起以形成双链体结构。反义链与靶标mrna序列具有足够的互补性以引导靶特异性rnai，即，sirna分子具有足以通过rnai机制或过程触发靶标mrna的破坏的序列。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构，并且其中与mrna杂交的起始位点在靶标mrna序列上的核苷酸10-1000之间。作为非限制性实例，起始位点可以在靶标mrna序列上的核苷酸10-20、20-30、30-40、40-50、60-70、70-80、80-90、90-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000之间。作为另一个非限制性实例，起始位点可以是靶标mrna序列上的核苷酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999和1000。在一些实施方案中，反义链和靶标mrna序列具有100％互补性。反义链可以与靶标mrna序列的任何部分互补。在其他实施方案中，反义链和靶标mrna序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶标mrna序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。在一个实施方案中，sirna或dsrna包含至少两条彼此互补的序列。根据本发明，sirna分子的长度为10-50个或更多个核苷酸，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，sirna分子的长度为约15-30个核苷酸，例如每条链15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域充分互补。在一个实施方案中，sirna分子的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的sirna分子可以是合成的rna双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸，并且在3'端具有两个悬突的核苷酸。在一些方面，sirna分子可以是未修饰的rna分子。在其他方面，sirna分子可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。在一个实施方案中，本发明的sirna分子可包含反义序列和有义序列，或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。在其他实施方案中，本发明的sirna分子可以在用于递送至细胞的质粒载体、aav颗粒、病毒基因组或其他核酸表达载体中编码。dna表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的sirna双链体或dsrna，并实现对靶基因表达的长期抑制。在一个方面，sirna双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹rna(shrna)的茎环结构的表达。发夹被dicer识别并切割，从而生成成熟的sirna分子。根据本发明，产生了包含编码靶向mrna的sirna分子的核酸的aav颗粒，aav血清型可以是本文列出的任何血清型。aav血清型的非限制性实例包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a、aav-php.b、aavphp.b2、aavphp.b3、aavphp.n/php.b-dgt、aavphp.b-est、aavphp.b-ggt、aavphp.b-atp、aavphp.b-att-t、aavphp.b-dgt-t、aavphp.b-ggt-t、aavphp.b-sgs、aavphp.b-aqp、aavphp.b-qqp、aavphp.b-snp(3)、aavphp.b-snp、aavphp.b-qgt、aavphp.b-nqt、aavphp.b-egs、aavphp.b-sgn、aavphp.b-egt、aavphp.b-dst、aavphp.b-dst、aavphp.b-stp、aavphp.b-pqp、aavphp.b-sqp、aavphp.b-qlp、aavphp.b-tmp、aavphp.b-ttp、aavphp.s/g2a12、aavg2a15/g2a3、aavg2b4、aavg2b5及其变体。在一些实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna压制(或降解)靶标mrna。因此，sirna双链体或编码的dsrna可用于基本上抑制细胞例如神经元中的基因表达。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，抑制可以是30-40％。作为非限制性实例，抑制可以是30-45％。作为非限制性实例，抑制可以是35-45％。作为非限制性实例，抑制可以大于50％。作为非限制性实例，抑制可以是50-60％。作为非限制性实例，抑制可以大于60％。作为非限制性实例，抑制可以是55-65％。作为非限制性实例，抑制可以是57-68％。作为非限制性实例，抑制可以是70-80％。作为非限制性实例，抑制可以是85-99％。作为非限制性实例，抑制可以是35％。作为非限制性实例，抑制可以是36％。作为非限制性实例，抑制可以是40％。作为非限制性实例，抑制可以是41％。作为非限制性实例，抑制可以是43％。作为非限制性实例，抑制可以是45％。作为非限制性实例，抑制可以是49％。作为非限制性实例，抑制可以是62％。作为非限制性实例，抑制可以是64％。作为非限制性实例，抑制可以是74％。作为非限制性实例，抑制可以是77％。作为非限制性实例，抑制可以是84％。作为非限制性实例，抑制可以是87％。作为非限制性实例，抑制可以是95％。作为非限制性实例，抑制可以是99％。作为非限制性实例，抑制可以是100％。在一个实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna压制(或降解)脊髓运动神经元中的靶标mrna。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％、99％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-45％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、35-45％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、55-65％、57-68％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、85-99％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，抑制可以是30-45％。作为非限制性实例，抑制可以是35-45％。作为非限制性实例，抑制可以大于50％。作为非限制性实例，抑制可以大于60％。作为非限制性实例，抑制可以是50-60％。作为非限制性实例，抑制可以是55-65％。作为非限制性实例，抑制可以是57-68％。作为非限制性实例，抑制可以是70-80％。作为非限制性实例，抑制可以是85-99％。作为非限制性实例，抑制可以是35％。作为非限制性实例，抑制可以是36％。作为非限制性实例，抑制可以是40％。作为非限制性实例，抑制可以是41％。作为非限制性实例，抑制可以是43％。作为非限制性实例，抑制可以是45％。作为非限制性实例，抑制可以是49％。作为非限制性实例，抑制可以是62％。作为非限制性实例，抑制可以是64％。作为非限制性实例，抑制可以是74％。作为非限制性实例，抑制可以是77％。作为非限制性实例，抑制可以是84％。作为非限制性实例，抑制可以是87％。作为非限制性实例，抑制可以是95％。作为非限制性实例，抑制可以是99％。作为非限制性实例，抑制可以是100％。在一个实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna将脊髓运动神经元中的靶标mrna压制(或降解)78％。在一个实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna将脊髓运动神经元中的靶标mrna压制(或降解)45-55％。在一个实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna压制(或降解)运动神经元形态的vg+细胞中的靶标mrna。在一些方面，基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、45-50％、45-55％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。在一个实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna将运动神经元形态的vg+细胞中的靶标mrna压制(或降解)53％。在一个实施方案中，sirna分子包含匹配位于引导链中的靶标的mirna种子。在另一个实施方案中，sirna分子包含匹配位于过客链中的靶标的mirna种子。在又一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna不包含匹配位于引导链或过客链中的靶标的种子。在一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna对于引导链可几乎没有显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna对过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna对过客链可具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在又一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna对于引导链或过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna对引导或过客链可具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或编码的dsrna可在体外具有高活性。在另一个实施方案中，sirna分子可在体外具有低活性。在又一个实施方案中，靶向目的基因的sirna双链体或dsrna可在体外具有高引导链活性和低过客链活性。在一个实施方案中，sirna分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的靶标敲低(kd)可以是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的靶标敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的靶标敲低(kd)大于70％。作为非限制性实例，引导链的靶标敲低(kd)大于60％。在一个实施方案中，设计sirna双链体，使得不存在与非目的基因序列的有义或反义序列匹配的mirna种子。在一个实施方案中，针对最接近脱靶的引导链的ic50大于100乘以针对中靶基因的引导链的ic50。作为非限制性实例，如果针对最接近脱靶的引导链的ic50大于100乘以针对靶标的引导链的ic50，则认为该sirna分子具有高的引导链选择性，用于体外抑制目的基因。在一个实施方案中，在体外或体内在至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间，引导链的5'加工在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少99％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少99％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少90％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少90％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少85％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少85％的时间在5'端具有正确的起点(n)。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比在体外或体内为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。引导与过客的比是指在pri-mirorna的细胞内加工后引导链与过客链的比。例如，80:20的引导与过客的比为每2条由前体加工而来的过客链将有8条引导链。作为非限制性实例，引导与过客链的比在体外为8：2。作为非限制性实例，引导与过客链的比在体内为8：2。作为非限制性实例，引导与过客链的比在体外为9：1。作为非限制性实例，引导与过客链的比在体内为9：1。在一个实施方案中，引导与过客(g：p)链的比的范围为1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95。作为非限制性实例，引导与过客的比的范围为1.3至99。作为非限制性实例，引导与过客的比的范围为10到99。在一个实施方案中，引导与过客(g：p)链的比为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。作为非限制性实例，引导与过客(g：p)链的比为11.5。作为一个非限制性实例，引导与过客(g：p)链的比为99。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于1。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于2。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于5。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于10。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于20。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于50。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于300。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为314。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比大于400。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为434。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为至少3：1。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为至少5：1。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为至少10：1。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为至少20：1。在一个实施方案中，表达的引导与过客(g：p)(也称为反义与有义)链的比为至少50：1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比在体外或体内为1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:10、2:9、2:8、2:7、2:6、2:5、2:4、2:3、2:2、2:1、3:10、3:9、3:8、3:7、3:6、3:5、3:4、3:3、3:2、3:1、4:10、4:9、4:8、4:7、4:6、4:5、4:4、4:3、4:2、4:1、5:10、5:9、5:8、5:7、5:6、5:5、5:4、5:3、5:2、5:1、6:10、6:9、6:8、6:7、6:6、6:5、6:4、6:3、6:2、6:1、7:10、7:9、7:8、7:7、7:6、7:5、7:4、7:3、7:2、7:1、8:10、8:9、8:8、8:7、8:6、8:5、8:4、8:3、8:2、8:1、9:10、9:9、9:8、9:7、9:6、9:5、9:4、9:3、9:2、9:1、10:10、10:9、10:8、10:7、10:6、10:5、10:4、10:3、10:2、10:1、1:99、5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10、95:5或99:1。过客与引导的比是指在pri-microrna的细胞内加工后过客链与引导链的比。例如，80:20的过客与引导的比为从前体加工的每2条引导链将有8条过客链。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体外为80:20。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体内为80:20。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体外为8：2。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体内为8：2。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体外为9：1。作为非限制性实例，过客与引导链的比在体内为9：1。在一个实施方案中，过客与引导(p：g)链的比的范围为1-99、1.3-99、5-99、10-99、15-99、20-99、25-99、30-99、35-99、40-99、45-99、50-99、55-99、60-99、65-99、70-99、75-99、80-99、85-99、90-99、95-99、1-10、1-15、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55、1-60、1-65、1-70、1-75、1-80、1-85、1-90、1-95、5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、10-15、10-20、10-25、10-30、10-35、10-40、10-45、10-50、10-55、10-60、10-65、10-70、10-75、10-80、10-85、10-90、10-95、15-20、15-25、15-30、15-35、15-40、15-45、15-50、15-55、15-60、15-65、15-70、15-75、15-80、15-85、15-90、15-95、20-25、20-30、20-35、20-40、20-45、20-50、20-55、20-60、20-65、20-70、20-75、20-80、20-85、20-90、20-95、25-30、25-35、25-40、25-45、25-50、25-55、25-60、25-65、25-70、25-75、25-80、25-85、25-90、25-95、30-35、30-40、30-45、30-50、30-55、30-60、30-65、30-70、30-75、30-80、30-85、30-90、30-95、35-40、35-45、35-50、35-55、35-60、35-65、35-70、35-75、35-80、35-85、35-90、35-95、40-45、40-50、40-55、40-60、40-65、40-70、40-75、40-80、40-85、40-90、40-95、45-50、45-55、45-60、45-65、45-70、45-75、45-80、45-85、45-90、45-95、50-55、50-60、50-65、50-70、50-75、50-80、50-85、50-90、50-95、55-60、55-65、55-70、55-75、55-80、55-85、55-90、55-95、60-65、60-70、60-75、60-80、60-85、60-90、60-95、65-70、65-75、65-80、65-85、65-90、65-95、70-75、70-80、70-85、70-90、70-95、75-80、75-85、75-90、75-95、80-85、80-90、80-95、85-90、85-95或90-95。在一个实施方案中，过客与引导(p：g)链的比为10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、31、31.5、32、32.5、33、33.5、34、34.5、35、35.5、36、36.5、37、37.5、38、38.5、39、39.5、40、40.5、41、41.5、42、42.5、43、43.5、44、44.5、45、45.5、46、46.5、47、47.5、48、48.5、49、49.5、50、50.5、51、51.5、52、52.5、53、53.5、54、54.5、55、55.5、56、56.5、57、57.5、58、58.5、59、59.5、60、60.5、61、61.5、62、62.5、63、63.5、64、64.5、65、65.5、66、66.5、67、67.5、68、68.5、69、69.5、70、70.5、71、71.5、72、72.5、73、73.5、74、74.5、75、75.5、76、76.5、77、77.5、78、78.5、79、79.5、80、80.5、81、81.5、82、82.5、83、83.5、84、84.5、85、85.5、86、86.5、87、87.5、88、88.5、89、89.5、90、90.5、91、91.5、92、92.5、93、93.5、94、94.5、95、95.5、96、96.5、97、97.5、98、98.5或99。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于2。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于5。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于10。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于20。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比大于50。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比为至少3：1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比为至少5：1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比为至少10：1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比至少为20：1。在一个实施方案中，表达的过客与引导(p：g)(也称为有义与反义)链的比为至少50：1。在一个实施方案中，当pri-microrna或pre-microrna通过本领域已知的和本文所述的方法证明在计算加工时表现出大于2倍的引导与过客链的比时，认为过客-引导链双链体是有效的。作为非限制性实例，测量加工时，pri-microrna或pre-microrna证明大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3到15倍、4到5倍、4到10倍、4到15倍、5到10倍、5到15倍、6到10倍、6到15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍的引导与过客的比。在一个实施方案中，编码dsrna的载体基因组包含占构建体全长的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％的序列。作为非限制性实例，载体基因组包含的序列为构建体全长序列的至少80％。在一个实施方案中，可通过靶向目的基因序列上的至少一个外显子，将sirna分子用于沉默目的基因的野生型或突变形式。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。靶向sod1基因的sirna双链体的设计与序列本发明提供靶向sod1mrna以干扰sod1基因表达和/或sod1蛋白生产的小干扰rna(sirna)双链体(及编码它们的调节性多核苷酸)。本发明的编码的sirna双链体包含杂交在一起形成双链体结构的反义链和有义链，其中反义链与靶sod1基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶sod1基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5'端具有5'磷酸基团，并且有义链的3'端包含3'羟基。在其他方面，在每条链的3'端没有悬突、有一个或有两个核苷酸的悬突。在本领域中已经提出了一些用于设计sirna的指南。这些指南通常建议生成一个19个核苷酸的双链区域、对称的2-3个核苷酸的3'悬突、5'-磷酸和3'-羟基，靶向要沉默的基因中的区域。其他可能影响sirna序列偏好的规则包括但不限于：(i)反义链5'端的a/u；(ii)有义链5'端的g/c；(ⅲ)反义链5'端三分之一中至少5个a/u残基；和(iv)不存在任何长度超过9个核苷酸的gc片段。根据这样的考虑以及靶基因的特定序列，可以容易地设计压制sod1基因表达所必需的高效sirna分子。根据本发明，设计靶向sod1基因的sirna分子(例如，sirna双链体或编码的dsrna)。这样的sirna分子可以特异性地压制sod1基因表达和蛋白生产。在一些方面，设计sirna分子并用于选择性“敲除”细胞中的sod1基因变体，即在患有als病的患者中鉴定的突变的sod1转录物。在一些方面，设计sirna分子并用于选择性“敲低”细胞中的sod1基因变体。在其他方面，sirna分子能够抑制或压制野生型和突变的sod1基因。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起形成双链体结构。反义链与sod1mrna序列具有足够的互补性以引导靶标特异性rnai，即，sirna分子具有足以通过rnai机制或过程触发靶标mrna的破坏的序列。在一个实施方案中，本发明的sirna分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起以形成双链体结构，并且其中与sod1mrna杂交的起始位点在sod1mrna序列上的核苷酸15-1000之间。作为非限制性实例，起始位点可以在sod1mrna序列上的核苷酸15-25、15-50、15-75、15-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-70、750-800、800-850、850-900、900-950和950-1000之间。作为另一个非限制性实例，起始位点可以是sod1mrna序列上的核苷酸26、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、74、76、77、78、149、153、157、160、177、192、193、195、196、197、198、199、206、209、210、239、241、261、263、264、268、269、276、278、281、284、290、291、295、296、316、317、329、330、337、350、351、352、354、357、358、364、375、378、383、384、390、392、395、404、406、417、418、469、470、475、476、480、487、494、496、497、501、504、515、518、522、523、524、552、554、555、562、576、577、578、579、581、583、584、585、587、588、589、593、594、595、596、597、598、599、602、607、608、609、610、611、612、613、616、621、633、635、636、639、640、641、642、643、644、645、654、660、661、666、667、668、669、673、677、692、698、699、700、701、706、749、770、772、775、781、800、804、819、829、832、833、851、854、855、857、858、859、861、869、891、892、906、907、912、913、934、944和947。在一些实施方案中，反义链和靶标sod1mrna序列具有100％互补性。反义链可以与靶标sod1mrna序列的任何部分互补。在其他实施方案中，反义链和靶标sod1mrna序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链和靶标sod1mrna序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。在一个实施方案中，靶向sod1的sirna或dsrna包含至少两条彼此互补的序列。根据本发明，靶向sod1的sirna分子的长度为约10-50个或更多个核苷酸，即，每条链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，sirna分子的长度为约15-30个核苷酸，例如每条链15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域充分互补。在一个实施方案中，sirna分子的每条链的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为19个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为20个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为21个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为22个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为23个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为24个核苷酸。在一个实施方案中，sirna分子的至少一条链的长度为25个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可以是合成的rna双链体，其包含约19个核苷酸至约25个核苷酸以及在3'端的两个悬突的核苷酸。在一些方面，sirna分子可以是未修饰的rna分子。在其他方面，sirna分子可包含至少一个修饰的核苷酸，例如碱基、糖或骨架修饰。在一个实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表2中的反义(引导)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，用于本发明的sirna分子的反义序列为表2中的核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，用于本发明的sirna分子的反义序列包含表2中的核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续的核苷酸。作为又一个非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的反义序列包含表2中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。表2.反义序列反义id序列序列号a-4000ucaccacaagccaaacgacuu5a-4001ugauuaaagugaggaccuguu6a-4002uauuaaagugaggaccugcuu7a-4003uacaccacaagccaaacgauu8a-4004gauuaaagugaggaccugcuu9a-4005ucaccacaagccaaacgacuuu10a-4006ugccagcagucacauugccuu11a-4007uaacagaugaguuaagggguu12a-4008uauuaaagugaggaccugcdtdt13a-4009uacaccacaagccaaacgadtdt14a-4010uuguuuauugggcgaucccdtdt15a-4011uguuuauugggcgaucccadtdt16a-4012ucaccacaagccaaacgacdtdt17a-4013ugauuaaagugaggaccugdtdt18a-4014uuuuauugggcgaucccaadtdt19a-4015ugucagcagucacauugccdtdt20a-4016ugcgaucccaauuacaccadtdt21在一个实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可包含核苷酸序列，例如但不限于表3中的有义(过客)序列或其片段或变体。作为非限制性实例，用于本发明的sirna分子的有义序列为表3中核苷酸序列的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％。作为另一个非限制性实例，用于本发明的sirna分子的有义序列包含表3中核苷酸序列的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或多于21个连续的核苷酸。作为又一个非限制性实例，在本发明的sirna分子中使用的有义序列包含表3中序列的核苷酸1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、2至22、2至21、2至20、2至19、2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、3至22、3至21、3至20、3至19、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、4至22、4至21、4至20、4至19、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、5至22、5至21、5至20、5至19、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、6至22、6至21、6至20、6至19、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至22、7至21、7至20、7至19、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、8至22、8至21、8至20、8至19、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、9至22、9至21、9至20、9至19、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、10至22、10至21、10至20、10至19、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、11至22、11至21、11至20、11至19、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、12至22、12至21、12至20、12至19、12至18、12至17、12至16、13至22、13至21、13至20、13至19、13至18、13至17、13至16、14至22、14至21、14至20、14至19、14至18、14至17、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、16至22、16至21、16至20、17至22、17至21或18至22。表3.有义序列在一个实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可包含来自表2的反义序列和来自表3的有义序列，或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列和有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％的互补性。在一个实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可包含表4中所述的有义和反义sirna双链体。作为非限制性实例，可以测试这些sirna双链体对内源性sod1基因表达的体外抑制活性。表4.sod1dsrna的有义和反义链序列在其他实施方案中，本发明的靶向sod1的sirna分子可以在用于递送至细胞的质粒载体、aav颗粒、病毒基因组或其他核酸表达载体中编码。dna表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的靶向sod1的sirna双链体或dsrna，并实现对靶基因表达的长期抑制。在一个方面，sirna双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹rna(shrna)的茎环结构的表达。发夹被dicer识别并切割，从而生成成熟的sirna分子。根据本发明，产生了包含编码靶向sod1mrna的sirna分子的核酸的aav颗粒，aav血清型可以是本文列出的任何血清型。aav血清型的非限制性实例包括aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8、aav-dj、aav-php.a和/或aav-php.b、aavphp.b2、aavphp.b3、aavphp.n/php.b-dgt、aavphp.b-est、aavphp.b-ggt、aavphp.b-atp、aavphp.b-att-t、aavphp.b-dgt-t、aavphp.b-ggt-t、aavphp.b-sgs、aavphp.b-aqp、aavphp.b-qqp、aavphp.b-snp(3)、aavphp.b-snp、aavphp.b-qgt、aavphp.b-nqt、aavphp.b-egs、aavphp.b-sgn、aavphp.b-egt、aavphp.b-dst、aavphp.b-dst、aavphp.b-stp、aavphp.b-pqp、aavphp.b-sqp、aavphp.b-qlp、aavphp.b-tmp、aavphp.b-ttp、aavphp.s/g2a12、aavg2a15/g2a3、aavg2b4、aavg2b5及其变体。在一些实施方案中，本发明的sirna双链体或编码的dsrna压制(或降解)sod1mrna。因此，sirna双链体或编码的dsrna可用于基本上抑制细胞中sod1基因的表达。在一些方面，sod1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。根据本发明，设计sirna分子并测试其降低培养细胞中sod1mrna水平的能力。此类sirna分子可以形成双链体，例如但不限于表4中列出的那些。作为非限制性实例，sirna双链体可以是sirna双链体id：d-4000至d-4025。在一个实施方案中，sirna分子包含匹配位于引导链中的sod1的mirna种子。在另一个实施方案中，sirna分子包含匹配位于过客链中的sod1的mirna种子。在又一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna不包含匹配位于引导链或过客链中的sod1的种子。在一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna对于引导链可几乎没有显著的全长脱靶效应。在另一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna对过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna对过客链可具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在又一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna对于引导链或过客链可几乎没有显著的全长脱靶效应。靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna对引导或过客链可具有少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、1-5％、2-6％、3-7％、4-8％、5-9％、5-10％、6-10％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、15-30％、15-40％、15-45％、20-40％、20-50％、25-50％、30-40％、30-50％、35-50％、40-50％、45-50％的全长脱靶效应。在一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或编码的dsrna可在体外具有高活性。在另一个实施方案中，sirna分子可在体外具有低活性。在又一个实施方案中，靶向sod1基因的sirna双链体或dsrna可在体外具有高引导链活性和低过客链活性。在一个实施方案中，靶向sod1的sirna分子在体外具有高引导链活性和低过客链活性。引导链的靶标敲低(kd)可以是至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或100％。引导链的靶标敲低可以是40-50％、45-50％、50-55％、50-60％、60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、60-99％、60-99.5％、60-100％、65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、65-99％、65-99.5％、65-100％、70-75％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、70-99％、70-99.5％、70-100％、75-80％、75-85％、75-90％、75-95％、75-99％、75-99.5％、75-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-99.5％、80-100％、85-90％、85-95％、85-99％、85-99.5％、85-100％、90-95％、90-99％、90-99.5％、90-100％、95-99％、95-99.5％、95-100％、99-99.5％、99-100％或99.5-100％。作为非限制性实例，引导链的靶标敲低(kd)大于70％。作为非限制性实例，引导链的靶标敲低(kd)大于60％。在一个实施方案中，设计靶向sod1的sirna双链体，使得不存在与非sod1序列的有义或反义序列匹配的mirna种子。在一个实施方案中，针对最接近脱靶的靶向sod1的sirna双链体中引导链的ic50大于100乘以针对中靶基因sod1的引导链的ic50。作为非限制性实例，如果针对最接近脱靶的引导链的ic50大于100乘以针对靶标的引导链的ic50，则认为sirna分子具有高引导链选择性用于体外抑制sod1。在一个实施方案中，在体外或体内在至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的时间，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少99％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少99％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少90％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少90％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体外在至少85％的时间在5'端具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，引导链的5'加工是精确的，并且在体内在至少85％的时间在5'端具有正确的起点(n)。在一个实施方案中，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端在75-95％、75-90％、75-85％、75-80％、80-95％、80-90％、80-85％、85-95％、85-90％或90-95％的范围内具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端在75-95％的范围内具有正确的起点(n)。在一个实施方案中，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端对于75％、75.1％、75.2％、75.3％、75.4％、75.5％、75.6％、75.7％、75.8％、75.9％、76％、76.1％、76.2％、76.3％、76.4％、76.5％、76.6％、76.7％、76.8％、76.9％、77％、77.1％、77.2％、77.3％、77.4％、77.5％、77.6％、77.7％、77.8％、77.9％、78％、78.1％、78.2％、78.3％、78.4％、78.5％、78.6％、78.7％、78.8％、78.9％、79％、79.1％、79.2％、79.3％、79.4％、79.5％、79.6％、79.7％、79.8％、79.9％、80％、80.1％、80.2％、80.3％、80.4％、80.5％、80.6％、80.7％、80.8％、80.9％、81％、81.1％、81.2％、81.3％、81.4％、81.5％、81.6％、81.7％、81.8％、81.9％、82％、82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％、82.6％、82.7％、82.8％、82.9％、83％、83.1％、83.2％、83.3％、83.4％、83.5％、83.6％、83.7％、83.8％、83.9％、84％、84.1％、84.2％、84.3％、84.4％、84.5％、84.6％、84.7％、84.8％、84.9％、85％、85.1％、85.2％、85.3％、85.4％、85.5％、85.6％、85.7％、85.8％、85.9％、86％、86.1％、86.2％、86.3％、86.4％、86.5％、86.6％、86.7％、86.8％、86.9％、87％、87.1％、87.2％、87.3％、87.4％、87.5％、87.6％、87.7％、87.8％、87.9％、88％、88.1％、88.2％、88.3％、88.4％、88.5％、88.6％、88.7％、88.8％、88.9％、89％、89.1％、89.2％、89.3％、89.4％、89.5％、89.6％、89.7％、89.8％、89.9％、90％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、91％、91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％、91.6％、91.7％、91.8％、91.9％、92％、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％、92.6％、92.7％、92.8％、92.9％、93％、93.1％、93.2％、93.3％、93.4％、93.5％、93.6％、93.7％、93.8％、93.9％、94％、94.1％、94.2％、94.3％、94.4％、94.5％、94.6％、94.7％、94.8％、94.9％或95％的表达的构建体具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端对于81％的表达的构建体具有正确的起点(n)。作为非限制性实例，靶向sod1的sirna双链体的引导链的5'加工在5'端对于90％的表达的构建体具有正确的起点(n)。在一个实施方案中，当pri-microrna或pre-microrna通过本领域已知的和本文所述的方法证明在测量加工时大于2倍的引导链与过客链比时，认为针对sod1的过客-引导链双链体是有效的。作为非限制性实例，测量加工时，pri-microrna或pre-microrna证明大于2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或2至5倍、2至10倍、2至15倍、3至5倍、3至10倍、3至15倍、4至5倍、4至10倍、4至15倍、5至10倍、5至15倍、6至10倍、6至15倍、7至10倍、7至15倍、8至10倍、8至15倍、9至10倍、9至15倍、10至15倍、11至15倍、12至15倍、13至15倍或14至15倍的引导与过客链的比。在一个实施方案中，可通过靶向sod1序列上的至少一个外显子，将sirna分子用于沉默野生型或突变型sod1。外显子可以是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、外显子18、外显子19、外显子20、外显子21、外显子22、外显子23、外显子24、外显子25、外显子26、外显子27、外显子28、外显子29、外显子30、外显子31、外显子32、外显子33、外显子34、外显子35、外显子36、外显子37、外显子38、外显子39、外显子40、外显子41、外显子42、外显子43、外显子44、外显子45、外显子46、外显子47、外显子48、外显子49、外显子50、外显子51、外显子52、外显子53、外显子54、外显子55、外显子56、外显子57、外显子58、外显子59、外显子60、外显子61、外显子62、外显子63、外显子64、外显子65、外显子66和/或外显子67。在一个实施方案中，引导链占mirna的总内源库的范围为0.001-0.6％、0.005-0.6％、0.01-0.6％、0.015-0.6％、0.02-0.6％、0.025-0.6％、0.03-0.6％、0.035-0.6％、0.04-0.6％、0.045-0.6％、0.05-0.6％、0.055-0.6％、0.06-0.6％、0.065-0.6％、0.07-0.6％、0.075-0.6％、0.08-0.6％、0.085-0.6％、0.09-0.6％、0.095-0.6％、0.1-0.6％、0.15-0.6％、0.2-0.6％、0.25-0.6％、0.3-0.6％、0.35-0.6％、0.4-0.6％、0.45-0.6％、0.5-0.6％、0.55-0.6％、0.001-0.5％、0.005-0.5％、0.01-0.5％、0.015-0.5％、0.02-0.5％、0.025-0.5％、0.03-0.5％、0.035-0.5％、0.04-0.5％、0.045-0.5％、0.05-0.5％、0.055-0.5％、0.06-0.5％、0.065-0.5％、0.07-0.5％、0.075-0.5％、0.08-0.5％、0.085-0.5％、0.09-0.5％、0.095-0.5％、0.1-0.5％、0.15-0.5％、0.2-0.5％、0.25-0.5％、0.3-0.5％、0.35-0.5％、0.4-0.5％、0.45-0.5％、0.001-0.4％、0.005-0.4％、0.01-0.4％、0.015-0.4％、0.02-0.4％、0.025-0.4％、0.03-0.4％、0.035-0.4％、0.04-0.4％、0.045-0.4％、0.05-0.4％、0.055-0.4％、0.06-0.4％、0.065-0.4％、0.07-0.4％、0.075-0.4％、0.08-0.4％、0.085-0.4％、0.09-0.4％、0.095-0.4％、0.1-0.4％、0.15-0.4％、0.2-0.4％、0.25-0.4％、0.3-0.4％、0.35-0.4％、0.001-0.3％、0.005-0.3％、0.01-0.3％、0.015-0.3％、0.02-0.3％、0.025-0.3％、0.03-0.3％、0.035-0.3％、0.04-0.3％、0.045-0.3％、0.05-0.3％、0.055-0.3％、0.06-0.3％、0.065-0.3％、0.07-0.3％、0.075-0.3％、0.08-0.3％、0.085-0.3％、0.09-0.3％、0.095-0.3％、0.1-0.3％、0.15-0.3％、0.2-0.3％、0.25-0.3％、0.001-0.2％、0.005-0.2％、0.01-0.2％、0.015-0.2％、0.02-0.2％、0.025-0.2％、0.03-0.2％、0.035-0.2％、0.04-0.2％、0.045-0.2％、0.05-0.2％、0.055-0.2％、0.06-0.2％、0.065-0.2％、0.07-0.2％、0.075-0.2％、0.08-0.2％、0.085-0.2％、0.09-0.2％、0.095-0.2％、0.1-0.2％、0.15-0.2％、0.001-0.1％、0.005-0.1％、0.01-0.1％、0.015-0.1％、0.02-0.1％、0.025-0.1％、0.03-0.1％、0.035-0.1％、0.04-0.1％、0.045-0.1％、0.05-0.1％、0.055-0.1％、0.06-0.1％、0.065-0.1％、0.07-0.1％、0.075-0.1％、0.08-0.1％、0.085-0.1％、0.09-0.1％或0.095-0.1％。作为非限制性实例，该范围是0.06-0.6％。作为非限制性实例，该范围是0.4-0.5％。在一个实施方案中，引导链占mirna的总内源库的百分比为0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％、0.009％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或0.6％。作为非限制性实例，该百分比为0.06％。作为非限制性实例，该百分比为0.4％。作为非限制性实例，该百分比为0.5％。sirna修饰在一些实施方案中，本发明的sirna分子当不作为前体或dna递送时，可以被化学修饰以调节rna分子的某些特征，例如但不限于增加sirna的体内稳定性。化学修饰的sirna分子可用于人类治疗应用中，并且得到改进而不损害sirna分子的rnai活性。作为非限制性实例，在有义链和反义链两者的3'和5'端两端修饰sirna分子。在一些方面，本发明的sirna双链体可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如但不限于糖修饰的核苷酸、核碱基修饰和/或骨架修饰。在一些方面，sirna分子可包含组合的修饰，例如组合的核碱基和骨架修饰。在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是糖修饰的核苷酸。糖修饰的核苷酸包括但不限于2'-氟、2'-氨基和2'-硫代修饰的核糖核苷酸，例如2'-氟修饰的核糖核苷酸。修饰的核苷酸可以在糖部分以及具有不是核糖基的糖或其类似物的核苷酸上进行修饰。例如，糖部分可以是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4'-硫代核糖和其他糖、杂环或碳环。在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是核碱基修饰的核苷酸。在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以是骨架修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的sirna双链体可以进一步在骨架上包含其他修饰。如本文所用，正常的“骨架”是指dna或rna分子中重复交替的糖-磷酸序列。脱氧核糖/核糖糖在3'-羟基和5'-羟基处均与酯键中的磷酸基团连接，也称为“磷酸二酯”键/接头(po键)。po骨架可以被修饰为“硫代磷酸酯”骨架(ps键)。在某些情况下，天然磷酸二酯键可以被酰胺键取代，但两个糖单元之间的四个原子仍保留。此类酰胺修饰可促进寡核苷酸的固相合成，并增加与sirna补体形成的双链体的热力学稳定性。参见例如，mesmaeker等人，pure&appl.chem.，1997，3，437-440；其内容通过引用整体并入本文。修饰的碱基是指已经通过取代或添加一个或多个原子或基团修饰的核苷酸碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和辫苷。核碱基部分的修饰的一些例子包括但不限于单独或组合的烷基化的、卤代的、硫醇化的、胺化的、酰胺化的或乙酰化的碱基。更具体的例子包括例如5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、n,n,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和其他在5位有修饰的核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸如7-脱氮腺苷、6-氮尿苷(6-azouridine)、6-氮胞苷(6-azocytidine)、6-氮胸苷(6-azothymidine)、5-甲基-2-硫代尿苷、其他硫代碱基如2-硫代尿苷和4-硫代尿苷和2-硫代胞苷、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷(archaeosine)、萘基和取代的萘基、任何o-烷基化和n-烷基化的嘌呤和嘧啶如n6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧代乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和修饰的苯基如氨基苯酚或2,4,6-三甲氧基苯、充当g-夹核苷酸的修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶(azapyrimidine)、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。在一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在有义链上。在另一个实施方案中，修饰的核苷酸可以仅在反义链上。在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以在有义链和反义链两者上。在一些实施方案中，化学修饰的核苷酸不影响反义链与靶标mrna序列配对的能力。在一个实施方案中，包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可以编码作为多顺反子分子的sirna分子。sirna分子可另外包含在sirna分子的区域之间的一个或多个接头。分子支架在一个实施方案中，可以在还包含分子支架的调节性多核苷酸中编码sirna分子。如本文所用，“分子支架”是框架或起始分子，其形成用于设计或制备后续分子所依据的序列或结构基础。在一个实施方案中，分子支架包含至少一个5'侧翼区。作为非限制性实例，5'侧翼区可包含5'侧翼序列，其可以具有任何长度，并且可以全部或部分衍生自野生型microrna序列或是完全人工的序列。在一个实施方案中，分子支架包含至少一个3'侧翼区。作为非限制性实例，3'侧翼区可包含3'侧翼序列，其可以具有任何长度，并且可以全部或部分衍生自野生型microrna序列或是完全人工的序列。在一个实施方案中，分子支架包含至少一个环基序区。作为非限制性实例，环基序区可包含任何长度的序列。在一个实施方案中，分子支架包含5'侧翼区，环基序区和/或3'侧翼区。在一个实施方案中，本文所述的至少一种sirna、mirna或其他rnai剂可以由调节性多核苷酸编码，所述调节性多核苷酸还可包含至少一种分子支架。分子支架可包含5'侧翼序列，其可以是任何长度，并且可以全部或部分衍生自野生型microrna序列或是完全人工的。3'侧翼序列可以在大小和来源上镜像了5'侧翼序列和/或3'侧翼序列。侧翼序列可都不存在。3'侧翼序列可任选地包含一个或多个cnnc基序，其中“n”代表任何核苷酸。形成茎环结构的茎是编码本文所述的至少一种sirna、mirna或其他rnai剂的调节性多核苷酸的最低要求。在一些实施方案中，本文所述的sirna、mirna或其他rnai剂包含至少一个核酸序列，该核酸序列与靶序列部分互补或将与靶序列杂交。在一些实施方案中，有效载荷是sirna分子或sirna分子的片段。在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环结构的5'臂包含编码有义序列的核酸序列。表3中描述了可以由调节性多核苷酸编码的有义序列或其片段或变体的非限制性实例。在一些实施方案中，调节性多核苷酸的茎环的3'臂包含编码反义序列的核酸序列。在一些情况下，反义序列在最5'端包含“g”核苷酸。表2中描述了可以由调节性多核苷酸编码的反义序列或其片段或变体的非限制性实例。在其他实施方案中，有义序列可位于调节性多核苷酸的茎环结构的茎的3'臂上，而反义序列位于5'臂上。表2和表3描述了可以由调节性多核苷酸编码的有义和反义序列的非限制性实例。在一个实施方案中，有义和反义序列可以在其长度的一大部分上完全互补。在其他实施方案中，有义序列和反义序列可以独立地在链长度的至少50、60、70、80、85、90、95或99％上具有至少70％、80％、90％、95％或99％的互补性。有义序列的同一性或反义序列的同源性都不需要与靶序列100％互补。在一个实施方案中，分离调节性多核苷酸的茎环结构的有义和反义序列的是环序列(也称为环基序、接头或接头基序)。环序列可以具有任何长度，在4-30个核苷酸之间，在4-20个核苷酸之间，在4-15个核苷酸之间，在5-15个核苷酸之间，在6-12个核苷酸之间，6个核苷酸，7个核苷酸，8个核苷酸，9个核苷酸之间，10个核苷酸，11个核苷酸，12个核苷酸，13个核苷酸，14个核苷酸和/或15个核苷酸。在一些实施方案中，环序列包含编码至少一个ugug基序的核酸序列。在一些实施方案中，编码ugug基序的核酸序列位于环序列的5'端。在一个实施方案中，间隔区可以存在于调节性多核苷酸中，以将一个或多个模块(例如5'侧翼区、环基序区、3'侧翼区、有义序列、反义序列)彼此分开。可能存在一个或多个这样的间隔区。在一个实施方案中，有义序列和侧翼区序列之间可以存在介于8-20之间，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区。在一个实施方案中，间隔区的长度是13个核苷酸，并且位于有义序列的5'端和侧翼序列的3'端之间。在一个实施方案中，间隔区具有足够的长度以形成序列的大约一个螺旋转角。在一个实施方案中，反义序列和侧翼序列之间可以存在介于8-20之间，即8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的间隔区。在一个实施方案中，间隔序列介于10-13个核苷酸之间，即10、11、12或13个核苷酸，并且位于反义序列的3'端和侧翼序列的5'端之间。在一个实施方案中，间隔区具有足够的长度以形成序列的大约一个螺旋转角。在一个实施方案中，调节性多核苷酸的分子支架在5'至3'方向上包含5'侧翼序列、5'臂、环基序、3'臂和3'侧翼序列。作为非限制性实例，5'臂可包含编码有义序列的核酸序列，并且3'臂包含编码反义序列的核酸序列。在另一个非限制性实例中，5'臂包含编码反义序列的核酸序列，并且3'臂包含编码有义序列的核酸序列。在一个实施方案中，可以改变5'臂、有义和/或反义序列、环基序和/或3'臂序列(例如，取代1个或更多个核苷酸、添加核苷酸和/或缺失核苷酸)。改变可引起构建体功能的有益变化(例如，增加靶序列的敲低、减少构建体的降解、减少脱靶效应、增加有效载荷的效率并减少有效载荷的降解)。在一个实施方案中，将调节性多核苷酸的分子支架进行比对，以使引导链(在本文中也称为反义链)的切除率大于过客链(在本文中也称为有义链)。引导或过客链的切除率可以分别为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。作为非限制性实例，引导链的切除率为至少80％。作为另一个非限制性实例，引导链的切除率为至少90％。在一个实施方案中，引导链的切除率大于过客链的切除率。在一个方面，引导链的切除率可以比过客链高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或99％以上。在一个实施方案中，引导链的切除效率为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或大于99％。作为非限制性实例，引导链的切除效率大于80％。在一个实施方案中，从分子支架上切除引导链的效率大于从分子支架上切除过客链的效率。从分子支架切除引导链的效率可以比从分子支架切除过客链的效率高2、3、4、5、6、7、8、9、10或10倍以上。在一个实施方案中，分子支架包含双功能靶向调节性多核苷酸。如本文所用，“双功能靶向”调节性多核苷酸是这样的多核苷酸，其中引导链和过客链都敲低相同的靶标，或者引导链和过客链都敲低不同的靶标。在一个实施方案中，本文所述的调节性多核苷酸的分子支架可包含5'侧翼区、环基序区和3'侧翼区。在本文所述的调节性多核苷酸中可以使用的5'侧翼区、环基序区(也可以称为接头区)和3'侧翼区或其片段的序列的非限制性实例如表5–7所示。表5.分子支架的5'侧翼区表6.分子支架的环基序区表7.分子支架的3'侧翼区在一个实施方案中，分子支架可包含表5中列出的至少一个5'侧翼区、其片段或变体。作为非限制性实例，5'侧翼区可以是5f1、5f2或5f3。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5f1侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5f2侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个5f3侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含表6中列出的至少一个环基序区、其片段或变体。作为非限制性实例，环基序区可以是l1、l2、l3或l4。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个l1环基序区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个l2环基序区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个l3环基序区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个l4环基序区。在一个实施方案中，分子支架可包含表7中列出的至少一个3'侧翼区、其片段或变体。作为非限制性实例，3'侧翼区可以是3f1、3f2、3f3、3f4或3f5。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3f1侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3f2侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3f3侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3f4侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含至少一个3f5侧翼区。在一个实施方案中，分子支架可包含如表5和6中所述的至少一个5'侧翼区、其片段或变体，以及至少一个环基序区、其片段或变体。作为限制性实例，5'侧翼区和环基序区可以是5f1和l1、5f1和l2、5f1和l3、5f1和l4、5f2和l1、5f2和l2、5f2和l3、5f2和l4、5f3和l1、5f3和l2、5f3和l3以及5f3和l4。在一个实施方案中，分子支架可包含如表6和7中所述的至少一个3'侧翼区、其片段或变体，以及至少一个环基序区、其片段或变体。作为非限制性实例，3'侧翼区和环基序区可以是3f1和l1、3f1和l2、3f1和l3、3f1和l4、3f2和l1、3f2和l2、3f2和l3、3f2和l4、3f3和l1、3f3和l2、3f3和l3、3f3和l4、3f4和l1、3f4和l2、3f4和l3、3f4和l4、3f5和l1、3f5和l2、3f5和l3以及3f5和l4。在一个实施方案中，分子支架可包含如表5和7中所述的至少一个5'侧翼区、其片段或变体，以及至少一个3'侧翼区、其片段或变体。作为非限制性实例，侧翼区可以是5f1和3f1、5f1和3f2、5f1和3f3、5f1和3f4、5f1和3f5、5f2和3f1、5f2和3f2、5f2和3f3、5f2和3f4、5f2和3f5、5f3和3f1、5f3和3f2、5f3和3f3、5f3和3f4、5f3和3f5。在一个实施方案中，分子支架可包含如表5-7中所述的至少一个5'侧翼区、其片段或变体，至少一个环基序区、其片段或变体以及至少一个3'侧翼区。作为非限制性实例，侧翼区和环基序区可以是5f1、l1和3f1；5f1、l1和3f2；5f1、l1和3f3；5f1、l1和3f4；5f2、l1和3f1；5f2、l1和3f2；5f2、l1和3f3；5f2、l1和3f4；5f2、l1和3f5；5f3、l1和3f1；5f3、l1和3f2；5f3、l1和3f3；5f3、l1和3f4；5f3、l1和3f5；5f1、l2和3f1；5f1、l2和3f2；5f1、l2和3f3；5f1、l2和3f4；5f1、l2和3f5；5f2、l2和3f1；5f2、l2和3f2；5f2、l2和3f3；5f2、l2和3f4；5f2、l2和3f5；5f3、l2和3f1；5f3、l2和3f2；5f3、l2和3f3；5f3、l2和3f4；5f3、l2和3f5；5f3；5f1、l3和3f1；5f1、l3和3f2；5f1、l3和3f3；5f1、l3和3f4；5f1、l3和3f5；5f2、l3和3f1；5f2、l3和3f2；5f2、l3和3f3；5f2、l3和3f4；5f2、l3和3f5；5f3、l3和3f1；5f3、l3和3f2；5f3、l3和3f3；5f3、l3和3f4；5f3、l3和3f5；5f1、l4和3f1；5f1、l4和3f2；5f1、l4和3f3；5f1、l4和3f4；5f1、l4和3f5；5f2、l4和3f1；5f2、l4和3f2；5f2、l4和3f3；5f2、l4和3f4；5f2、l4和3f5；5f3、l4和3f1；5f3、l4和3f2；5f3、l4和3f3；5f3、l4和3f4；5f3、l4和3f5。在一个实施方案中，分子支架可以是天然的pri-mirna支架。作为非限制性实例，分子支架可以是衍生自人mir155支架的支架。在一个实施方案中，分子支架可包含一个或多个本领域已知的接头。接头可以将区域或一个分子支架与另一个分开。作为非限制性实例，分子支架可以是多顺反子。包含分子支架和靶向sod1的sirna分子的调节性多核苷酸。在一个实施方案中，调节性多核苷酸可包含表8中所述的5'和3'侧翼区、环基序区以及编码有义序列和反义序列的核酸序列。在表8中，描述了过客链和引导链的dna序列标识符以及5'和3'侧翼区和环区域(也称为接头区域)。在表8中，序列名称的“mir”部分不一定与mirna基因的序列编号相对应(例如voysod1mir-102是序列名称，并不一定意味着mir-102是该序列的一部分)。表8.sod1调节性多核苷酸序列区域(5'至3')包含调节性多核苷酸的aav颗粒在一个实施方案中，aav颗粒包含具有有效载荷区的病毒基因组，其包含调节性多核苷酸序列。在这样的实施方案中，可以复制编码一种以上多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用包含调节性多核苷酸的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达编码的有义和/或反义序列。在一些实施方案中，aav颗粒在医学领域用于治疗、预防、减轻或改善神经学疾病和/或病症。在一个实施方案中，可以将包含调节性多核苷酸序列的aav颗粒引入哺乳动物细胞中，该调节性多核苷酸序列包含编码至少一个sirna分子的核酸序列。当aav颗粒有效载荷区包含调节性多核苷酸时，调节性多核苷酸可包含有义和/或反义序列以敲低靶基因。编码本文所述的调节性多核苷酸的aav病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染、兽医学应用以及各种体内和体外环境的领域中。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个反向末端重复(itr)区。所述一个或多个itr区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的itr区的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的itr。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约141个核苷酸的itr。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约130个核苷酸的itr。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含两个反向末端重复(itr)区。每个itr区的长度可以独立地具有例如但不限于以下的长度：75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174和175个核苷酸。病毒基因组的itr区的长度可以是75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175和170-175个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度约为105个核苷酸和长度约为141个核苷酸的itr。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度约为105个核苷酸和长度约为130个核苷酸的itr。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度约为130个核苷酸和长度为141个核苷酸的itr。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组包含两个itr序列区。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个多重填充序列区。所述一个或多个填充区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000、1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001、3002、3003、3004、3005、3006、3007、3008、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3015、3016、3017、3018、3019、3020、3021、3022、3023、3024、3025、3026、3027、3028、3029、3030、3031、3032、3033、3034、3035、3036、3037、3038、3039、3040、3041、3042、3043、3044、3045、3046、3047、3048、3049、3050、3051、3052、3053、3054、3055、3056、3057、3058、3059、3060、3061、3062、3063、3064、3065、3066、3067、3068、3069、3070、3071、3072、3073、3074、3075、3076、3077、3078、3079、3080、3081、3082、3083、3084、3085、3086、3087、3088、3089、3090、3091、3092、3093、3094、3095、3096、3097、3098、3099、3100、3101、3102、3103、3104、3105、3106、3107、3108、3109、3110、3111、3112、3113、3114、3115、3116、3117、3118、3119、3120、3121、3122、3123、3124、3125、3126、3127、3128、3129、3130、3131、3132、3133、3134、3135、3136、3137、3138、3139、3140、3141、3142、3143、3144、3145、3146、3147、3148、3149、3150、3151、3152、3153、3154、3155、3156、3157、3158、3159、3160、3161、3162、3163、3164、3165、3166、3167、3168、3169、3170、3171、3172、3173、3174、3175、3176、3177、3178、3179、3180、3181、3182、3183、3184、3185、3186、3187、3188、3189、3190、3191、3192、3193、3194、3195、3196、3197、3198、3199、3200、3201、3202、3203、3204、3205、3206、3207、3208、3209、3210、3211、3212、3213、3214、3215、3216、3217、3218、3219、3220、3221、3222、3223、3224、3225、3226、3227、3228、3229、3230、3231、3232、3233、3234、3235、3236、3237、3238、3239、3240、3241、3242、3243、3244、3245、3246、3247、3248、3249和3250个核苷酸。病毒基因组的任何填充区的长度可以是50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、1100-1150、1150-1200、1200-1250、1250-1300、1300-1350、1350-1400、1400-1450、1450-1500、1500-1550、1550-1600、1600-1650、1650-1700、1700-1750、1750-1800、1800-1850、1850-1900、1900-1950、1950-2000、2000-2050、2050-2100、2100-2150、2150-2200、2200-2250、2250-2300、2300-2350、2350-2400、2400-2450、2450-2500、2500-2550、2550-2600、2600-2650、2650-2700、2700-2750、2750-2800、2800-2850、2850-2900、2900-2950、2950-3000、3000-3050、3050-3100、3100-3150、3150-3200和3200-3250个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约55个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约56个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约97个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约103个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约105个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约357个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约363个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约712个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约714个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1203个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1209个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1512个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约1519个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2395个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2403个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约2405个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3013个核苷酸的填充区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约3021个核苷酸的填充区。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个多重填充序列区。所述一个或多个填充区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、6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、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的启动子区域的长度可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约4个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约17个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度约为204个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约219个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约260个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约303个核苷酸的启动子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约382个核苷酸的启动子区域。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约588个核苷酸的启动子区域。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个外显子序列区。所述一个或多个外显子区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149和150个核苷酸。病毒基因组的外显子区的长度可以是2-10、5-10、5-15、10-20、10-30、10-40、15-20、15-25、20-30、20-40、20-50、25-30、25-35、30-40、30-50、30-60、35-40、35-45、40-50、40-60、40-70、45-50、45-55、50-60、50-70、50-80、55-60、55-65、60-70、60-80、60-90、65-70、65-75、70-80、70-90、70-100、75-80、75-85、80-90、80-100、80-110、85-90、85-95、90-100、90-110、90-120、95-100、95-105、100-110、100-120、100-130、105-110、105-115、110-120、110-130、110-140、115-120、115-125、120-130、120-140、120-150、125-130、125-135、130-140、130-150、135-140、135-145、140-150和145-150个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约53个核苷酸的外显子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约134个核苷酸的外显子区。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个内含子序列区。所述一个或多个内含子区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349和350个核苷酸。病毒基因组的内含子区的长度可以是25-35、25-50、35-45、45-55、50-75、55-65、65-75、75-85、75-100、85-95、95-105、100-125、105-115、115-125、125-135、125-150、135-145、145-155、150-175、155-165、165-175、175-185、175-200、185-195、195-205、200-225、205-215、215-225、225-235、225-250、235-245、245-255、250-275、255-265、265-275、275-285、275-300、285-295、295-305、300-325、305-315、315-325、325-335、325-350和335-345个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约32个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约172个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约201个核苷酸的内含子区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度约为347个核苷酸的内含子区。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组可包含至少一个聚腺苷酸化信号序列区。一个或多个聚腺苷酸化信号区序列区可以独立地具有例如但不限于以下的长度：4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599和600个核苷酸。病毒基因组的聚腺苷酸化信号序列区的长度可以是4-10、10-20、10-50、20-30、30-40、40-50、50-60、50-100、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、100-150、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、150-200、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、200-250、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、250-300、260-270、270-280、280-290、290-300、300-310、300-350、310-320、320-330、330-340、340-350、350-360、350-400、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、400-450、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、450-500、460-470、470-480、480-490、490-500、500-510、500-550、510-520、520-530、530-540、540-550、550-560、550-600、560-570、570-580、580-590和590-600个核苷酸。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约127个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约225个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约476个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。作为非限制性实例，病毒基因组包含长度为约477个核苷酸的聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，aav颗粒病毒基因组包含多于一个polya信号序列区。表9中描述了包含具有有效载荷区的病毒基因组的aav颗粒的itr至itr序列(itrtoitr)的非限制性实例，所述有效载荷区包含调节性多核苷酸序列。表9.包含调节性多核苷酸的aav颗粒的itr至itr序列在一个实施方案中，aav颗粒包含病毒基因组，该病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有百分比同一性的序列。病毒基因组可以与seqidno：122-146中的任一个具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性。病毒基因组可以与seqidno：122-146中的任一个具有1-10％、10-20％、30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％或90-100％同一性。作为非限制性实例，病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有80％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有85％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有90％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有95％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，病毒基因组包含与seqidno：122-146中的任一个具有99％同一性的序列。可以修饰aav颗粒以增强递送效率。此类包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的修饰的aav颗粒可以被有效地包装，并且可以用于以高频率和最小毒性成功地感染靶细胞。在一些实施方案中，包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可以是人血清型aav颗粒。这样的人aav颗粒可以衍生自任何已知的血清型，例如衍生自血清型aav1-aav11中的任何一种。作为非限制性实例，aav颗粒可以是在aav1衍生的衣壳中包含aav1衍生的基因组的载体；在aav2衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；在aav4衍生的衣壳中包含aav4衍生的基因组的载体；在aav6衍生的衣壳中包含aav6衍生的基因组的载体或在aav9衍生的衣壳中包含aav9衍生的基因组的载体。在其他实施方案中，包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可以是假型化的杂合或嵌合aav颗粒，其包含起源自至少两种不同aav血清型的序列和/或组分。假型化的aav颗粒可以是包含衍生自一种aav血清型的aav基因组和至少部分衍生自不同aav血清型的衣壳蛋白的载体。作为非限制性实例，此类假型化的aav颗粒可以是在aav1衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav6衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav4衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组的载体；或在aav9衍生的衣壳中包含aav2衍生的基因组。以类似的方式，本发明涵盖任何杂合或嵌合的aav颗粒。在其他实施方案中，包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可以用于将sirna分子递送至中枢神经系统(例如，美国专利号6,180,613；其内容通过引用整体并入本文)。在一些方面，包含编码本发明的sirna分子的核酸序列的aav颗粒可以进一步包含修饰的衣壳，其包含来自非病毒来源的肽。在其他方面，aav颗粒可包含cns特异性嵌合衣壳，以促进将编码的sirna双链体递送至脑和脊髓。例如，可以构建来自显示cns向性的aav变体的cap核苷酸序列的比对，以鉴定可变区(vr)序列和结构。在其他实施方案中，本发明的sirna分子可以在用于递送至细胞的质粒载体、病毒载体(例如，aav载体)、基因组或其他核酸表达载体中编码。dna表达质粒可用于在细胞中稳定表达本发明的sirna双链体或dsrna，并实现对靶基因的长期抑制。在一个方面，由靶向sod1的多核苷酸编码的sirna双链体的有义和反义链通常通过短间隔序列连接，导致称为短发夹rna(shrna)的茎环结构的表达。发夹被dicer识别并切割，从而生成成熟的sirna分子。根据本发明，制备了包含靶向sod1mrna的sirna分子的核酸的aav载体，所述aav载体可以是aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav9.47、aav9(hu14)、aav10、aav11、aav12、aavrh8、aavrh10、aav-dj8和aav-dj及其变体。在一些实施方案中，当表达时，本发明的sirna双链体或dsrna压制(或降解)靶标mrna(即sod1)。因此，由靶向sod1的多核苷酸编码的sirna双链体或dsrna可用于基本上抑制细胞如运动神经元中sod1基因的表达。在一些方面，对sod1基因表达的抑制是指抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。因此，靶基因的蛋白产物可以被抑制至少约20％，优选至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％。sod1基因可以是野生型基因或具有至少一个突变的突变型sod1基因。因此，蛋白是野生型蛋白或具有至少一个突变的突变型多肽。病毒生产本公开提供了通过在病毒复制细胞中的病毒基因组复制来产生细小病毒颗粒，例如aav颗粒的方法，其包括使病毒复制细胞与aav多核苷酸或aav基因组接触。本公开提供了一种产生具有增强的(增加的、提高的)转导效率的aav颗粒的方法，其包括步骤：1)用杆状病毒质粒(bacmid)载体和病毒构建体载体和/或aav有效载荷构建体载体共转染感受态细菌细胞，2)分离所得的病毒构建体表达载体和aav有效载荷构建体表达载体并分别转染病毒复制细胞，3)分离并纯化所得的有效载荷和包含病毒构建体表达载体或aav有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒，4)用aav有效载荷和包含病毒构建体表达载体或aav有效载荷构建体表达载体的病毒构建体颗粒共同感染病毒复制细胞，5)收获并纯化包含细小病毒基因组的病毒颗粒。在一个实施方案中，本发明提供了一种生产aav颗粒的方法，其包括步骤：1)同时用有效载荷区、表达rep和cap基因的构建体和辅助构建体共转染哺乳动物细胞(例如但不限于hek293细胞)，2)收获并纯化包含病毒基因组的aav颗粒。细胞本公开提供了包含aav多核苷酸和/或aav基因组的细胞。本文公开的病毒生产描述了产生aav颗粒的过程和方法，所述aav颗粒与靶细胞接触以递送有效载荷构建体，例如重组病毒构建体，其包含编码有效载荷分子的多核苷酸序列。在一个实施方案中，可以在包含昆虫细胞的病毒复制细胞中产生aav颗粒。培养中的昆虫细胞的生长条件以及培养中的昆虫细胞的异源产物的生产是本领域众所周知的，参见美国专利号6,204,059，其内容通过引用整体并入本文。根据本发明，可以使用允许细小病毒复制并且可以在培养中维持的任何昆虫细胞。可以使用来自草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)的细胞系，包括但不限于sf9或sf21细胞系，果蝇(drosophila)细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(aedesalbopictus)衍生的细胞系。昆虫细胞用于表达异源蛋白的用途已有深入文献报道，将核酸例如载体例如昆虫细胞相容性载体引入此类细胞的方法以及在培养中维持此类细胞的方法也已有深入文献报道。参见，例如，methodsinmolecularbiology，ed.richard,humanapress,nj(1995)；o'reilly等人,baculovirusexpressionvectors,alaboratorymanual,oxforduniv.press(1994)；samulski等人,j.vir.63:3822-8(1989)；kajigaya等人,proc.nat'l.acad.sci.usa88:4646-50(1991)；ruffing等人,j.vir.66:6922-30(1992)；kimbauer等人,vir.219:37-44(1996)；zhao等人,vir.272:382-93(2000)；和samulski等人,美国专利号6,204,059，其每一个的内容通过引用整体并入本文。病毒复制细胞可以选自任何生物体，包括原核(例如细菌)细胞，和真核细胞，包括昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。病毒复制细胞可包含哺乳动物细胞，例如a549、weh1、3t3、10t1/2、bhk、mdck、cos1、cos7、bsc1、bsc40、bmt10、vero、w138、hela、hek293、saos、c2c12、l细胞、ht1080、hepg2和衍生自哺乳动物的原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。病毒复制细胞包含源自哺乳动物物种的细胞，包括但不限于人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠，或细胞类型，包括但不限于成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞、细胞系转化细胞等。哺乳动物细胞(小规模)生产本文公开的病毒生产描述了产生与靶细胞接触以递送有效载荷的aav颗粒的过程和方法，所述有效载荷例如重组病毒构建体，其包含编码有效载荷的多核苷酸序列。在一个实施方案中，可以在包含哺乳动物细胞的病毒复制细胞中生产aav颗粒。通常用于生产重组aav颗粒的病毒复制细胞包括但不限于293细胞、cos细胞、hela细胞、kb细胞和下述中描述的其他哺乳动物细胞系：美国专利号6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176和5,688,676；美国专利申请2002/0081721和国际专利申请wo00/47757、wo00/24916和wo96/17947，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，在哺乳动物细胞中生产aav颗粒，其中所有三种vp蛋白均以接近1：1：10(vp1：vp2：vp3)的化学计量表达。允许这种受控表达水平的调节机制包括通过差异剪接产生两种mrna，一种针对vp1，另一种针对vp2和vp3。在另一个实施方案中，使用三重转染方法在哺乳动物细胞中生产aav颗粒，其中有效载荷构建体、细小病毒rep和细小病毒cap以及辅助构建体包含在三个不同的构建体中。aav颗粒生产的三个组成部分的三重转染方法可用于生产少量病毒，用于包括转导效率、靶组织(嗜性)评估和稳定性的分析。杆状病毒本文公开的颗粒生产描述了生产与靶细胞接触以递送有效载荷构建体的aav颗粒的过程和方法，所述有效载荷构建体包括编码有效载荷的多核苷酸序列。简而言之，通过本领域技术人员已知和执行的标准分子生物学技术，通过转座子供体/受体系统将病毒构建体载体和aav有效载荷构建体载体各自引入杆粒(也称为杆状病毒质粒)中。单独的病毒复制细胞群的转染产生两种杆状病毒，一种包含病毒构建体表达载体，并且另一种包含aav有效载荷构建体表达载体。两种杆状病毒可用于感染单个病毒复制细胞群用于产生aav颗粒。用于在昆虫细胞(包括但不限于草地贪夜蛾(sf9)细胞)中产生病毒颗粒的杆状病毒表达载体提供高滴度的病毒颗粒产物。编码病毒构建体表达载体和aav有效载荷构建体表达载体的重组杆状病毒引发了病毒复制细胞的生产性感染。从初次感染释放的感染性杆状病毒颗粒再次感染培养物中的其他细胞，并在多个感染周期中以指数形式感染整个细胞培养物群体(其是初始感染复数的函数)，参见urabe，m.等人，jvirol.2006feb；80(4):1874-85，其内容通过引用整体并入本文。在昆虫细胞系统中用杆状病毒生产aav颗粒可解决已知的杆状病毒遗传和物理不稳定性。在一个实施方案中，该生产系统通过利用无滴度的感染细胞保存和放大系统来解决杆状病毒多次传代的不稳定性。用编码病毒颗粒的结构、非结构成分的病毒表达构建体转染病毒生产细胞的小规模种子培养物。将感染杆状病毒的病毒生产细胞收获为可以冷冻保存在液氮中的等分试样；等分试样保留了感染大规模病毒生产细胞培养物的活力和感染性，wasilkodj等人，proteinexprpurif.2009年6月；65(2)：122-32，其内容通过引用整体并入本文。遗传稳定的杆状病毒可用于产生一种或多种用于在无脊椎动物细胞中产生aav颗粒的组分的来源。在一个实施方案中，缺陷型杆状病毒表达载体可以在昆虫细胞中游离地维持。在这样的实施方案中，杆粒载体用复制控制元件工程化，包括但不限于启动子、增强子和/或细胞周期调节的复制元件。在一个实施方案中，杆状病毒可以用(非)选择性标记物工程化以重组至几丁质酶/组织蛋白酶基因座。chia/v-cath基因座对于在组织培养中增殖杆状病毒不是必需的，并且v-cath(ec3.4.22.50)是半胱氨酸内切蛋白酶，其对含arg-arg二肽的底物活性最高。arg-arg二肽在浓核病毒和细小病毒衣壳结构蛋白中存在，但在依赖病毒vp1中很少出现。在一个实施方案中，用aav复制和病毒颗粒生产所必需的任何元件的至少一个稳定整合拷贝对允许杆状病毒感染的稳定病毒复制细胞进行工程化，所述元件包括但不限于整个aav基因组，rep和cap基因，rep基因，cap基因，每个rep蛋白作为一个单独的转录盒，每个vp蛋白作为一个单独的转录盒，aap(装配激活蛋白)，或至少一个带有天然或非天然启动子的杆状病毒辅助基因。本文所述的aav颗粒可以通过三次转染或杆状病毒介导的病毒生产或本领域已知的任何其他方法产生。本领域已知的任何合适的允许或包装细胞均可用于生产载体。哺乳动物细胞通常是优选的。还优选的是提供从复制缺陷性辅助病毒缺失的功能的反式补充包装细胞系，例如293细胞或其他e1a反式补充细胞。基因盒可包含细小病毒(例如，aav)cap和rep基因中的一些或全部。然而，优选地，通过将编码衣壳和/或rep蛋白的包装载体引入细胞中，反式提供一些或全部的cap和rep功能。最优选地，基因盒不编码衣壳或rep蛋白。或者，使用被稳定转化以表达cap和/或rep基因的包装细胞系。在一些情况下，根据us20160032254中所述的程序从培养上清中生产并纯化重组aav病毒颗粒，其内容通过引用并入本文。生产还可以涉及本领域已知的方法，包括使用293t细胞、sf9昆虫细胞、三重转染的方法或任何合适生产方法的那些。在一些情况下，用生产aav所需的质粒，即aav2rep、腺病毒辅助构建体和itr侧翼的转基因盒，用聚乙烯亚胺(pei)转染293t细胞(贴壁/悬浮)。aav2rep质粒还包含正在研究的特定病毒的cap序列。转染后二十四小时(对于悬浮培养，无培养基改变)，其发生于有/无血清的dmem/f17中，将培养基替换为有或无血清的新鲜培养基。转染后三(3)天，从293贴壁细胞的培养基中取样。随后刮下细胞，或沉淀悬浮细胞，然后转移到容器中。对于贴壁细胞，在离心去除细胞沉淀后，刮取后从上清液中取出第二样品。接下来，通过三个连续的冻融循环(-80℃至37℃)或添加去污剂triton来裂解细胞。通过离心或深度过滤除去细胞碎片，并从培养基中取出样品3。通过dnaqpcr通过dnase抗性基因组滴定，来定量样品中的aav颗粒。这种转染的总产量等于来自样品3的颗粒浓度。根据基因组拷贝数(每毫升的基因组颗粒)测量aav颗粒滴度。如先前报道，基因组颗粒浓度基于载体dna的dnaqpcr(clark等人(1999)hum.genether.,10:1031-1039；veldwijk等人(2002)mol.ther.,6：272-278)。大规模生产在一些实施方案中，可以修饰aav颗粒生产以增加生产规模。根据本公开的大规模病毒生产方法可以包括美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中教导的任何方法，其每一个的内容通过引用整体并入本文。增加病毒颗粒生产规模的方法通常包括增加病毒复制细胞的数量。在一些实施方案中，病毒复制细胞包含贴壁细胞。为了增加贴壁病毒复制细胞的病毒颗粒产生规模，需要更大的细胞培养表面。在某些情况下，大规模生产方法包括使用滚瓶来增加细胞培养表面。具有增加的表面积的其他细胞培养基材是本领域已知的。具有增加的表面积的其它贴壁细胞培养产品的实例包括但不限于(corningcorp.，corning，ny)和nunctmcellfactorytm(thermoscientific,waltham,ma.)。在某些情况下，大规模贴壁细胞表面可包含约1,000cm2至约100,000cm2。在一些情况下，大规模贴壁细胞培养物可包含约107至约109个细胞，约108至约1010个细胞，约109至约1012个细胞或至少1012个细胞。在某些情况下，大规模贴壁培养物可生产约109至约1012，约1010至约1013，约1011至约1014，约1012至约1015或至少1015个病毒颗粒。在一些实施方案中，本公开的大规模病毒生产方法可包括使用悬浮细胞培养物。悬浮细胞培养允许显著增加细胞的数量。通常，可以在约10-50cm2表面积上生长的贴壁细胞的数量可以在约1cm3体积的悬浮液中生长。大规模培养形式的复制细胞的转染可以根据本领域已知的任何方法进行。对于大规模贴壁细胞培养，转染方法可包括但不限于使用无机化合物(例如磷酸钙)、有机化合物[例如聚乙烯亚胺(pei)]或使用非化学方法(例如电穿孔)。对于悬浮生长的细胞，转染方法可包括但不限于使用磷酸钙和使用pei。在某些情况下，可以根据在feng，l.等人，2008.biotechnolappl.biochem.50:121-32中描述的标题为“转染程序”的部分进行大规模悬浮培养物的转染，其内容通过引用整体并入本文。根据这样的实施方案，可以形成pei-dna复合物以引入待转染的质粒。在某些情况下，用pei-dna复合物转染的细胞在转染前可被“休克”。这包括将细胞培养物温度降低至4℃约1小时。在某些情况下，细胞培养物可被休克约10分钟至约5小时。在某些情况下，细胞培养物可在约0℃至约20℃的温度下被休克。在某些情况下，转染可包括一种或多种用于表达rna效应分子的载体，以减少来自一种或多种aav有效载荷构建体的核酸表达。这样的方法可以通过减少浪费在表达有效载荷构建体上的细胞资源来增强病毒颗粒的生产。在某些情况下，可以根据美国公开号us2014/0099666中教导的方法来实施这样的方法，其内容通过引用整体并入本文。生物反应器在一些实施方案中，细胞培养生物反应器可用于大规模病毒生产。在某些情况下，生物反应器包括搅拌釜反应器。这样的反应器通常包括具有搅拌器(例如，叶轮)的通常为圆柱形的容器。在一些实施方案中，可以将这样的生物反应器容器放置在水套内以控制容器温度和/或使环境温度变化产生的影响最小化。生物反应器容器体积的大小范围可以为约500ml至约2l、约1l至约5l、约2.5l至约20l、约10l至约50l、约25l至约100l、约75l至约500l、约250l至约2,000l、约1,000l至约10,000l、约5,000l至约50,000l或至少50,000l。容器底部可以是圆形或扁平的。在某些情况下，动物细胞培养物可保存在具有圆形容器底部的生物反应器中。在某些情况下，可通过使用热循环器来加热生物反应器容器。热循环器将加热的水输送到水套周围。在某些情况下，可将加热的水通过生物反应器容器内存在的管道(例如盘管)泵送。在某些情况下，热空气可以在生物反应器周围循环，包括但不限于培养基正上方的空气空间。另外，可以维持ph和co2水平以优化细胞活力。在某些情况下，生物反应器可包括中空纤维反应器。中空纤维生物反应器可以支持锚定依赖性和锚定非依赖性细胞的培养。进一步的生物反应器可包括但不限于填充床或固定床生物反应器。这样的生物反应器可包括带有玻璃珠的容器，所述玻璃珠用于贴壁细胞附着。另外的填充床反应器可包含陶瓷珠。在某些情况下，病毒颗粒通过使用一次性生物反应器产生。在一些实施方案中，这样的生物反应器可包括wavetm一次性生物反应器。在一些实施方案中，可以根据美国专利号5,064764、6,194,191、6,566,118、8,137,948或美国专利申请号us2011/0229971中教导的方法进行动物细胞生物反应器培养物中的aav颗粒生产，其每一个的内容均通过引用整体并入本文。细胞裂解本发明的细胞，包括但不限于病毒产生细胞，可以根据本领域已知的任何方法进行细胞裂解。可以进行细胞裂解以获得存在于本发明的任何细胞内的一种或多种物质(例如病毒颗粒)。在一些实施方案中，可以根据美国专利号7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935、7,968,333、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508或国际公开号o1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597中列出的方法进行细胞裂解，其每一个的内容通过引用整体并入本文。细胞裂解方法可以是化学的或机械的。化学细胞裂解通常包括使一个或多个细胞与一种或多种裂解剂接触。机械裂解通常包括使一个或多个细胞经受一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。在一些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。如本文所用，术语“裂解剂”是指可帮助破坏细胞的任何试剂。在某些情况下，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。如本文所用，术语“裂解溶液”是指包含一种或多种裂解剂的溶液(通常为水溶液)。除裂解剂外，裂解溶液可包括一种或多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、冷冻保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包含一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其他组分可包括一种或多种增溶剂。如本文所用，术语“增溶剂”是指增强溶液的一种或多种组分的溶解度和/或向其施加溶液的一种或多种实体的溶解度的化合物。在某些情况下，增溶剂增加蛋白质的溶解度。在一些情况下，基于增溶剂增强蛋白质溶解性同时保持蛋白构象和/或活性的能力来选择增溶剂。示例性的裂解剂可包括美国专利号8,685,734、7,901,921、7,732,129、7,223,585、7,125,706、8,236,495、8,110,351、7,419,956、7,300,797、6,699,706和6,143,567中描述的任何裂解剂，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，裂解剂可选自裂解盐、两性剂、阳离子剂、离子型去污剂和非离子型去污剂。裂解盐可包括但不限于氯化钠(nacl)和氯化钾(kcl)。其它裂解盐可包括美国专利号8,614,101、7,326,555、7,579,181、7,048,920、6,410,300、6,436,394、7,732,129、7,510,875、7,445,930、6,726,907、6,194,191、7,125,706、6,995,006、6,676,935和7,968,333中描述的任何裂解盐，其每一个的内容均通过引用整体并入本文。可以增加或减少盐的浓度以获得破裂细胞膜的有效浓度。如本文所指，两性剂是能够作为酸或碱反应的化合物。两性剂可包括但不限于溶血磷脂酰胆碱、3-((3-胆酰胺基丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸(chaps)、等。阳离子剂可以包括但不限于溴化十六烷基三甲基铵(c(16)tab)和苯扎氯铵。包含去污剂的裂解剂可以包括离子型去污剂或非离子型去污剂。去污剂可起到破坏或溶解细胞结构的作用，包括但不限于细胞膜、细胞壁、脂质、碳水化合物、脂蛋白和糖蛋白。示例性的离子型去污剂包括美国专利号7,625,570和6,593,123或美国公开号us2014/0087361中教导的任何离子型去污剂，其每一个的内容均通过引用整体并入本文。一些离子型去污剂可包括但不限于十二烷基硫酸钠(sds)、胆酸盐和脱氧胆酸盐。在某些情况下，裂解溶液中可包含离子型去污剂作为增溶剂。非离子型去污剂可包括但不限于辛基葡糖苷、洋地黄皂苷、芦布若尔、c12e8、tritonx-100和noniodetp-40。非离子型去污剂通常是较弱的裂解剂，但可以作为增溶剂包括在内，以增溶细胞和/或病毒蛋白。其他裂解剂可包括酶和尿素。在某些情况下，可以将一种或多种裂解剂组合在裂解溶液中，以增强细胞裂解和蛋白质溶解度中的一种或多种。在某些情况下，裂解溶液中可包含酶抑制剂，以防止可能因细胞膜破裂而引起的蛋白水解。在一些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语“裂解条件”是指促进细胞破坏的状态或环境。裂解条件可包括某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。在某些情况下，裂解条件包括温度升高或降低。根据一些实施方案，裂解条件包括温度变化以促进细胞破坏。根据这样的实施方案进行的细胞裂解可以包括冻融裂解。如本文所用，术语“冻融裂解”是指其中细胞溶液经历一个或多个冻融循环的细胞裂解。根据冻融裂解方法，将溶液中的细胞冷冻以诱导由冰晶形成和膨胀引起的细胞膜的机械破坏。根据冻融裂解方法使用的细胞溶液可以进一步包含一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、冷冻保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。一旦将经受冷冻的细胞溶液进行融化，这些组分就可以提高所需细胞产物的回收率。在某些情况下，经历冻融裂解的细胞溶液中包含一种或多种冷冻保护剂。如本文所用，术语“低温保护剂”是指用于保护一种或多种物质免于由于冷冻而损坏的试剂。冷冻保护剂可以包括美国公开号us2013/0323302或美国专利号6,503,888、6,180,613、7,888,096、7,091,030中教导的任何一种，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在某些情况下，冷冻保护剂可包括但不限于二甲基亚砜、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲酰胺、甘油、乙二醇、1,3-丙二醇和正二甲基甲酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、羟乙基淀粉、琼脂糖、葡聚糖、肌醇、葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖和尿素。在一些实施方案中，可根据美国专利号7,704,721中描述的任何方法进行冻融裂解，其内容通过引用整体并入本文。如本文所用，术语“裂解力”是指用于破坏细胞的物理活动。裂解力可包括但不限于机械力、声力、重力、光学力、电场力等。通过机械力进行的细胞裂解在本文中称为“机械裂解”。根据机械裂解可以使用的机械力可以包括高剪切流体力。根据这类机械裂解方法，可以使用微流化器(microfluidizer)。微流化器通常包括入口容器，可在此施加细胞溶液。然后可以通过泵(例如高压泵)以高速和/或高压将细胞溶液泵入相互作用室，以产生剪切流体力。然后可以将得到的裂解物收集在一个或多个输出容器中。可以调节泵速和/或压力以调节细胞裂解并增强产物(例如病毒颗粒)的回收。其他机械裂解方法可以包括通过刮擦对细胞进行物理破坏。可以基于要裂解的细胞的细胞培养形式来选择细胞裂解方法。例如，对于贴壁细胞培养，可以使用一些化学和机械裂解方法。此类机械裂解方法可包括冻融裂解或刮擦。在另一个实例中，贴壁细胞培养物的化学裂解可通过与包含表面活性剂如triton-x-100的裂解溶液一起温育来进行。在某些情况下，可以用一种或多种核酸酶处理从贴壁细胞培养物中产生的细胞裂解物，以降低由释放的dna引起的裂解物的粘度。在一个实施方案中，一种无需裂解即可收集aav颗粒的方法可用于有效且可放大的aav颗粒生产。在非限制性实例中，可通过培养缺乏肝素结合位点的aav颗粒，从而使aav颗粒进入细胞培养物中的上清液中，从培养物收集上清液；并从上清液分离aav颗粒，来生产aav颗粒，如美国专利申请20090275107中所述，其内容通过引用整体并入本文。澄清可以对包含病毒颗粒的细胞裂解物进行澄清。澄清是指从细胞裂解物中纯化病毒颗粒时采取的初始步骤。澄清的作用是通过除去较大的不溶性碎片来制备用于进一步纯化的裂解物。澄清步骤可包括但不限于离心和过滤。在澄清期间，离心可以低速进行，以仅除去较大的碎片。类似地，可以使用具有较大孔径的过滤器进行过滤，从而仅除去较大的碎片。在某些情况下，可以在澄清过程中使用切向流过滤。病毒澄清的目标包括细胞裂解物的高通量处理和优化最终病毒回收。包括澄清步骤的优点包括用于处理较大体积的裂解物的可放大性。在一些实施方案中，可以根据以下提出的任何方法进行澄清：美国专利号8,524,446、5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498、7,491,508、美国公开号us2013/0045186、us2011/0263027、us2011/0151434、us2003/0138772和国际公开号wo2002012455、wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597，其每一个的内容通过引用整体并入本文。通过过滤澄清细胞裂解物的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据多种可用方法进行，包括但不限于被动过滤和流动过滤。所使用的过滤器可包括多种材料和孔径。例如，细胞裂解物过滤器可包含约1μm至约5μm、约0.5μm至约2μm、约0.1μm至约1μm、约0.05μm至约0.05μm和约0.001μm至约0.1μm的孔径。细胞裂解物过滤器的示例性孔径可包括但不限于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001和0.001μm。在一个实施方案中，澄清可包括通过具有2.0μm孔径的过滤器过滤以去除大的碎片，然后通过具有0.45μm孔径的过滤器以去除完整的细胞。过滤器材料可以由多种材料组成。这样的材料可以包括但不限于聚合物材料和金属材料(例如，烧结金属和多孔铝)。示例性材料可以包括但不限于尼龙、纤维素材料(例如乙酸纤维素)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚醚砜、聚酰胺、聚砜、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯。在某些情况下，用于澄清细胞裂解物的过滤器可包括但不限于ultipleatprofiletm过滤器(pallcorporation,portwashington,ny)、suportm膜过滤器(pallcorporation,portwashington,ny)。在某些情况下，可以进行流动过滤以提高过滤速度和/或效率。在某些情况下，流动过滤可以包括真空过滤。根据这样的方法，在过滤器的与要过滤的细胞裂解物相对的一侧上形成真空。在某些情况下，细胞裂解物可能会在离心力的作用下通过过滤器。在某些情况下，使用泵迫使细胞裂解物通过澄清过滤器。细胞裂解物通过一个或多个过滤器的流速可以通过调节通道大小和/或流体压力之一来调节。根据一些实施方案，可以通过离心澄清细胞裂解物。离心可用于使裂解物中的不溶性颗粒沉淀。在澄清期间，离心强度[以重力单位(g)表示，其代表标准重力的倍数]可低于随后的纯化步骤。在某些情况下，可以约200g至约800g、约500g至约1500g、约1000g至约5000g、约1200g至约10000g或约8000g至约15000g对细胞裂解物进行离心。在一些实施方案中，细胞裂解物离心以8000g进行15分钟。在某些情况下，可以进行密度梯度离心，以通过沉降速率分配细胞裂解物中的颗粒。根据本公开的方法使用的梯度可以包括但不限于氯化铯梯度和碘克沙醇分级梯度。纯化：色谱在某些情况下，可以通过一种或多种色谱方法从澄清的细胞裂解物纯化aav颗粒。色谱法是指本领域已知的用于从混合物分离出一种或多种成分的许多方法。这样的方法可以包括但不限于离子交换色谱法(例如阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法)、免疫亲和色谱法和尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，病毒色谱方法可以包括以下中教导的任何方法：美国专利号5,756,283、6,258,595、6,261,551、6,270,996、6,281,010、6,365,394、6,475,769、6,482,634、6,485,966、6,943,019、6,953,690、7,022,519、7,238,526、7,291,498和7,491,508，或国际公开号wo1996039530、wo1998010088、wo1999014354、wo1999015685、wo1999047691、wo2000055342、wo2000075353和wo2001023597，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，离子交换色谱法可用于分离病毒颗粒。基于衣壳蛋白与固定相上存在的带电荷位点之间的电荷-电荷相互作用，离子交换色谱法用于结合病毒颗粒，所述固定相通常是病毒制备物(例如澄清的裂解物)通过的柱子。施加病毒制备物后，然后可通过施加洗脱溶液破坏电荷-电荷相互作用来洗脱结合的病毒颗粒。洗脱溶液可通过调节盐浓度和/或ph值以增强结合的病毒颗粒的回收来优化。依赖于分离的病毒衣壳的电荷，可以选择阳离子或阴离子交换色谱法。离子交换色谱方法可以包括但不限于以下中教导的任何方法：美国专利号7,419,817、6,143,548、7,094,604、6,593,123、7,015,026和8,137,948，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，可以使用免疫亲和色谱法。免疫亲和色谱法是利用一种或多种免疫化合物(例如抗体或抗体相关结构)留存病毒颗粒的色谱法形式。免疫化合物可以特异性结合病毒颗粒表面上的一种或多种结构，包括但不限于一种或多种病毒外壳蛋白。在某些情况下，免疫化合物可能对特定的病毒变体具有特异性。在某些情况下，免疫化合物可能会结合多种病毒变体。在一些实施方案中，免疫化合物可包括重组单链抗体。这样的重组单链抗体可以包括smith,r.h.等人,2009.mol.ther.17(11):1888-96中描述的那些，其内容通过引用整体并入本文。这样的免疫化合物能够结合几种aav衣壳变体，包括但不限于aav1、aav2、aav6和aav8。在一些实施方案中，可以使用尺寸排阻色谱法(sec)。sec可包括使用凝胶以根据尺寸分离颗粒。在病毒颗粒纯化中，sec过滤有时称为“精细纯化(polishing)”。在某些情况下，可能会进行sec以生成接近均质的最终产品。在某些情况下，此类最终产品可能会用于临床前研究和/或临床研究(kotin,r.m.2011.humanmoleculargenetics.20(1):r2-r6,其内容通过引用整体并入本文)。在某些情况下，sec可以根据以下美国专利中教导的任何方法进行：美国专利号6,143,548、7,015,026、8,476,418、6,410,300、8,476,418、7,419,817、7,094,604、6,593,123和8,137,948，其每一个的内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，包含至少一种aav颗粒的组合物可以使用美国专利号us6146874中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，包含至少一种aav颗粒的组合物可以使用美国专利号us6660514中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，包含至少一种aav颗粒的组合物可以使用美国专利号us8283151中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，包含至少一种aav颗粒的组合物可以使用美国专利号us8524446中描述的方法分离或纯化，其内容通过引用整体并入本文。引入细胞为了确保sirna双链体的化学和生物稳定性，重要的是，将编码sirna的多核苷酸递送至靶细胞内。可以使用多种方法中的任何一种将本发明的多核苷酸引入细胞。在一些实施方案中，通过使细胞与本发明的多核苷酸接触，将所述多核苷酸引入细胞。在一些实施方案中，通过使细胞与包含多核苷酸和亲脂性载体的组合物接触将多核苷酸引入细胞中。在其他实施方案中，通过用载体转染或感染细胞将多核苷酸引入细胞，所述载体包含当在细胞中转录时能够产生sirna双链体的核酸序列。在一些实施方案中，通过将包含当在细胞中转录时能够产生sirna双链体的核酸序列的载体注射到细胞中，来将sirna双链体引入细胞。在其他实施方案中，可以通过电穿孔将本发明的多核苷酸递送至细胞中(例如美国专利公开号20050014264；其内容通过引用整体并入本文)。此外，可以通过病毒感染将插入到病毒载体(例如aav载体)的sirna分子递送到细胞中。工程化和优化这些病毒载体，以促进sirna分子进入不易转染的细胞。而且，一些合成的病毒载体具有将shrna整合到细胞基因组中的能力，从而导致稳定的sirna表达和靶基因的长期敲低。以这种方式，将病毒载体工程化为用于特定递送同时缺乏在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征的载体。在一些实施方案中，细胞可以包括但不限于哺乳动物来源的细胞、人类来源的细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、神经干细胞和神经祖细胞。药物组合物和制剂除了药物组合物(例如待递送的sirna双链体(包括编码质粒或表达载体，例如病毒，例如aav))，本文还提供的是适合施用于人的药物组合物，本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用于任何其他动物，例如非人类动物，例如非人类哺乳动物。修饰适合施用于人的药物组合物以使组合物适合施用于各种动物是众所周知的，并且本领域的兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有)设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或禽类，包括与商业相关的禽类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。在一些实施方案中，将组合物施用于人、人类患者或受试者。为了本公开的目的，短语“活性成分”通常是指合成的sirna双链体或携带sirna双链体的病毒载体，或由本文所述的病毒载体递送的sirna分子。本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成型和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将依赖于待治疗的受试者的身份、大小和/或状况而变化，并进一步取决于组合物待施用的途径。可以使用一种或多种赋形剂配制sirna双链体或编码他们的病毒载体，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续释放或延迟释放；或(4)改变生物分布(例如，将病毒载体靶向特定的组织或细胞类型，例如脑和运动神经元)。本发明的制剂可以包括但不限于盐水、类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、用病毒载体转染的细胞(例如，用于移植到受试者中)、纳米颗粒模拟物及其组合。此外，可以使用自组装核酸纳米颗粒来配制本发明的病毒载体。通过药理学领域中已知的或此后开发的任意方法，可以制备本文描述的药物组合物的制剂。一般而言，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合。本公开的药物组合物可以散装、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量制备、包装和/或销售。如本文所用，“单位剂量”表示包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将要施用给受试者的活性成分的剂量，和/或这样的剂量的合宜分数，如这样的剂量的二分之一或三分之一。本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量可以变化，这取决于正在治疗的受试者的身份、大小和/或状况，并且还取决于要施用所述组合物的途径。例如，组合物可以包含0.1％至99％(w/w)的活性成分。作为例子，组合物可以包含0.1％至100％、例如.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。在一些实施方案中，本文所述的制剂可包含至少一种靶向sod1的多核苷酸。作为一个非限制性实例中，制剂可以含有1、2、3、4或5个在不同位点靶向sod1基因的多核苷酸。在某些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在某些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和用于兽医学应用。在某些实施方案中，赋形剂可以被美国食品和药品管理局批准。在某些实施方案中，赋形剂可以属于药用级。在某些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。如本文所用，赋形剂包括但不限于任一或全部溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，只要它们适合于所希望的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备组合物的技术是本领域已知的(参见remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第21版,a.r.gennaro,lippincott,williams&wilkins,baltimore,md,2006；通过引用整体并入本文)。在本公开的范围内可以预见到常规赋形剂介质的应用，但是除了任何常规赋形剂介质可能与物质或它的衍生物不相容以外，诸如通过产生任何不希望的生物学效应或另外以有害方式与药物组合物的任意其它组分相互作用。示例性的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或它们的组合。在某些实施方案中，所述制剂可以包含至少一种无活性成分。如本文所用，术语“无活性成分”表示在制剂中包括的一种或多种无活性试剂。在某些实施方案中，在本发明的制剂中可以使用的全部、没有或一些无活性成分可以被美国食品和药品管理局(fda)批准。携带本文公开的靶向sod1的多核苷酸的病毒载体的制剂可以包括阳离子或阴离子。在一个实施方案中，所述制剂包括金属阳离子，例如，但不限于，zn2+、ca2+、cu2+、mg+和它们的组合。如本文所用，“药学上可接受的盐”表示公开的化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的例子包括但不限于碱性残基如胺的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱盐或有机盐；等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括形成的母体化合物的常规无毒盐，例如，从无毒的无机或有机酸形成。本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当的碱或酸在水或有机溶剂或这两者的混合物中反应，可以制备这样的盐；通常，非水性介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表可在以下文献中找到：remington’spharmaceuticalsciences,第17版,mackpublishingcompany,easton,pa.,1985,第1418页,pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.h.stahl和c.g.wermuth(编),wiley-vch,2008,以及berge等人,journalofpharmaceuticalscience,66,1-19(1977)；其每一个的内容通过引用整体并入本文。如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂合物”是指这样的本发明的化合物，其中合适的溶剂的分子掺入晶格中。合适的溶剂是在施用的剂量是生理学上可耐受的。例如，通过从包括有机溶剂、水或其混合物的溶液结晶、重结晶或沉淀，可以制备溶剂合物。合适的溶剂的例子是乙醇、水(例如，一水合物、二水合物和三水合物)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、二甲亚砜(dmso)、n,n’-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n’-二甲基乙酰胺(dmac)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(dmeu)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1h)-嘧啶酮(dmpu)、乙腈(acn)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水是溶剂时，溶剂合物被称作“水合物”。根据本发明，可以配制靶向sod1的多核苷酸或包含该多核苷酸的aav载体用于cns递送。可以使用穿过血脑屏障的物质。例如，可以使用将sirna分子靶向血脑屏障内皮的一些细胞穿透肽，用于配制靶向sod1基因的sirna双链体(例如mathupala,expertopintherpat.,2009,19,137-140；其内容通过引用整体并入本文)。施用通过导致治疗上有效结果的任何途径，可以施用本发明的靶向sod1的多核苷酸。这些包括但不限于肠内(进入肠)、胃肠内、硬膜外(进入硬脑膜)、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外(peridural)、大脑内(进入大脑)、脑室内(进入脑室)、表皮(应用在皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身)、皮下(在皮肤下)、鼻施用(通过鼻)、静脉内(进入静脉)、静脉内快速推注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉)、肌肉内(进入肌肉)、心内(进入心脏)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、腹膜内(输注或注射进腹膜)、膀胱内输注、玻璃体内(通过眼)、海绵窦内注射(进入病理性腔体)、腔内(进入阴茎的基底)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(穿过完整皮肤扩散用于全身分布)、透粘膜(穿过粘膜扩散)、经阴道、吹入法(嗅吸法)、舌下、唇下、灌肠、滴眼(在结膜上)、滴耳、耳(在耳朵中或通过耳朵)、含服(朝向脸颊)、结膜、皮肤、牙(至一个或多个牙)、电渗透、宫颈内、窦内(endosinusial)、气管内、体外、血液透析、渗入、间质、腹部内、羊膜内、关节内、胆内、支气管内、囊内、软骨内(在软骨内)、脊尾内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内(dentalintracornal)、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(intracorporuscavernosum)(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺的导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或下)、表皮内(至表皮)、食管内(至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远侧部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、骨髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或它的支气管内)、窦内(在鼻或眼窝窦内)、椎管内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何水平在脑脊液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在aurus介质内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子透入法(借助于电流，其中可溶性盐的离子迁移进身体的组织中)、冲洗(浸泡或冲洗开放性创伤或体腔)、喉头(直接在喉上)、鼻胃(穿过鼻并进入胃)、封闭敷裹技术(局部途径施用，其然后被封闭该区域的敷料覆盖)、眼(至外眼)、口咽(直接至口和咽)、胃肠外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内，为了局部或全身效应通过口或鼻吸入)、眼球后(脑桥后或眼球后)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(至输尿管)、尿道(至尿道)、阴道、骶管阻滞、诊断、神经传导阻滞、胆灌注、心脏灌注、体外光化学疗法或脊柱。在具体的实施方案中，可以以允许包含含有至少一种靶向sod1的多核苷酸的aav载体的组合物进入中枢神经系统并渗透进运动神经元的方式施用该组合物。在一些实施方案中，本发明的治疗剂可以通过肌肉注射施用。rizvanov等人首次证实了靶向突变的人sod1mrna的sirna分子被坐骨神经吸收，逆向转运到运动神经元的核周体，并抑制sod1g93a转基因als小鼠中突变型sod1mrna(rizvanovaa等人，exp.brainres.,2009,195(1),1-4；其内容通过引用整体并入本文)。另一项研究还表明，表达针对突变型sod1基因的小发夹rna(shrna)的aav的肌肉传递，导致肌肉和神经支配的运动神经元中突变型sod1显著敲低(townec等人，molther.，2011；19(2)：274-283；其内容通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，通过外周注射和/或鼻内递送，可以给受试者施用表达本发明的sirna双链体的aav载体。在本领域中公开了sirna双链体的aav载体的外周施用可以运输至中枢神经系统，例如，运输至运动神经元(例如，美国专利公开号20100240739和20100130594；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。在其它实施方案中，通过颅内递送(参见，例如，美国专利号8,119,611；其内容通过引用整体并入本文)可以给受试者施用组合物，其包含至少一种本发明的sirna双链体。可以以任意适合形式(作为液体溶液或混悬液，作为适合用于液体溶液或在液体溶液中的混悬液的固体形式)施用本发明的靶向sod1的多核苷酸。可以用任意适当的和药学上可接受的赋形剂配制它们。可以以“治疗上有效的”量施用本发明的靶向sod1的多核苷酸，所述“治疗上有效的”量即这样的量：其足以减轻和/或预防至少一种与疾病有关的症状，或提供受试者的状况的改善。给药通过使用有效地预防和治疗sod1相关病症(例如als)的任何量，可以将本发明的药物组合物施用给受试者。所需要的确切量将在受试者之间变化，这取决于受试者的物种、年龄和总体状况、疾病的严重程度、具体组合物、它的施用模式、它的活性模式等。通常以易于施用和剂量均匀的单位剂型配制本发明的组合物。然而，应当理解，本发明的组合物的每日总施用可以由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何特定患者的具体治疗有效性将取决于多种因素，包括正在治疗的病症和病症的严重程度；使用的具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间和施用途径；治疗的持续时间；与所用的具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。在一些具体实施方案中，用于递送本发明的sirna双链体的aav载体的剂量可取决于疾病状况、受试者和治疗策略等而改变。通常，每剂量施用为约105、106、1012、1013、1014、1015到1016病毒基因组(单位)。期望的剂量可以每天三次、每天两次、每天一次、每两天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在某些实施方案中，通过使用多次施用(例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次、十二次、十三次、十四次或更多次施用)来递送所需剂量。当采用多次施用时，可以使用分割给药(splitdosing)方案，如本文所述的那些。如本文所用，“分割给药”是将单一单位剂量或总每日剂量分成两个或更多个剂量，例如，单一单位剂量的两次或更多次施用。如本文所用，“单一单位剂量”是在一个剂量/在一个时间/单个途径/单个接触点(即，单个施用事件)中施用的任何调节性多核苷酸治疗剂的剂量。如本文所用，“总每日剂量”是在24小时时间段中给出或开处方的量。它可以作为单一单位剂量施用。在一个实施方案中，将包含本发明的靶向sod1的多核苷酸的病毒载体在分割剂量中施用给受试者。可以在仅缓冲液中或在本文描述的制剂中配制它们。治疗als和/或犬退行性脊髓病(dm)的方法本发明提供了用于将本文所述的靶向sod1的多核苷酸引入细胞的方法，该方法包括以足以使靶标sod1mrna发生降解的量将任何多核苷酸引入所述细胞。在一些方面，细胞可以是干细胞、神经元如运动神经元、肌肉细胞和神经胶质细胞如星形胶质细胞。本发明还公开了在需要治疗的受试者中治疗与异常sod1功能相关的als的方法。所述方法任选地包括向受试者施用治疗有效量的包含或编码至少一种靶向sod1基因的sirna双链体的组合物。所述sirna双链体将使sod1基因表达沉默并抑制sod1蛋白产生，并减轻受试者中als的一种或多种症状，从而治疗性治疗als。在一些实施方案中，本发明的靶向sod1的多核苷酸或包含或编码该多核苷酸的组合物被施用至受试者的中枢神经系统。在其它实施方案中，本发明的sirna双链体或包含它的组合物被施用至受试者的肌肉。特别地，可以将靶向sod1的多核苷酸递送到特定类型的靶细胞中，包括运动神经元；神经胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小神经胶质细胞；和/或其他围绕神经元的细胞，例如t细胞。对人类als患者和动物sod1als模型的研究表明，神经胶质细胞在als神经元的功能障碍和死亡中起着早期作用。在周围的保护性神经胶质细胞中的正常sod1能够防止运动神经元死亡，即使突变型sod1存在于运动神经元(例如，philips和rothstein,exp.neurol.,2014年5月22日.pii:s0014-4886(14)00157-5综述；其内容通过引用整体并入本文)。在一些具体实施方案中，将至少一种用作als疗法的靶向sod1基因的sirna双链体插入病毒载体，例如aav载体中。在一些实施方案中，将本发明的组合物作为用于治疗als的单独治疗剂或组合治疗剂施用。包含或编码靶向sod1基因的sirna双链体的病毒载体可以与一种或多种其他治疗剂组合使用。“与...组合”并不意味着试剂必须同时施用和/或经配制用于一起递送，尽管这些递送方法也在本公开的范围内。组合物可以与一种或多种其他所需治疗剂或医疗程序同时、在其之前或之后施用。通常，将以针对该试剂确定的剂量和/或时间表来施用每种试剂。可以与本发明的靶向sod1的多核苷酸组合使用的治疗剂可以是小分子化合物，其是抗氧化剂、抗炎剂、抗凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸能试剂、结构蛋白抑制剂、以及参与金属离子调节的化合物。组合用于治疗als的化合物可以包括但不限于减少氧化应激的试剂，如自由基清除剂，和/或radicava(依达拉奉)，抗谷氨酸能剂：利鲁唑、托吡酯、他仑帕奈、拉莫三嗪、右美沙芬、加巴喷丁和ampa拮抗剂；抗细胞凋亡剂：米诺环素、苯基丁酸钠和阿莫氯醇；抗炎剂：神经节苷脂、塞来考昔、环孢菌素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、血浆去除术(plasmaphoresis)、醋酸格拉替雷和沙利度胺；头孢曲松(berry等人,plosone,2013,8(4))；β-内酰胺抗生素；普拉克索(一种多巴胺激动剂)(wang等人,amyotrophiclateralscler.,2008,9(1),50-58)；在美国专利公开号20060074991中的尼美舒利；在美国专利公开号20130143873中公开的二氮嗪)；在美国专利公开号20080161378中公开的吡唑酮衍生物；抑制氧化应激诱导的细胞死亡的自由基清除剂，诸如溴隐亭(美国专利公开号20110105517)；在pct专利公开号2013100571中讨论的氨基甲酸苯酯化合物；在美国专利号6,933,310和8,399,514和美国专利公开号20110237907和20140038927中公开的神经保护性化合物；和在美国专利公开号20070185012中教导的糖肽；其每一个的内容通过引用整体并入本文。可以与本发明的靶向sod1基因的sirna双链体组合使用的治疗剂可以是可保护神经元损失的激素或变体，诸如促肾上腺皮质激素(acth)或其片段(例如，美国专利公开号20130259875)；雌激素(例如，美国专利号6,334,998和6,592,845)；其每一个的内容通过引用整体并入本文。神经营养因子可以与本发明的靶向sod1基因的sirna双链体一起用于治疗als。通常，将神经营养因子定义为促进神经元的存活、生长、分化、增殖和/或成熟或者刺激增加的神经元活性的物质。在某些实施方案中，本发明的方法还包括向需要治疗的受试者递送一种或多种营养因子。营养因子可以包括但不限于igf-i、gdnf、bdnf、ctnf、vegf、colivelin、扎利罗登、促甲状腺素释放激素和adnf、及其变体。在一个方面，可以将包含至少一个靶向sod1基因的sirna双链体的aav载体与诸如aav-igf-1(vincent等人,neuromolecularmedicine,2004,6,79-85；其内容通过引用整体并入本文)和aav-gdnf(wang等人,jneurosci.,2002,22,6920-6928；其内容通过引用整体并入本文)的表达神经营养因子的aav颗粒共同施用。在一些实施方案中，将用于治疗als的本发明的组合物静脉内地、肌肉内地、皮下地、腹膜内地、鞘内地和/或心室内地施用给有需要的受试者，从而允许sirna双链体或包含sirna双链体的载体穿过血脑屏障和血液脊髓屏障中的一个或两个。在某些方面，所述方法包括(使用例如输液泵和/或递送支架)向受试者的中枢神经系统(cns)直接施用(例如，心室内地施用和/或鞘内地施用)治疗有效量的组合物，该组合物包含至少一种靶向sod1基因的sirna双链体或包含至少一种靶向sod1基因的sirna双链体的aav载体，沉默/压制sod1基因表达，并减轻受试者中als的一种或多种症状，从而从治疗上治疗als。在某些方面，改善了治疗的受试者中的als症状，包括运动神经元退化、肌无力、肌肉萎缩、肌肉僵硬、呼吸困难、言语不清、肌束震颤发生、额颞叶痴呆和/或早产儿死亡。在其它方面，将本发明的组合物应用于脑和脊髓中的一个或两个。在其它方面，改善肌肉协调和肌肉功能中的一个或两个。在其它方面，延长受试者的存活。本文所述的组合物可以在动物模型中进行测试。作为非限制性实例，动物可以是啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或哺乳动物(例如，非人灵长类动物或狗)。在一个实施方案中，动物模型是患有犬退行性脊髓病(dm)的狗。犬dm可以作为als的模型，因为狗神经系统大小和复杂程度相当，并且狗患有运动神经元丧失和相似的sod1化学水平。犬dm是作为sod1突变(e40k，t18s)结果的晚期发作疾病(8至14岁)，并且目前尚无可用的治疗方法。使用犬dm作为als的疾病模型的一些好处包括但不限于具有跨物种共享的给药和治疗药效学以及重现转基因啮齿动物als模型和人类als间共享的犬dm中的疾病量度(measure)。犬dm存在四个阶段。dm狗的第1阶段(早期)神经学症状包括但不限于进行性全身本体感觉性共济失调、不对称痉挛性轻瘫和/或未受损的脊柱反射。dm狗的第2阶段(早期)神经学症状包括但不限于轻度到中度的肌肉质量损失、骨盆肢体中脊柱反射减少到缺乏和/或尿失禁和大便失禁。dm狗的第3阶段(晚期)神经学症状包括但不限于胸肢轻瘫的迹象、迟缓性截瘫、骨盆肢体肌肉质量严重丧失和/或尿失禁和大便失禁。dm狗的第4阶段(晚期)神经学症状包括但不限于痉挛性四肢瘫痪、吞咽困难和舌头运动困难、皮肤截短反射(cutaneoustruncireflex)减少至缺乏、全身性严重肌肉质量丧失和/或尿失禁和粪便失禁。可以使用各种测量追踪在动物研究中使用的犬dm狗和正常狗。这些测量包括但不限于神经生理学测试(例如，运动和感觉神经传导研究(ncs)、运动单位数量估算(mune)、复合肌肉动作电位(cmap)和电阻抗肌电图(eim))、神经病、神经影像学(例如，mrs、dti、pet/ct)、基因组学(例如，使用基因修饰剂)、样品分析(例如，血清和csf中的sod1、nf-h和/或nf-l)、自然病史度量和/或严重程度评定量度(例如，olby运动量表；参见例如，olbynj等人，amjvetres2001，其内容通过引用整体并入本文)。在一个实施方案中，结构蛋白可以用作生物标志物以关联疾病进展和/或治疗效果。受试者血液和/或csf中的结构蛋白的水平可以用于确定疾病进展和/或治疗效果。在一个实施方案中，神经丝蛋白可以用作生物标记以关联疾病进展和/或治疗效果。受试者血液和/或csf中的神经丝蛋白的水平可以用于确定疾病进展和/或治疗效果。作为非限制性实例，神经丝蛋白是神经丝轻链(nf-l)。作为非限制性实例，神经丝蛋白是神经丝重链(nf-h)。在一个实施方案中，神经丝轻链(nf-l)蛋白可以用作生物标记以关联疾病进展和/或治疗效果。受试者血液和/或csf中的nf-l水平可以用于确定疾病进展和/或治疗效果。在一个实施方案中，神经丝重链(nf-h)蛋白可以用作生物标记以关联疾病进展和/或治疗效果。受试者血液和/或csf中的nf-h水平可以用于确定疾病进展和/或治疗效果。定义除非另外说明，否则以下术语和短语具有下面描述的含义。所述定义无意在性质上成为限制性的，而是用于提供本发明的某些方面的更清楚理解。如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和‘寡核苷酸”表示由多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)或多核糖核苷酸(含有d-核糖)或任意其它类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基或经修饰的嘌呤或嘧啶碱基的n糖苷)组成的任意核酸聚合物。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间无意区分长度，且这些术语将互换使用。这些术语仅表示分子的一级结构。因而，这些术语包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。如本文所用，术语“rna”或“rna分子”或“核糖核酸分子”表示核糖核苷酸的聚合物；术语“dna”或“dna分子”或“脱氧核糖核酸分子”表示脱氧核糖核苷酸的聚合物。可以天然地合成(例如，分别通过dna复制和dna的转录)或化学地合成dna和rna。dna和rna可以是单链的(即，分别是ssrna或ssdna)或多链的(例如，双链的，即，分别是dsrna和dsdna)。如本文所用，术语“mrna”或“信使rna”表示编码一个或多个多肽链的氨基酸序列的单链rna。如本文所用，术语“rna干扰”或“rnai”表示由rna分子介导的序列特异性的调节机制，其导致对应的蛋白编码基因的表达的抑制或干扰或“沉默”。rnai已经在许多类型的生物中观察到，包括植物、动物和真菌。rnai天然地发生在细胞中以除去外来rna(例如，病毒rna)。天然rnai通过从游离dsrna切割的片段进行，其将降解机制引导至其它类似的rna序列。rnai由rna诱导的沉默复合物(risc)控制，且由细胞质中的短/小dsrna分子起始，其中它们与催化性的risc组分argonaute相互作用。可以将dsrna分子外源地引入细胞中。外源dsrna通过激活核糖核酸酶蛋白dicer而起始rnai，所述dicer结合和切割dsrna以产生21-25个碱基对的双链片段，其在每个末端上具有几个未配对的悬突碱基。这些短双链片段被称作小干扰rna(sirna)。如本文所用，术语“小/短干扰rna”或“sirna”表示能够指导或介导rnai的包含约5-60个核苷酸(或核苷酸类似物)的rna分子(或rna类似物)。优选地，sirna分子包含约15-30个核苷酸或核苷酸类似物，更优选约16-25个核苷酸(或核苷酸类似物)，甚至更优选约18-23个核苷酸(或核苷酸类似物)，并且甚至更优选约19-22个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)。术语“短”sirna表示包含5-23个核苷酸、优选21个核苷酸(或核苷酸类似物)(例如，19、20、21或22个核苷酸)的sirna。术语“长”sirna表示包含24-60个核苷酸、优选约24-25个核苷酸(例如，23、24、25或26个核苷酸)的sirna。在某些情况下，短sirna可以包括少于19个核苷酸，例如，16、17或18个核苷酸，或少至5个核苷酸，前提条件是，较短的sirna保留介导rnai的能力。同样地，在某些情况下，长sirna可以包括超过26个核苷酸，例如，27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，前提条件是，较长的sirna保留介导rnai或翻译抑制的能力，无需进一步加工(例如，酶促加工)成短sirna。sirna可以是单链rna分子(ss-sirna)或包含有义链和反义链的双链rna分子(ds-sirna)，所述有义链和反义链杂交以形成被称作sirna双链体的双链体结构。根据本发明，重组aav载体可以编码一种或多种rnai分子，例如sirna、shrna、microrna或其前体。如本文所用，术语sirna分子的“反义链”或“第一链”或“引导链”表示这样的链：其与靶向沉默的基因的mrna的约10-50个核苷酸(例如，约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸)的段基本上互补。所述反义链或第一链具有与期望的靶标mrna序列足够互补的序列，以指导靶标特异性的沉默，例如，足以触发rnai机制或过程对期望的靶标mrna的破坏的互补性。如本文所用，术语sirna分子的“有义链”或“第二条链”或“过客链”表示与反义链或第一链互补的链。sirna分子的反义链和有义链发生杂交以形成双链体结构。如本文所用，“sirna双链体”包括与靶向沉默的基因的mrna的约10-50个核苷酸的段具有足够互补性的sirna链和与所述sirna链具有足够互补性以形成双链体的sirna链。根据本发明，重组aav载体可以编码有义和/或反义链。如本文所用，术语“互补的”表示多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行的多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链可以以沃森-克里克方式(例如，a至t、a至u、c至g)或以允许形成双链体的任意其它方式形成碱基对。本领域技术人员知晓，当使用与dna相对的rna时，尿嘧啶(而不是胸腺嘧啶)被认为是与腺苷互补的碱基。但是，当在本发明的上下文中提及u时，暗示置换t的能力，除非另有说明。完美互补性或100％互补性表示这样的情形：其中一个多核苷酸链的每个核苷酸单元都可以与第二个多核苷酸链的核苷酸单元形成氢键。小于完美互补性表示这样的情形：两个链的一些(但是并非全部)核苷酸单元可以彼此形成氢键。例如，对于两个20-聚体，如果在每个链上的仅两个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出10％互补性。在相同的例子中，如果在每个链上的18个碱基对可以彼此形成氢键，那么所述多核苷酸链表现出90％互补性。如本文所用，“靶向”是指设计和选择核酸序列的过程，所述核酸序列将与靶核酸杂交并诱导期望的效应。术语“基因表达”表示这样的过程：核酸序列通过该过程发生成功转录和(在大多数情况下)翻译以生产蛋白或肽。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应当被理解为是指，可以测量转录的核酸产物(例如，rna或mrna)或翻译的氨基酸产物(例如，多肽或肽)。测量rna、mrna、多肽和肽的量或水平的方法是本领域众所周知的。如本文所用，术语“突变”表示基因的结构的任何变化，其导致可以传递至后代的变体(也称为“突变体”)形式。基因中的突变可以由dna中的单个碱基的改变造成，或者由基因或染色体的更大段的缺失、插入或重排造成。如本文所用，术语“载体”是指运输、转导异源分子(诸如本发明的靶向sod1的多核苷酸)或以其它方式充当异源分子(诸如本发明的靶向sod1的多核苷酸)的载体的任何分子或部分。“病毒载体”是指包含一个或多个多核苷酸区域的载体，所述多核苷酸区域编码或包含目标分子，例如，转基因，编码一个多肽或多个多肽的多核苷酸，或调节性核酸如小干扰rna(sirna)。病毒载体通常用于将遗传物质递送进细胞中。经常为了特定应用修饰病毒载体。病毒载体的类型包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。如本文所用，术语“腺相关病毒”或“aav”或“aav载体”表示包含或源自腺相关载体的组分并且适合用于感染哺乳动物细胞、优选人细胞的任何载体。术语aav载体通常表示aav型病毒颗粒或病毒体，其包含编码sirna双链体的核酸分子。aav载体可以源自不同血清型，包括血清型的组合(即，“假型化”aav)，或源自不同基因组(例如，单链的或自互补的)。另外，aav载体可以是复制缺陷的和/或靶向的。如本文所用，短语“抑制基因的表达”是指造成基因表达产物的量的减少。表达产物可以是从基因转录的rna分子(例如mrna)或从基因转录的mrna所翻译成的多肽。通常，mrna水平的降低会导致从其翻译的多肽的水平的降低。通过使用用于测量mrna或蛋白的标准技术，可以确定表达的水平。如本文所用，术语“体外”表示在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中、在培养皿等中，发生的事件，而不是在生物(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。如本文所用，术语“体内”表示在生物(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。如本文所用，术语“修饰的”表示本发明的分子的改变的状态或结构。可以以许多方式修饰分子，所述方式包括在化学上、在结构上和在功能上。如本文所用，术语“合成的”是指通过人手生产、制备和/或制造。本发明的多核苷酸或多肽或其它分子的合成可以是化学的或酶促的。如本文所用，术语“转染”表示将外源核酸引入细胞中的方法。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。可以转染进细胞中的药剂的列表较大，且包括但不限于sirna、有义序列和/或反义序列、aav载体或颗粒、编码一个或多个基因并被组织进表达质粒中的dna、蛋白、蛋白片段和更多。如本文所用，“脱靶”表示对任意一种或多种靶标、基因和/或细胞转录物的任何非目的效果。如本文所用，短语“药学上可接受的”在本文中用于表示这样的化合物、物质、组合物和/或剂型：在合理的医学判断范围内，其适用于接触人类和动物的组织，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。如本文所用，术语试剂的“有效量”是这样的量：所述量足以实现有益的或期望的结果，例如，临床结果，且这样，“有效量”取决于它所应用的上下文。例如，在施用治疗als的试剂的上下文中，试剂的有效量是例如这样的量：与在不施用所述试剂的情况下得到的应答相比，所述量足以实现如本文中定义的als的治疗。如本文所用，术语“治疗有效量”是指要递送的试剂(例如，核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量，当施用给遭受或易患感染、疾病、病症和/或病况的受试者时，所述量足以治疗、改善所述感染、疾病、病症和/或病况的症状，诊断、预防和/或延迟所述感染、疾病、病症和/或病况的发作。如本文所用，术语“受试者”或“患者”表示可以给其施用本发明的组合物的任何生物，例如，为了实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型受试者包括动物(例如，哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、诸如黑猩猩和其它猿类和猴物种的非人灵长类动物和人类)和/或植物。如本文所用，术语“预防”表示延迟或预先阻止病症或疾病的发作、发展或进展一段时间，包括数周、数月或数年。如本文所用，术语“治疗”表示用于治愈或改善疾病的一个或多个具体操作的应用。在某些实施方案中，具体操作是一种或多种药学试剂的施用。在本发明的上下文中，具体操作是一种或多种靶向sod1的sirna双链体或dsrna的施用。如本文所用，术语“改善”表示减轻病况或疾病的至少一种指标的严重程度。例如，在神经退行性病症的上下文中，改善包括神经元丧失的减少。如本文所用，术语“施用”表示给受试者提供药学试剂或组合物。如本文所用，术语“神经退行(退化)”表示导致神经细胞死亡的病理性状态。大量神经学病症都具有神经退行作为一种共同的病理学状态。例如，阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(als)都造成慢性神经退化，其以在数年的时间段内缓慢的进行性神经细胞死亡为特征，而急性神经退行以神经细胞死亡的突然发作为特征，所述突然发作是因为缺血(诸如中风)或创伤(诸如创伤性脑损伤)，或者是因为由脱髓鞘或创伤(例如由脊髓损伤或多发性硬化造成)导致的轴突横断。在某些神经学病症中，主要一类神经元细胞是退化的，例如，在als中的运动神经元退化。实施例实施例1.靶向sod1的多核苷酸设计(sirna)进行sirna设计，以鉴定靶向人sod1基因的sirna。该设计分别使用来源于人的sod1转录物(ncbi参考序列nm_000454.4；seqidno：1)、食蟹猴(ncbi参考序列nm_001285406.1；(seqidno：2)、猕猴(ncbi参考序列nm_001032804.1；seqidno：2)，和家犬(ncbi参考序列nm_0013035；seqidno：4)(表10)。将sirna双链体设计成与人sod1转录物在反义链的位置2-18具有100％同一性，并且与非人类灵长类动物sod1转录物在反义链的位置2-18具有部分或100％同一性。在所有sirna双链体中，为了在该位置使双链体不配对，反义链的位置1被工程化为u并且有义链的位置19被工程化为c。表10.sod1基因序列实施例2.als动物模型狗可用于研究靶向sod1的aav基因疗法治疗als的功效。犬退形性脊髓(dm)是一种理想的疾病模型，因为天然发生的sod1突变(e40k)是犬dm的病因，狗具有相对较大的脊髓/脑，受dm影响的狗具有疾病进展的同质模式，并且dm中的组织病理学发现和功能缺陷与人als的某些形式的上运动神经元发作具有相似性(awano等人，genome-wideassociationanalysisrevealsasod1mutationincaninedegenerativemyelopathythatresemblesamyotrophiclateralsclerosis；pnas，2009年2月；106(8)；2794-2799，其内容通过引用整体并入本文)。犬dm是自然发生的、成年发作的进行性疾病，其与als一样，导致瘫痪和死亡(averill，dj，degenerativemyelopathyintheaginggermanshepherddog:clinicalandpathologicfindings.jamvetmedassoc1973；162:1045-1051；其内容通过引用整体并入本文)。最早的临床体征始于狗8岁或更大时。dm影响许多犬种，总患病率为0.19％。疾病发作和临床进展在所有犬种中均一，显示感觉神经元和上、下运动神经元的退化。临床表现已分类为四个临床疾病阶段(coatesjr，winingerfa，caninedegenerativemyelopathy.vetclinnorthamsmallanimpract2010；40:929-950和kanazonos，pithuap，johnsongc等人，clinicalprogressionofcaninedegenerativemyelopathy.2013americancollegeofveterinaryinternalmedicineannualforum.seattle,wa2013年6月16-18日.jvetintmed2013；24(3):699；其每一个的内容通过引用整体并入本文)。临床体征表现为不对称痉挛性轻瘫和全身性本体感受性共济失调(第1阶段)，从疾病发作开始的一年内发展为非活动性轻瘫/截瘫并伴有骨盆肢体下运动神经元体征(第2阶段)。当狗骨盆肢体变得不能走动时，狗主人通常选择安乐死。神经学缺陷进展至包括胸肢无力(第3阶段)，随后是迟缓性四肢瘫痪、全身性肌肉萎缩和脑干功能障碍(第4阶段)。dm的病理学特征类似于als的病理学特征，包括轴突丧失、继发性脱髓鞘和星形胶质细胞增生(硬化)，其在外侧索的背侧部分和中至下胸部区域的背柱中最严重。由于患有dm的伴侣犬的主人在疾病发展的不同阶段对他们的宠物实施安乐死，因此有可能通过检查在安乐死时收集的这些狗的组织来在各个发展阶段研究该疾病，从而更好理解在脊髓、周围神经和肌肉中发展的病理之间的时间关系。运动神经元病理学的任何迹象也先于显著的感觉神经元退化。因此，dm中病变分布和临床疾病进展与umn发作的als报道的相似，其中受dm影响的狗的umn体征随后进展为lmn体征。初步数据显示，疾病从阶段1(能走动、体征发作)进展到阶段2(不能走动)的中位时间为10个月(95％ci，9至12个月)(kanazonos、pithuap、johnsongc等人，clinicalprogressionofcaninedegenerativemyelopathy.2013americancollegeofveterinaryinternalmedicineannualforum.seattle,wajune16-18,2013.jvetintmed2013；24(3):699；其内容通过引用整体并入本文)。在不同品种中，从阶段1过渡到阶段2的时间没有显著差异。因此，dm的均质疾病进展将促进纵向量度和检测治疗功效。当将als的疗法从动物转化为人类(反之亦然)时，跨物种共享的敏感和客观的疾病标记物对于诊断和监测疾病的进展是必不可少的，这样治疗功效才能准确。可以使用犬dm模型研究本文所述的靶向sod1的任何aav。实施例3.测量犬dm的方法总览用于测量对上(大脑和脊髓)和下(肌肉和神经)运动神经元的损伤进展的可靠方法将提供dm的早期诊断，确定病变对临床综合征的贡献并用作治疗试验中疾病进展的客观功能性量度或生物标志物。而且，这些技术可以提供结果评估，以监测与als患者中平行的治疗试验中的疾病进展。我们的研究将评估it递送的aav.isod1以减缓疾病的进展。治疗和未治疗组之间的纵向疾病中的显著差异将提供受dm影响的狗中lmn和umn保存的可量化量度。以下是犬dm中的功能性疾病标志物研究的简要总结，用于纵向监测进展。神经丝蛋白(nf)神经丝蛋白(nfs)是有髓鞘轴突中最丰富的细胞骨架蛋白，其数量超过微管蛋白的5至10倍。nf是神经丝轻链(nf-l)、中链(nf-m)和重链(nf-h)的专性杂多聚体。与髓鞘化同时发生的轴突直径的大幅度增加需要体内nf。血液和csf中的nf-l和nf-h水平已作为多种疾病的生物标志物进行了分析。具体而言，对于人als，血液和csf中nf的测定法集中于nf-h的磷酸化形式(pnf-h)。从确诊的als病例分离出的csf中pnf-h水平与存活呈负相关，这表明pnf-h是疾病阶段的可靠标志物。此外，als中的疾病进展涉及纵向评估的血浆nf-h水平的定义轨迹，反映了神经病学减退和存活的速度。将冷冻的血清和csf样品解冻并用稀释缓冲液稀释三倍。使用人pnf-h抗体(biovendorresearchanddiagnosticproducts,modrice，捷克共和国)，根据shaw博士的实验室规程，使用商业elisa试剂盒对pnf-h进行测定；通过绘制标准品平均吸光度和对数标度的已知浓度的曲线，来构建标准曲线。csf和血液pnf-h应该是狗中dm的可靠生物标志物，并且可以用作aav-isod1药效学的微介入纵向量度。磁共振成像(mri)包括弥散张量成像(dti)和磁共振质子波谱(mrs)在内的高级磁共振成像(mri)具有作为在als分析中对umn系统进行定量评估的技术的潜力。dti能够表征水分子在体内的扩散特性。dti可以通过分数各向异性来体内定量局部微观结构中的扩散各向异性。经常使用两种基于dti的标量指数来表征局部脑组织的微观结构：表观扩散系数(adc)和分数各向异性(fa)。adc是方向平均扩散幅度的量度并与局部脑组织的完整性有关。fa代表扩散各向异性的程度，并反映了细胞结构排列的程度。已经提出各向异性的降低可以反映在周围和中枢神经系统中的轴突纤维退化和髓磷脂分解。先前已经报道，在患有als的患者的皮质脊髓束(cst)和胼胝体中观察到各向异性的降低，其发生在疾病过程的早期，并且与疾病的严重性有关。作为als的病理标志的cst退化与受dm影响的狗中见到的外侧索退化平行。外侧索和背侧索退化与背根神经节退化(即脊髓小脑束退化)平行(marchpa、coatesjr、abyadr等人，degenerativemyelopathyin18pembrokewelshcorgidogs.vetpathol2009；241-25；其内容通过引用整体并入本文)。mrs允许在体内测量脑的特定区域的神经化学谱图，并且通常依赖于对神经元完整性的标志物n-乙酰基化合物(主要为n-乙酰天冬氨酸(naa))共振的测量，表示为naa与肌酸(cr)的比例。多项研究证明了als患者的运动皮层水平的naa和naa/cr比值的降低(pioroep、majorsaw、mitsumotoh等人，h-mrsevidenceofneurodegenerationandexcessglutamate+glutamineinalsmedulla.neurology1999；53:71-79和rooneywd、millerrg、gelinasd等人，decreasedn-acetylaspartateinmotorcortexandcorticospinaltractinals.neurology1998；50:1800-1805；其全部内容通过引用并入本文)。虽然dm主要被认为是脊髓疾病，但它与als的其他强烈相似之处值得对可能在脑中也发生的神经化学变化的存在进行研究。这些神经化学变化可能在没有其他组织病理学可识别的微结构变化的情况下出现。mri可以用于研究aav-iso1的it施用的效果，包括在治疗的和未治疗的受dm影响的狗之间在减轻dti上的各向异性水平的降低和在目标cns区域中naa水平的降低的差异。运动单位数量估算(mune)运动单位数量估算(mune)是用于量化lmn或运动单位的丧失的非介入性电生理技术。mune已被用来证明临床体征发作之前lmn功能的丧失，并作为als进展的预测因子。通过将超大复合肌肉动作电位(cmap)除以平均单个运动单位电位(smup)来确定mune(mccomasaj、fawcettpr、campbellmj、sicarep，electrophysiologicalestimationofthenumberofmotorunitswithinahumanmuscle.jneurolneurosurgpsychiatry1971；34:121-1311；其内容通过引用整体并入本文)。负峰面积或幅度可用于计算smup和cmap。计算得出无单位的数字，该无单位的数字估算了神经支配该肌肉群的运动轴突的数量。研究表明，mune计数的减少与als患者的疾病进展密切相关(shefnerjm、cudkowiczme、zhangh等人，theuseofstatisticalmuneinamulticenterclinicaltrial.musclenerve2004；30:463-469；其内容通过引用整体并入本文)。纵向监测具有als早期体征的患者的值是其随时间变化的速率，因此可能需要进行顺序测量。mune技术的不同之处在于如何获取平均smup。在改良的增量刺激中，刺激电极保持在相同位置，并向周围神经施加梯度电刺激，以获得顺序增量诱发电位(mccomas等人，1971)。用于指短伸肌的经改良的增量刺激mune技术可用于受dm影响的狗的纵向研究。在dm的动态研究中将犬dm中的mune与其他临床标准一起使用不仅可以提供lmn疾病进展的敏感且特异的量度(标记物)，还可以提供与als患者使用的替代标记物平行的治疗反应的敏感且特异的量度(标记物)。半定量运动量表半定量程序可以沿着有序运动评分量表对动物的功能进行评分。olby等人改造了bbb量表，这是一种用于啮齿动物的扩展运动量表(olbynj,derisiol,munanakr等人，developmentofafunctionalscoringsystemindogswithacutespinalcordinjuries.amjvetres.2001；62:1624-1628；其内容通过引用整体并入本文。该量表经过验证可以评估急性脊髓损伤后瘫痪狗的骨盆肢体和尾功能(运动和感觉)的恢复(olbynj,harrist,burrj等人，recoveryofpelviclimbfunctionindogsfollowingacuteintervertebraldischerniations.jneurotrauma.2004；21:49-59；其内容通过引用整体并入本文)。恢复分为14个不同等级。可以修改olby运动评定量表，以评估受dm影响的狗的走动状态。为了确保观察者内部的可靠性，由5位观察者对视频进行了审查，他们每人在2周的时间内对视频片段进行3次评分，两次重复观察之间至少间隔48小时。通过使用fleisskappa统计量，使用分配给每只狗的分数的平均值和sd来计算观察者内部和观察者之间的变异系数。对于评分为第1类和第2类有中等程度的一致性，而在第3到5类中的评分基本一致[偏差校正值：kappa(95％ci)＝0.670(0.53-0.796)]。此修改后的运动评分量表将以更敏感的方式纵向评估从走动状态(第1阶段)到非走动状态(第2阶段)的步态。该评分量表可用于更精细地监控走动的严重程度，例如，得分为9等于狗变得不能走动时的10个月的时间点。电阻抗肌电图(eim)电阻抗肌电图(eim)是一种测量局部组织阻抗的非介入性电生理技术。所有阻抗方法都依赖于以下基本原理：如果将高频和低强度的交流电施加到物质上，则能量在通过该物质时会耗散掉，从而产生可测量的电压。因此，电阻抗可用于测量组织对施加的电流的影响。阻抗可以根据欧姆定律以数学方式描述：v电压＝i电流xr电阻或v＝ixz，其中z代表电路的复阻抗，其是其固有电阻和电抗(x)的组合；后者是电路中电容器和/或电感器的存在产生的对电流流动的阻碍。骨骼肌具有独特的强各向异性或对电流的方向依赖性。肌细胞是圆柱形的，其允许电流根据电流的方向以不同的阻抗值轻松流过。肌细胞膜的脂质双层充当电容器，是电抗(x)的来源，而细胞内液和细胞外液则充当电阻，是其电阻(r)的来源。eim的主要结果变量是相位角(θ)，关系为θ＝反正切函数(x/r)。使用跨越目标区域或空间平均值θavg(主要结果值/变量)的多个电极进行测量。在患病的肌肉中，结构和组成的变化将反映在肌肉局部阻抗的改变中。患病的肌肉可表现为肌纤维萎缩、增加的肌内膜结缔组织和脂肪以及水肿；都会影响电阻和电抗。主要基于对als和dm患者的组织的事后检查，普遍认为als的肌肉萎缩特征是运动神经元退化的继发因素。但是，在als和dm中，肌肉萎缩可能在很大程度上独立于运动神经元退化并且甚至在运动神经元退化之前发生。为了确定疾病变化的模式，eim参数可以用作疾病进展和结果量度的标志物。根据神经根病和炎性肌病的研究，较低的θavg值反映更严重的疾病。als患者和转基因als大鼠的长期研究显示了θavg数值的稳步下降(wangll、spiekeraj、lij、rutkovesb，electricalimpedancemyographyformonitoringmotorneuronlossinthesod1g93aamyotrophiclateralsclerosisrat.clinneurophysiol.2011dec；122(12):2505-11；tarulliaw、garmirianlp、fogersonpm、rutkovesb，localizedmuscleimpedanceabnormalitiesinamyotrophiclateralsclerosis.jclinneuromusculdis.2009；10(3):90-6；其每一个的内容均通过引用整体并入本文)，以及与生存和其他常规量度(即用力肺活量和als功能评分量表)的相关性。目前，在受dm影响的狗中缺乏有关eim使用的此类数据。eim的应用具有的一个主要优势是它可以在清醒的动物中轻松执行，而迄今为止讨论的大多数其他诊断标记物都需要全身麻醉。受dm影响的狗应该有类似于人类als患者的eim值变化，并且用aav.isod1治疗将影响这些值。实施例4.靶向sod1以治疗als总览将使用针对犬退化性脊髓病(dm)的基因治疗方法研究治疗als的靶向sod1的aav基因疗法，dm是伴侣犬的天然疾病，其与某些形式的als相似。这项研究将评估剂量范例，以确定基因转移到靶区域的均匀分布。之前已显示鞘内(it)施用aav比全身给药更大的cns分布，包括运动神经元的显著转导、较少的外周组织暴露以及降低的免疫应答。可以评估it施用的靶向sod1的aav基因疗法在正常狗和天然存在的als动物模型(犬dm)中的安全性、药理学(包括分布)和功效。构建体、衣壳和剂量范例的选择为了鉴定最佳rnai序列，设计、合成并在hela细胞中体外测试了选择性靶向sod1的169个序列。在100pm时，大约25个序列抑制sod1mrna超过80％。给药aav需要以剂量范例来递送，该剂量范例提供了沿cns的头尾轴相对均匀的基因转移分布。这种分布应显示出治疗性翻译，以治疗人类als。可以改变诸如输注的体积、速率和持续时间的参数，以具有用于治疗als的转基因表达的最佳分布。实施例5.靶向sod1的aav在正常狗中的药理研究给药方案在hek293细胞中使用三重转染产生靶向sod1的aav(aav.isod1)。通过评估直接施用cns后hsod1转基因小鼠(tg(sod1)3cje/j；thejacksonlaboratory)中的sod1压制，测试该aav.isod1，然后测试狗，以确保其体内药理学活性。通过在体外中和抗体测定中评估血清样品，筛选多达约80只雄性杂种狗(marshallbioresources，northrose，ny，usa)针对aav衣壳的预先存在的免疫力。抗体效价小于1:10的动物将是该研究的候选对象。将通过外科手术给16只雄性杂种狗(包括2只备用狗)植入导管。将狗分为四个治疗组，并通过it给药施用以aav.isod1或媒介物，如表11所示。部位将是腰椎或小脑延髓池。表11.研究设计在预定的间隔后，将评估狗的临床观察、体重、功能性观察组(functionalobservationalbattery)、神经学检查、临床病理学、器官重量、总体病理学、组织病理学(h&e，扩大的神经病组)、脊髓和其他组织中sod1压制和载体基因组分布和csf中潜在的生物标记物。安全性和药理学将使用注射时重15-30公斤的雄性杂种犬(marshallbioresources，northrose，ny，usa)。给药后，将监测每只狗的总体外观和行为的变化。从给药的第一天开始，每天至少两次观察动物的发病率和死亡率。在整个研究期间，在手术后，每天至少要两次记录临床体征。在研究期间确定为濒死的任何动物将被处死。每周进行一次全面的神经学检查。将在手术前、手术当天、研究期间每周和尸检时记录所有动物的体重。从手术前开始每天收集食物消耗，并在整个治疗期间持续进行。从禁食的动物收集血液和尿液样本以进行临床病理学(在给药前第1天、第3天以及恰在尸检之前的第28天)、血清抗体分析(在给药前第1天、第3天以及恰在尸检之前的第28天)和细胞因子分析(在给药前第1天以及恰在尸检之前的第28天)。恰在给药前和第28天收集csf样品，以进行抗体分析和潜在的生物标志物测定。施用aav后四周，将对所有动物实施安乐死并用盐水灌注，然后收集包括脑、脊髓、背根神经节、肝脏、心脏、脾脏、肾脏和其他器官在内的组织。记录器官重量和总体病理。安乐死时，将脑切成3毫米冠状切片厚度的脑基质。左半球脑切片将速冻，并在-60℃或更低的温度下保存直至装运。脊髓将被切成大约25个段，包括颈段、胸段、腰段和骶段。选定的段将进行快速冷冻，并在-60℃或更低的温度下保存直至装运。也将收集脊髓神经根和背根神经节(drg)。将右半球脑切片和选定的脊髓段(例如c1、c7、t8和l6/7)以及对应于c1、c7、t8、l6和s2的脊神经和drg对浸入固定在冷却的4％多聚甲醛(pfa)中，并在1-8℃搅拌下保持72小时。然后将组织转移至0.1m磷酸盐缓冲盐水中的30％蔗糖中，并冷藏(2-8℃)直至装运。新鲜冷冻的组织将用于分析，其可包括对载体基因组、mrna和/或转基因表达的定量。固定后的组织将用于组织病理学，包括苏木精和曙红(h&e)染色，以及扩大的神经病理学组。临床病理学将进行的临床病理包括血液学、血清生物化学、csf分析、尿液分析和凝血评估。尽管会记录任何超出参考范围的参数，但将使用anova在统计学上比较平均肝酶alt、ggt和alp，肝功能指标(白蛋白、葡萄糖、胆固醇、胆红素、血尿素氮(bun))和肌酐。如果任何肝酶超出实验室建立的参考范围，则将测定空腹血氨浓度以评估该狗的肝功能。除bun和肌酐外，还将使用尿比重、尿蛋白和尿管型来评估肾功能。如果检测到的蛋白尿大于痕量，则将执行蛋白：肌酐比。将评估凝血酶原时间、部分促凝血酶原时间和颊粘膜出血时间的凝血异常。将评估csf的蛋白质浓度、细胞构成和细胞类型。抗体分析将使用基于细胞的体外测定来分析血清和csf的中和抗体，以使用报告基因评估血清或csf样品对aav转导的功能抑制。细胞因子分析将使用犬特异性测定进行血液和csf的细胞因子分析。将要评估的细胞因子包括il-1β、il-1ra、il-6、ifn-γ和tnf-α。组织学程序将进行组织学程序和评估。脊髓和其他组织样品将被修整，包埋在石蜡中，并切片(约5微米)，并用h&e和扩大的神经病理学组染色。h&e染色将用于评估一般的组织病理学变化，而fluoro-jadeb和细胞类型特异性标记物(例如neun、gfap、iba1)的免疫组织化学将用于评估神经病理学变化。sod1mrna定量将使用定量rt-pcr以测量mrna水平来评估脊髓、drg和其他组织样品中sod1的压制。简而言之，将使用标准方法通过qrt-pcr测定sod1和内源gapdh和/或β-肌动蛋白mrna的mrna水平。利用内源性对照mrna的平均水平对每个样品的sod1mrna的平均水平标准化。样本将包括脊髓和整个drg的横截面，以及通过形态学和免疫组织化学标记(例如分别为胆碱乙酰基转移酶、gfap和小白蛋白)鉴定的运动神经元、星形胶质细胞和大型感觉神经元，并且然后通过激光捕获显微切割术收集。sod1蛋白测定将使用western印迹分析来评估脊髓和其他组织样品中的sod1压制。将采用标准方法。载体基因组定量将使用定量pcr来评估脊髓和其他组织样品中的载体基因组。简而言之，将使用标准方法通过定量pcr测定载体基因组和宿主二倍体基因组的拷贝。利用宿主二倍体基因组拷贝对每个样品的载体基因组拷贝的平均水平标准化。生物标志物测定可以评估csf样品中的生物标志物。为了随后分离csf外来体，样品将在收集后立即通过离心和过滤进行处理，然后速冻并在-60℃或更低的温度下保存直至装运。实施例6.靶向sod1的aav在受dm影响的狗中的功效研究选择要研究的动物基于轻度全身性本体感受性共济失调的体征，将选择在dm的第1阶段早期的受dm影响的伴侣犬(n＝20)。dm的诊断将基于临床体征、整个脊髓和csf分析的正常mri、缺乏电生理异常和sod1:c.118a等位基因的纯合性。狗还将接受其他主要身体疾病的筛查。给药方案通过baculo/sf9系统或在hek293细胞中三重转染的方法，产生靶向sod1的aav(aav.isod1)。通过在直接cns施用后在hsod1转基因mic(tg(sod1)3cje/j；thejacksonlaboratory)中评估sod1压制，测试该aav.isod1，然后在狗中测试它以确保它在体内是有药理活性的。通过在体外中和抗体测定中评估血清样品，筛选受dm影响的狗预先存在针对aav衣壳的免疫。抗体效价小于1:10的动物将是该研究的候选对象。将狗分为两个治疗组，并使用it给药范例(速率、剂量和体积)施用以aav.isod1或媒介物，在正常狗的研究中已证明该方法安全且具有药理活性(请参见实施例5)。表12显示了受dm影响的狗的研究设计。部位将是腰椎或小脑髓池。表12.研究设计在预定的间隔后，将评估狗的神经学缺损、从临床体征发作至不能走动的下肢轻瘫的时间、步态分级量表、神经传导研究、肌电图、运动单元数量估算(mune)、电阻抗肌电图(eim)、磁共振成像(mri)、临床病理学研究、潜在的csf生物标志物和组织病理学。监测受dm影响的狗评估动物的身体和神经学检查、血样(bloodwork)、csf取样和尿分析以及纵向评估2至3个月(基线和多达4次)并且每月评价动物的步态。评估时间在下表13中列出：表13.评估监测步态和神经学结果疾病进展将从第1阶段(能走动、体征发作)至第2阶段(不能走动)进行监测。未治疗的受dm影响的狗可能会在10个月内从第1阶段进展到第2阶段(95％ci，9-12)。kaplan-meier(km)图将用于跟踪在整个队列中dm的进展，以及可能地从dm第1阶段过渡到第2阶段的队列的比例。因此，计算未进展到第二阶段的狗的比例(以及相关的单侧95％ci)。将疾病第1阶段和第2阶段之间的狗的步态录像并由2个有经验的观察者使用改良的olby运动评分量表进行分级。静止的狗将在整个疾病过程中受到监控，直到安乐死为止。pnf-h监测治疗和未治疗的受dm影响的狗的血清和csf中的pnf-h。在指定时间和安乐死时收集血清和csf样品。分批所有样品并发送到encor(gainesville,fl)进行测定和分析。治疗组之间的比较通过重复量度anova，然后进行holm-sidak成对比较进行。细胞因子分析使用犬特异性测定进行血液和csf的细胞因子分析。评估的细胞因子包括il-1β、il-1ra、il-6、ifn-γ和tnf-α。dti和mrs在3个时间点，在aav.isod1治疗的狗上进行mri。脑的所有mri研究都利用先前确定的犬参数使用3台teslatoshiba扫描仪进行。在30个方向上进行dti以实现优异的分辨率。除了使用mprage序列进行标准3dt1解剖成像外，还将生成fa、adc和颜色图以进行数据分析。以先前建立的规程对所有狗的脑进行单体素和多体素mrs采集，重点是丘脑、红色核和尾状核作为目标区域。计算adc、fa、naa浓度和naa/cr的平均值、中位数和标准偏差的描述性统计量。受dm影响的狗和未受影响的狗中这些值之间的差异通过配对学生t检验进行评估(p<0.05)。建立相关性系数以比较mr值与疾病严重程度。电诊断测试和mune在指定时间点进行预期的电诊断评价。使用cadwellsierra-wavetm电诊断仪完成测试。由于疾病发作经常是不对称的，因此将edb肌肉的改良的增量刺激mune技术应用于骨盆肢体二者。一旦建立了亚阈值水平，将施加刺激增量，直到观察到不同的诱发电位。记录10个诱发电位并将其用作单个运动单元电位(smup)。分为超大复合肌肉动作电位的平均smup将产生mune。每个程序进行两个连续试验并取平均值以减少变异性。也进行常规全身emg和尺神经和坐骨神经-腓神经的神经传导研究(包括f波)。生成频率分布图，以检查在疾病第1阶段和第2阶段受dm影响的治疗和未治疗的狗中mune数据的正常性，并与年龄匹配的正常狗进行比较。评估每个肢体的mune的纵向衰减(declination)。非正态分布的原始数据将被log转换。计算每个疾病阶段(1-2)内的平均mune，并使用2样本t检验比较各组(治疗狗与未治疗狗)和疾病阶段(1-2)之间的差异。应用bonferroni调整以报偿dm阶段之间估计的mune平均值的多次比较。与每个临床阶段相对应的平均值构成受dm影响的狗疾病进展的定量标记物。电阻抗肌电图(eim)用如本领域所述和设备规程(df50(impedimed,inc.,sandiegocalifornia))所述的技术进行eim测量。阻抗测量系统由一个多频同步放大器偶联非常低电容的有源探头组成，可提供0.5-1000khz的数据。选定的肌肉包括盆骨肢体的颅骨胫骨和股二头肌；胸部肢体的桡侧伸腕肌和肱三头肌；和舌头。除去覆盖每个肢体肌肉的目标区域上方的毛发。为了确保在评估时间之间目标肌肉上电压电极和电流电极的相似定位，使用精确定位的纹身作为参考点。获得的值包括电阻(r)和电抗(x)，来自其的第三参数即相位(θ)。以不同的频率计算电抗斜率、相位斜率和电阻对数斜率。在指定的时间点执行该程序，并将体征发作的时间与不能走动的状态、步态得分和mune值相关联。生成频率分布图以评估数据的正态性。如果原始数据不是正态分布的，则使用log转换来标准化数据。因此，计算每个疾病阶段(1-2)内的总体平均mune定量结果，并使用2样本t检验计算疾病阶段(1-2)与正常狗之间的差异。进行bonferroni调整以报偿由于dm阶段之间mune和eim平均值的多次比较而产生的潜在问题。相互比较eim和mune数据，并与从体征发作到不能走动状态的时间和步态得分进行比较。对于所有相关性分析，进行spearman秩相关性。使用mann-whitney检验进行两组比较。统计学显著性将为p<0.05。在总结实验时进行功效分析，以确定显著性所需的额外样品的数量和未来研究的组大小。rutkove博士协助进行数据解释和统计比较。实施例7.靶向狗sod1的构建体的体外研究a.靶向狗sod1的sirna的筛选7种靶向狗sod1(dsod1)的sirna构建体(10nm)和媒介物(阴性对照)转染d-17细胞(atcc目录号crl-1430tm)或cf2th细胞(atcc目录号crl-183tm)。两种细胞类型的细胞培养基是含有2mmglutamaxtm补充物、1×mem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs(所有试剂均购自lifetechnologies)的dmem/f-12。24小时后，收获培养物以通过rt-qpcr测量sod1和gapdhmrna。将sod1mrna水平相对于gapdhmrna水平标准化，然后相对于媒介物(阴性对照)组表述标准化的sod1mrna水平。用sod1sirna(sisod1)处理后两种细胞类型的相对sod1mrna水平示于表14。表14.sod1sirna构建体转染后d-17和cf2th细胞中相对sod1mrna水平用具有双链体idd-4000、d-4001、d-4004和d-4005的sod1sirna构建体的治疗在d-17细胞和cf2th细胞中均导致大于50％的dsod1mrna水平的压制。b.自互补载体的药理学评估对于本研究，将编码靶向狗sod1(dsod1)的sirna构建体的自互补载体包装在aav2中。对于本研究，使用退行性脊髓病(dm)狗原代脑星形胶质细胞、dm狗原代脊髓星形胶质细胞和d-17细胞(atcc目录号crl-1430tm)来测试构建体。用于d-17细胞的细胞培养基是包含2mmglutamaxtm补充物、1xmem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs的dmem/f-12(所有试剂均购自lifetechnologies)。用于原代星形胶质细胞的细胞培养基是agmtm星形胶质细胞生长培养基(目录号：cc-3186，lonza)。将细胞接种到96孔板中，并一式三份用aav2-dsod1mirna载体感染(在200ul细胞培养基中的1-2×104个细胞/孔)。用载体感染后48小时，通过rt-qpcr测量狗sod1和gapdhmrna。将sod1mrna水平相对于gapdhmrna水平进行标准化，然后相对于阴性对照组进行表述。表15显示了以1×105moi的scaav2-dsod1mir载体感染后，dm狗原代脑星形胶质细胞、dm狗原代脊髓星形胶质细胞和d-17细胞中的相对dsod1mrna水平。表15.用scaav2-dsod1mir载体感染后相对sod1mrna水平用包装在aav2中的构建体voysod1mir104-788.2、voysod1mir104-829、voysod1mir104-789、voysod1mir127-788.2、voysod1mir104-830和voysod1mir127-788的处理在所有三种细胞都有效压制dsod1mrna至少45％。表16显示了用不同moi(1x102、1x103、1x104或1x105)的包含构建体voysod1mir104-788.2、voysod1mir104-789、voysod1mir127-788.2或voysod1mir104-830的scaav2-dsod1mir载体感染后，dm狗原代脊髓星形胶质细胞中的相对dsod1mrna水平。在这些moi上还评价了对照aav2.egfp载体。表16.在用scaav2-dsod1mir载体或对照载体(aav2.egfp)感染后，dm狗原代脊髓星形胶质细胞中的相对sod1mrna水平–剂量-应答c.sod1构建体筛选将靶向狗sod1的4种sirna构建体(d-4000、d-4007、d-4008、d-4002)转染到cf2th细胞(atcc目录号crl-183tm)中(2x104个细胞/孔，在96孔板中，每种条件一式三份)。细胞培养基是含有2mmglutamaxtm补充物、1xmem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs的dmem/f-12(所有试剂均购自lifetechnologies)。48小时后，收获培养物以测量sod1和gapdhmrna水平。将dsod1mrna水平相对于gapdhmrna水平进行标准化，然后相对于阴性对照组进行表述。这些相对dsod1mrna水平在表17中显示。表17.在以不同剂量的狗sod1sirna转染后cf2th细胞中的相对sod1mrna水平d-4000、d-4007、d-4008或d-4002的转染在cf2th细胞中引起剂量依赖性sod1沉默。d-4000提供了dsod1mrna的最大压制(～64％压制)。将靶向狗sod1(dsod1)的7个sirna构建体和对照转染(10nm)到hek293t、cf2th、d-17和狗原代脊髓星形胶质细胞中。24小时后，收获培养物以测量sod1mrna水平。相对dsod1mrna水平在表18中显示。表18.相对sod1mrna水平在hek293t细胞中，所有狗sod1sirna(10nm)均导致sod1mrna水平的强烈压制(压制75-95％)。在cf2th细胞中，10nm狗sod1sirna(d-4000、d-4005、d-4004、d-4001)的转染导致50-60％的sod1mrna压制。在d-17细胞中，10nm狗sod1sirna(d-4000、d-4005、d-4004、d-4001)的转染导致55-65％的sod1敲低。在狗原代脊髓星形胶质细胞中，以10nm转染狗sod1sirna(d-4000、d-4004、d-4001)导致30-45％的sod1mrna水平压制。选择双链体d-4000、d-4001、d-4004和d-4005进行进一步研究。d.aav2载体在hek293t中的评估对于该研究，将具有靶向狗sod1(dsod1)的sirna构建体的aav载体包装在aav2中。将hek293t细胞接种到96孔板中，并以moi为1x105、1x104的aav2-dsod1mirna载体或对照一式三份(在200ul细胞培养基中4x104个细胞/孔)感染。用载体感染后48小时，通过rt-qpcr测量狗sod1和gapdhmrna水平。将sod1mrna水平相对于gapdhmrna水平进行标准化，然后相对于阴性对照组进行表述。表19显示了用moi为1x105的scaav2-dsod1mir载体感染后，hek293t细胞中相对sod1mrna水平。表19.以moi为1x105的aav感染后hek293t细胞中相对sod1mrna水平表20显示了用moi为1×104的scaav2-dsod1mir载体感染后，hek293t细胞中的相对sod1mrna水平。用载体感染后48小时，通过rt-qpcr测量狗sod1和gapdhmrna水平。将sod1mrna水平相对于gapdhmrna水平标准化，然后相对于阴性对照组进行表述。表20.用moi为1x104的aav感染后hek293t细胞中的相对sod1mrna水平在1x105的moi下，voysod1mir127-805c、voysod1mir116-788、voysod1mir114-788、voysod1mir102-788、voysod1mir109-788和voysod1mir127-788产生了hek293细胞中sod1mrna的至少60％的减少。voysod1mir127-788导致hek293t细胞中sod1mrna减少了99％。在ie4的moi下，voysod1mir127-789和voysod1mir127-829导致sod1mrna减少57-68％，并且voysod1mir104-788-2、voysod1mir104-789、voysod1mir104-829、voysod1mir104-830和voysod1mir127-830导致sod1mrna减少85-99％。e.包装在aav2中的构建体的评估将靶向狗sod1(dsod1)的sirna构建体包装在aav2中，并感染cf2th、d-17细胞、狗脊髓星形胶质细胞和成纤维细胞。用于d-17细胞和cf2th细胞的细胞培养基是包含2mmglutamaxtm补充物、1xmem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs的dmem/f-12(所有试剂均购自lifetechnologies)。用于原代星形胶质细胞的细胞培养基是agmtm星形胶质细胞生长培养基(目录号：cc-3186，lonza)。用于成纤维细胞的细胞培养基是包含2mmglutamaxtm补充物、1xmem非必需氨基酸溶液、10mmhepes和10％fbs、2ng/ml人fgf-2和5ug/ml人胰岛素的dmem/f-12(所有试剂均购自从lifetechnologies)。将细胞接种到96孔板中，并一式三份(在200ul细胞培养基中，1-2e4个细胞/孔)用aav2-dsod1mirna载体感染。在用moi为1×105或1×106的载体感染后48小时，通过rt-qpcr测量狗sod1和gapdhmrna。将dsod1mrna水平相对于gapdhmrna水平进行标准化，然后相对于阴性对照组进行表述。表21和22显示了以1×105moi的scaav2-dsod1mir载体感染后的相对dsod1mrna水平。表21.以moi为1x105的aav感染后cf2th、d-17、狗脊髓星形胶质细胞和狗成纤维细胞中的相对dsod1mrna水平在cf2th和d17细胞中，用moi为1x105的含有voysod1mir104-788、voysod1mir114-788、voysod1mir127-805c、voysod1mir109-788、voysod1mir102-788或voysod1mir116-788的scaav2-dsod1mir载体感染导致sod1mrna水平压制～30-45％。但是，用moi为1x105的含有voysod1mir127-788的scaav2-dsod1mir载体感染后导致sod1mrna水平压制～70-80％。在狗原代细胞(脊髓星形胶质细胞和成纤维细胞)中，moi为1x105的voysod1mir127-788导致sod1mrna敲减～35-45％。表22.在用moi为1x105的aav感染后，狗脑星形胶质细胞、d-17细胞、狗脊髓星形胶质细胞和狗成纤维细胞中的相对dsod1mrna水平在狗脑星形胶质细胞、狗脊髓星形胶质细胞、狗成纤维细胞和d-17细胞中，用含有voysod1mir104-829、voysod1mir104-789、voysod1mir127-788.2、voysod1mir104-830或voysod1mir104-788.2的scaav2-dsod1mir载体感染显示至少约50％的sod1mrna压制。表23显示了用moi为1×106的scaav2-dsod1mir载体感染后的相对dsod1mrna水平。表23.在用moi为1x106的aav感染后，狗脑星形胶质细胞、d-17细胞、狗脊髓星形胶质细胞和狗成纤维细胞中的相对dsod1mrna水平在d17细胞中，用moi为1x106的含有voysod1mir127-788的scaav2-dsod1mir载体感染导致sod1mrna的最大压制(～90％)。在狗原代细胞中，moi为1x106的voysod1mir127-788导致44-67％的sod1mrna压制。在脊髓星形胶质细胞和d-17细胞中，用moi为1x102、1x103、1x104、1x105和1x106的含有voysod1mir104-788.2、voysod1mir104-789、voysod1mir104-829、voysod1mir104-830或voysod1mir127-788.2的scaav2-dsod1mir载体的转染，进行剂量-应答研究。用含有voysod1mir104-788.2、voysod1mir104-789、voysod1mir104-829、voysod1mir104-830和voysod1mir127-788.2的scaav2-dsod1mir载体，在d-17细胞和脊髓星形胶质细胞中获得了剂量依赖性sod1mrna沉默，以moi为1x102和1x103的aavsod1mirna载体感染在所述两种细胞类型获得了50％的sod1mrna敲低。在狗脑星形胶质细胞、脊髓星形胶质细胞、cf2th细胞和d-17细胞中，用moi为1x102、1x103、1x104、1x105和1x106的包含voysod1mir127-788的scaav2-dsod1mir载体进行了进一步的剂量-应答研究。在cf2th细胞、d-17细胞和脊髓星形胶质细胞中，1x103和1x104的moi实现了sod1mrna的50％的敲低。在狗脑星形胶质细胞中，至少1x105的moi实现了sod1mrna的50％的敲低。实施例8.构建体的体内研究a.小鼠体内选择研究通过以0.5ul/min单侧纹状体内输注5ul测试物品，给表达人野生型sod1的转基因小鼠(c57bl/6-tg(sod1)3cje/j)施用6个包装在aavdj中的候选物之一(voysod1mir104-829、voysod1mir104-789、voysod1mir127-788.2、voysod1mir104-788.2、voysod1mir104-830、voysod1mir127-788)或媒介物。载体浓度为1.5x1012vg/ml，对应于总施用剂量7.5x109vg。给药四周后，通过rt-qpcr评估来自施用部位的纹状体组织的sod1mrna相对于媒介物组的压制，并通过深度测序评估pri-mirna加工。表24显示了利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)标准化的并随后相对于媒介物组表述的sod1mrna水平(每组n＝5)。表24.包装在aavdj中的pri-mirna构建体对人野生型sod1小鼠中hsod1mrna的压制还使用下一代测序评估了voysod1mir104-788.2和voysod1mir104-829，以评估pri-mirna加工的精度和效率；结果示于表25。在表25中，g/p比是指引导链/过客链的比。表25.aavdj.cb6.mirsod1施用后在人野生型sod1小鼠中pri-mirna加工的精度和效率b.正常狗中的体内药理学和安全性研究用于这些研究的aav载体通过使用三重转染方法在hek293细胞中产生。对正常狗鞘内施用剂量为2x1013vg或6x1013vg的scaavrh10.h1.mir104-788.2(itr至itr序列提供为seqidno：145)或scaavrh10.h1.mir104-829(itr至itr序列提供为seqidno：146)或媒介物(n＝4每组)。在4周后安乐死动物，并收集样品用于进一步分析。通过rt-qpcr评估来自l5、t7或c4的背根神经节(drg)的狗sod1(dsod1)、gapdh、丙氨酰-trna合成酶(aars)和x-脯氨酰氨肽酶1(xpnpep1)mrna的水平。将dsod1mrna水平相对于管家基因(gapdh、aars和xpnpep1)的几何平均值标准化，然后相对于媒介物组表述。表26显示了有和没有免疫抑制的针对scaavrh10.h1.mir104-788.2的drg中的相对sod1mrna水平。表27显示了有免疫抑制的针对scaavrh10.h1.mir104-829的drg中的相对sod1mrna水平。表26.用scaavrh10.h1.mir104-788.2处理后drg中的sod1mrna表达表27.用scaavrh10.h1.mir104-829处理后drg中的sod1mrna表达评估了肝脏中的dsod1mrna水平，并且在表28中显示了scaavrh10.h1.mir104-788.2的结果。表28.用scaavrh10.h1.mir104-788.2处理后肝脏中的sod1mrna表达对于脊髓中的dsod1mrna水平，剂量为6x1013vg(有免疫抑制)的scaavrh10.h1.mir104-788.2导致相对于媒介物的41±9％的压制(平均值±标准偏差)(将dsod1的脊髓腹侧角mrna水平相对于gapdh、aars和xpnpep1的几何平均值标准化)。通过使用duplexrnascope原位杂交共检测脊髓腹侧角中的vg和dsod1mrna，观察到相对于媒介物组，剂量为6x1013vg的scaavrh10.h1.mir104-788.2时在腹侧角的vg+细胞中的sod1mrna减少。剂量为6x1013vg的scaavrh10.h1.mir104-788.2还具有高的引导/过客链比(drg中为170，脊髓腹侧角中为373)、在引导链5'端的精确加工(>90％)，和相对于mirna的总内源库的低水平的引导链和过客链(drg为6.7+/-5.1％，脊髓腹侧角为0.9+/-0.6％)。在有和没有免疫抑制的情况下，scaavrh10.h1.mir104-788.2在所有动物中均具有良好的耐受性。对体重、临床体征、临床病理(第15天和第29天)、脑脊液(csf)化学(第29天)或csf总细胞数(第29天)没有明显的与载体相关的影响。drg没有肉眼可见的病变和组织病理学，脊髓和脑也没有显示与载体相关的显著发现。scaavrh10.h1.mir104-788.2被选择用于其他研究，因为它显示了安全性、体外剂量依赖性敲低、人野生型sod1转基因小鼠中sod1mrna的62％敲低以及在正常狗drg中高达74％的sod1敲低和脊髓中高达41％的敲低。实施例9.正常狗中aav的耐受性和分布先前没有报道aavrh10衣壳的分布，因此需要进行研究以确认在狗中aavrh10是否与其他物种中一样分布于运动神经元和drg神经元。这项先导研究的主要目的是评估犬模型中aav腰椎it递送的急性耐受性。没有进行神经病理学或临床病理学/毒理学分析。预筛选年龄13mo(10-13kg)的6只成年雄性比格犬中针对aavrh10和aav9的血清中和抗体滴度。6只动物植入了鞘内(it)导管，其尖端位于上腰椎并终止于皮下进入端口。在给药之前，使用环孢霉素和霉酚酸酯对动物进行免疫抑制。在镇静的同时，以1小时的间隔给动物施用测试物品(剂量2.7×1013vg)的3次1ml注射液(1ml/分钟)，总时间约2.5小时。第6只动物(第4组)用于收集对照组织。表29显示了研究设计。在表29测试物品下，“sc”表示自互补，cba是cba启动子，hfxn是人共济蛋白，ha是ha标签。表29.研究设计使用aav9或aavrh10衣壳向动物注射aav载体(scaavx-cba-hfxn-ha)。2.5周后，给动物灌注生理盐水，并处理脊髓、drg和脑以进行分析。一半样品在4％多聚甲醛中后固定72-96小时，而另一半则新鲜冷冻。第1-3组中动物的生活观察和测量包括体重、食物消耗和临床观察。在这项研究过程中，没有与测试物品相关的临床体征。没有与测试物品有关的体重或食物消耗量变化。尸检时未观察到与测试物品相关的肉眼可见的病变。用ha-免疫组织化学对脊髓和drg进行的组织学评估证明了运动神经元转导在所有动物的l5脊髓中最突出。观察到梯度模式，其鼻端水平显示较少的运动神经元染色(c1<t4<l5)，与治疗组无关。在两个治疗组的所有水平(颈、胸和腰)的drg中均观察到感觉神经元转导。总之，aav9和aavrh10构建体的it递送均在脊髓和drg神经元中产生了积极的抗ha免疫反应性。这些结果表明，每小时进行3次–1ml腰椎注射的it给药范例可以达到目标转导水平，尤其是在脊髓的更尾部的区域，而在脊髓的更吻部的区域则转导较少。实施例10.csf和血清神经丝轻链水平作为生物标记背景犬退行性脊髓病(dm)是一种迟发性进行性神经退行性疾病，影响许多纯种和混种狗。临床体征是涉及中枢神经系统和周围神经系统的多系统神经退化的结果。dm最初表现为痉挛性上运动神经元轻截瘫和全身本体感受性共济失调(第1阶段)。进行性神经退化导致不能走动的轻截瘫/截瘫(第2阶段)和胸肢轻瘫(第3阶段)。终末期疾病最终表现为弛缓性四肢瘫痪、广泛的肌肉萎缩和延髓功能障碍(第4阶段)。超氧化物歧化酶1基因(sod1)突变(sod1:c.118a，sod1:c.52t)是dm的危险因素，大多数情况是由于常染色体隐性遗传所致。认为该疾病与某些形式的人类肌萎缩性侧索硬化症(als)的病因、进展和预后相似。诊断基于排除其他类似疾病，此时，只有死后通过脊髓的组织病理学检查才能对dm进行明确的诊断。神经丝轻链(nf-l)是一种有髓鞘的运动轴突的丰富结构蛋白，有望作为动物和人类运动神经元疾病(包括als)的流体生物标记物。血液和csfnf-l水平在als中具有诊断价值，并且可能与疾病进展相关，并且因此可以作为治疗效果的生物标记物。进行了一项研究，以评估血清和csfnf-l水平作为dm狗诊断和疾病进展的潜在生物标记物。研究设计针对该研究分析了来自三种类型的狗的血清样品和csf样品。第1组包括年轻(1至5岁)和年老(>9岁)正常对照狗(n＝13-17)，第2组包括第1至4阶段的受dm影响的狗(对于sod1c.118a等位基因而言是纯合的)(n＝22-25)，第3组包括年老的无症状狗(对于sod1c.118a等位基而言是纯合的)。分析和结果：正常狗在样品测试之前，评估数字elisa的稀释线性，正常狗csf和血清中nfl的稳定性和加标回收率(spikerecovery)。针对人nf-l(其与犬nfl98％保守)使用市售数字elisa(quanterix)进行分析。图1显示了quanterixsimoahnf-l(beta)测定的代表性nf-l校准曲线。将检测限(lod)计算为平均每珠酶(aeb)等于零校正剂+2.5sd平均值的nf-l水平。在8只正常狗的csf中测试了针对nf-l的数字elisa的稀释线性。如表30所示，与1:40相比，在1:100的稀释度下观察到的浓度在±20％以内。针对狗csf，随后的测定在1：100的最小稀释度下进行。在表30中，n/a表示没有可用的数字，*表示读数超出标准曲线范围的样品。表30.正常狗中csf的稀释浓度和线性(1:40)针对nfl，在3只正常狗的血清中测试了数字elisa的稀释线性。如表31所示，与1：100相比，在1：200的稀释度下观察到的在±20％以内的浓度。针对狗血血清，随后的测定在1：200的最低稀释度下进行。表31.针对正常狗的血清的稀释浓度和线性(1：40、1：100、1：200)在4只正常狗的csf(数据示于图2a和2b)和血清(数据示于图3a和3b)中测试了nf-l的样品稳定性。将样品置于不同的处理条件下，包括-80℃、4℃过夜、室温4小时或3个冻融循环。在图2a、2b、3a和3b中，o/n＝过夜，rt＝室温，f/t＝冻融循环。通过数字elisa(quanterix)一式两份测定nfl浓度。3个f/t循环对样品nf-l浓度仅具有微小的影响。图2b示出了图2a中的数据，表示为-80℃对照的百分比，并且图3b示出了图3a中的数据，表示为-80℃对照的百分比。如果保存在冰上，样品在整个实验过程中表现稳定。通过补充利用增加浓度的重组人nf-l的2只正常犬的缓冲液对照、csf或血清，来测试nf-l的加标回收率。csf样品以1：100稀释度测定，血清样品以1：400稀释度测定。如表32所示，平均加标回收率接近于可接受标准或在可接受标准之内，但是在加标水平之间观察到显著的变异性。在表32中，nf-l样品栏中的“csf”是指csf样品，“s”是指血清样品。表32.狗csf和血清中nf-l的回收分析和结果：dm狗比较dm狗和对照狗的csf中的nf-l浓度，并且结果(每只动物的平均值)显示在图4a中。一式两份以1：500稀释度分析样品(％cv值范围从0-10％；误差为sem；具有tukey多重比较检验的单向anova；相对于年老对照*p<0.05，**p<0.01)。与年老(>9岁龄)和年轻(1-5岁龄)对照组相比，所有阶段的dm狗均显示出csfnf-l的强烈增加。合并的dm队列显示47,068pg/ml的平均nf-l浓度，相比之下，年老对照组为6,864pg/ml(人csf为～2100pg/ml)。nf-l增加显示在初始疾病阶段最显著并且随严重性观察到了增加。dm2组往往相比于dm1组具有增加的nf-l水平(p＝0.1)。此外，相比于年轻对照组，犬的年老对照组表现出更高水平的nf-l(6864pg/ml比3053pg/ml)，表明正常狗csf中年龄依赖性的nf-l增加。比较dm和对照狗的血清nf-l浓度，并且结果(每只动物的平均值)显示在图4b中。一式两份以1：200稀释度对样品进行分析(误差为sem；具有tukey多重比较检验的单向anova)。相比于年轻对照组(72pg/ml)，年老对照组血清nf-l明显增加(297pg/ml)，表明正常狗中年龄依赖的增加。与csf不同，与年老对照组相比，任何阶段的dm狗的血清nf-l均未显示显著升高。但是，平均nf-l水平可能从合并的dm1/2阶段(302pg/ml)到合并的dm3/4阶段(572pg/ml)有增加。因为年轻对照组nf-l水平比正常人血清nf-l高约10倍(72pg/ml比～8pg/ml)，与狗相比，人类中的低血清nf-l水平将难以检测。对照和dm狗的血清和csf的nf-l的相关性图显示，当所有组合并时，没有明显的线性相关性，但是来自年轻对照组和年老对照组的合并数据表明血清与csfnf-l水平的线性相关性。总结优化了用于hnfl的数字elisa测定(quanterixsimoa平台)，以满足正常狗的csf和血清中的稀释线性、稳定性和hnfl加标回收率的预定接受标准。使用该elisa测定分析了来自正常和dm狗的csf和血清水平。与年老对照组相比，在第1-4阶段的受dm影响的狗中，csfnf-l水平显著升高，并且在初始疾病阶段csfnf-l的增加最为明显。与csf不同，与年老对照组相比，任何阶段的dm狗的血清均未显示nf-l的显著增加。与年轻对照组相比，年老对照组的血清nf-l显著升高，表明正常狗中的年龄依赖性增加。在csf中显示出类似的相对增加。在对照狗中，csf和血清nfl水平可能呈线性相关。因此，与年老对照狗相比，血清和csf中的nf-l浓度可能随年龄增加而升高，并且在dm狗中升高。csfnfl浓度也可代表疾病早期进展的生物标志物。实施例11.磷酸化的神经丝重链水平作为生物标志物dm最初表现为痉挛性上运动神经元轻截瘫和全身本体感受性共济失调(第1阶段)。进行性神经退化导致不能走动的轻截瘫/截瘫(第2阶段)和胸肢轻瘫(第3阶段)。终末期疾病最终表现为弛缓的四肢瘫痪、广泛的肌肉萎缩和延髓功能障碍(第4阶段)。认为该疾病与某些形式的人类肌萎缩性侧索硬化症(als)的病因、进展和预后相似。磷酸化的神经丝重链(pnf-h)具有作为dm和als的跨物种生物标记物的潜力。血液和csf中pnf-h浓度升高已显示出高诊断性能，并与诊断为als的患者的疾病进展相关。在受dm影响的狗中，csfpnf-h是一种具有高特异性的敏感的诊断生物标志物，并具有确定的>20.25ng/ml的截止值，其是80.4％敏感的(ci66.09-90.64％)，93.6％特异的(ci78.5-99.21％)。如图5a、图5b和图5c所示，在受dm影响的狗的csf中pnf-h增加。图5a显示，与正常犬相比(比较基于采用posthocdunn方法的kruskal-wallis秩方差分析(kruskal-wallisanovaonrankswithposthocdunn’smethod)；条代表组中位数和四分位距)，在所有疾病阶段在受dm影响的狗中，中位csfpnf-h均增加(第1阶段，n＝10，p<0.05；第2阶段，n＝13，p<0.0001；第3阶段，n＝14，p<0.001；第4阶段，n＝9，p<0.01)。图5b显示，在单时间点csfpnf-h浓度和dm疾病阶段之间不存在相关性(p＝0.4050)。图5c表明，pnf-h可能是疾病进展的有用生物标志物，因为来自受dm影响的狗的纵向配对样品中的csfpnf-h浓度随时间增加。在治疗组和未治疗组之间pnf-h结果的显著差异将在受dm影响的狗中提供可量化的量度。实施例12.受dm影响的狗的体内研究为了研究靶向sod1的aav的治疗功效，dm狗(cm和腰椎)鞘内施用aavsod1构建体，该构建体通过杆状病毒或三重转染生产方法中的任一进行生产。将5只狗的组用于本研究(施用aavn＝3，施用媒介物n＝2)。为了被包括在这项研究中，动物将需要处于dm的早期阶段，接受nsf健康检查，具有正常的csf水平，正常的emg，经历nsft-l脊髓mri，具有a/a基因型，和/或具有小于1:10的aav天然抗体。在施用aav或仅媒介物之前，收集基线流体样本，并向动物施用免疫抑制剂。进行毒理学和纵向研究约12个月(可以延长)，然后安乐死动物。毒理学研究包括但不限于身体检查、cbc水平、血液生化分析、尿液分析和/或csf分析。纵向研究包括但不限于神经学检查、视频步态评分、csfpnf-h水平、csf、血清和尿液样本的收集和储存(最佳在-80℃下)。示例性的筛选图表如下显示在表33中。表33.分析时间线期望aav治疗的动物从发作到不能走动状态的中值时间延长，并且稳定到较低的csfpnf-h水平。等同物和范围本领域技术人员通过使用不超出常规实验将认识到或能够确定根据本文描述的发明的许多等同物和具体实施方案。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。在权利要求中，诸如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”的冠词可以表示一个或多个，除非相反地指出或从上下文中明显可见。如果一个或多于一个或全部组成员在给定的产品或过程中存在、使用或与之相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的权利要求或描述被认为得到满足，除非相反地指出或从上下文中明显可见。本发明包括其中恰好组的一个成员在给定产品或方法中存在、使用或与之相关的实施方案。本发明包括其中超过一种或整个组成员在给定的产品或方法中存在、使用或与之相关的实施方案。还应注意，术语“包括”旨在是开放的并且允许但不要求包括其他的元件或步骤。因此，当在本文中使用术语“包括”时，也包含和公开了术语“由...组成”。在给出范围的情况下，包括端点。此外，应理解的是，除非另外指明或从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则在本发明的不同实施方案中，表示为范围的值可以假定为所述范围内的任何具体值或子范围，至该范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。另外，应当理解，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可以明确地从权利要求的任何一个或多个中排除。由于这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，因此，即使未在本文明确排除，也可以将其排除。本发明的组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何生产方法；任何使用方法；等等)都可以出于任何原因从任何一项或多项权利要求中排除，不管是否与现有技术的存在有关。应当理解，所使用的词语是描述性的词语而不是限制性的词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而不脱离本发明在其更广泛的方面的真实范围和精神。尽管已经就多个描述的实施方案以某种长度和某些特殊性描述了本发明，本发明并不意图限于任何这样的细节或实施方案或任何特定的实施方案，而是应参照所附权利要求书来解释，以考虑到现有技术提供对此类权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本发明的预期范围。所有引用的来源，例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术，都通过引用并入本申请，即使在引用中未明确说明。如果引用来源与本申请存在冲突声明，则以本申请中的声明为准。节和表的标题不意图是限制性的。序列表<110>沃雅戈治疗公司（voyagertherapeutics,inc.）密苏里州立大学校董（thecuratorsoftheuniversityofmissouri）<120>肌萎缩性侧索硬化症（als）的治疗<130>2057.1047pct<140>pct/usxxxx/xxxxxx<141>2018-10-16<150>62/572,702<151>2017-10-16<160>147<170>patentinversion3.5<210>1<211>981<212>dna<213>人（homosapiens）<400>1gtttggggccagagtgggcgaggcgcggaggtctggcctataaagtagtcgcggagacgg60ggtgctggtttgcgtcgtagtctcctgcagcgtctggggtttccgttgcagtcctcggaa120ccaggacctcggcgtggcctagcgagttatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaaggg180cgacggcccagtgcagggcatcatcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagtgaa240ggtgtggggaagcattaaaggactgactgaaggcctgcatggattccatgttcatgagtt300tggagataatacagcaggctgtaccagtgcaggtcctcactttaatcctctatccagaaa360acacggtgggccaaaggatgaagagaggcatgttggagacttgggcaatgtgactgctga420caaagatggtgtggccgatgtgtctattgaagattctgtgatctcactctcaggagacca480ttgcatcattggccgcacactggtggtccatgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtgg540aaatgaagaaagtacaaagacaggaaacgctggaagtcgtttggcttgtggtgtaattgg600gatcgcccaataaacattcccttggatgtagtctgaggccccttaactcatctgttatcc660tgctagctgtagaaatgtatcctgataaacattaaacactgtaatcttaaaagtgtaatt720gtgtgactttttcagagttgctttaaagtacctgtagtgagaaactgatttatgatcact780tggaagatttgtatagttttataaaactcagttaaaatgtctgtttcaatgacctgtatt840ttgccagacttaaatcacagatgggtattaaacttgtcagaatttctttgtcattcaagc900ctgtgaataaaaaccctgtatggcacttattatgaggctattaaaagaatccaaattcaa960actaaaaaaaaaaaaaaaaaa981<210>2<211>465<212>dna<213>食蟹猕猴（macacafascicularis）<400>2atggcgatgaaggccgtgtgcgtgttgaagggcgacagcccagtgcagggcaccatcaat60ttcgagcagaaggaaagtaatggaccagtgaaggtgtggggaagcattacaggattgact120gaaggcctgcatggattccatgttcatcagtttggagataatacacaaggctgtaccagt180gcaggtcctcactttaatcctctatccagacaacacggtgggccaaaggatgaagagagg240catgttggagacctgggcaatgtgactgctggcaaagatggtgtggccaaggtgtctttc300gaagattctgtgatctcgctctcaggagaccattccatcattggccgcacattggtggtc360catgaaaaagcagatgacttgggcaaaggtggaaatgaagaaagtaaaaagacaggaaac420gctggaggtcgtctggcttgtggtgtaattgggatcgcccaataa465<210>3<400>3000<210>4<211>474<212>dna<213>家犬（canislupusfamiliaris）<220><221>misc_feature<222>(165)..(165)<223>n是a,c,g,或t<400>4cgagtcatggagatgaaggccgtgtgcgtgttgaagggccagggcccggtggagggcacc60atccacttcgtgcagaagggaagtgggcctgttgtggtatcaggaaccattacagggctg120actgaaggcgagcatggattccacgtccatcagtttgaagataanacacaaggctgtact180agtgcaggtcctcactttaatcctctgtccaaaaaacatggtgggccaaaagatcaagag240aggcatgttggagacctgggcaatgtgactgctggcaaggatggcgtggccattgtgtcc300atagaagattctctgattgcactctcaggagactattccatcattggccgcaccatggtg360gtccacgagaaacgagatgacttgggcaaaggtgacaatgaagaaagtacacagacagga420aacgccgggagtcgtttggcttgtggtgtcattgggatcgcccaataaacattc474<210>5<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>5ucaccacaagccaaacgacuu21<210>6<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>6ugauuaaagugaggaccuguu21<210>7<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>7uauuaaagugaggaccugcuu21<210>8<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>8uacaccacaagccaaacgauu21<210>9<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>9gauuaaagugaggaccugcuu21<210>10<211>22<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>10ucaccacaagccaaacgacuuu22<210>11<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>11ugccagcagucacauugccuu21<210>12<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<400>12uaacagaugaguuaagggguu21<210>13<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>13uauuaaagugaggaccugcnn21<210>14<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>14uacaccacaagccaaacgann21<210>15<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>15uuguuuauugggcgaucccnn21<210>16<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>16uguuuauugggcgaucccann21<210>17<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>17ucaccacaagccaaacgacnn21<210>18<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>18ugauuaaagugaggaccugnn21<210>19<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>19uuuuauugggcgaucccaann21<210>20<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>20ugucagcagucacauugccnn21<210>21<211>21<212>rna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的多核苷酸<220><221>misc_feature<222>(20)..(21)<223>nn是脱氧胸苷二核苷酸<400>21ugcgaucccaauuacaccann21<210>22<211>21<212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