丝氨酸蛋白酶抑制剂生产的制作方法

本发明涉及表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细菌、用于增加细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂产量的方法及其用途。

背景技术：

谷蛋白相关障碍包括由谷蛋白引发的所有疾病。除了其它病理生理学之外，它们还包括乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症。目前，广谱谷蛋白相关障碍的发生率在全世界范围内正不断增长，尤其就乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症来讲。这两种疾病都是通过摄入谷蛋白引发的。乳糜泻涉及先天性免疫和获得性免疫两者，而非乳糜泻谷蛋白敏感症涉及先天性免疫。

终生食用不含谷蛋白的饮食是用于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症患者的黄金标准疗法，但是该疗法可能对疾病的肠外表现有一些限制(sedghizadeh等人，2002年，《口腔外科、口腔医学、口腔病理学、口腔放射学和牙髓病学)》，第94卷第4期，第474-478页(sedghizadehetal.，2002，oralsurgery，oralmedicine，oralpathology，oralradiology，andendodontology，94(4)，474-478))。已表明，遵循严格不含谷蛋白的饮食是非常困难的，因为从谷物生长到制造加工，低水平交叉污染难以避免并且可能在整个食品生产链中发生(mitchison等人，1991年，《胃肠病)》，第32卷第3期，第260-265页(mitchisonetal.，1991，gut，32(3)，260-265))。此外，已描述在严格不含谷蛋白的饮食下每日仍可食用高达3g隐藏的谷蛋白(aziz等人，2014年，《美国胃肠病学杂志)》，第109卷第9期，1498页(azizetal.，2014，theamericanjournalofgastroenterology，109(9)，1498))。

乳糜泻尤其流行于美国和欧洲，在那里约1％的个体的抗体测试呈阳性(dubé等人，2005年，《胃肠病学)》，第128卷第4期，第s57-s67页(dubéetal.，2005，gastroenterology，128(4)，s57-s67))。它是一种复杂的障碍，由各种免疫、遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起(alaedini和green，2005年)。它是通过摄入小麦谷蛋白和其它相关的谷物蛋白(诸如黑麦和大麦蛋白)引发的。与乳糜泻相关联的症状是儿童的生长迟缓、易怒和青春期延迟，以及许多胃肠症状诸如不适、腹泻、粪便潜血、脂肪痢和肠胃气胀(dubé等人，2005年；sedghizadeh等人，2002年)。

非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(lundin和alaedini，2012年)。除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5％-13％之间(平均5％)的谷蛋白相关障碍的最常见综合征(catassi等人，2013年，《营养物质)》，第5卷第10期，第3839-3853页(catassietal.，2013，nutrients，5(10)，3839-3853))。

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是存在于真核细胞(gettins，2002年，《化学评论》，第102卷第12期，第4751-4804页(gettins，2002，chemicalreviews，102(12)，4751-4804))和原核细胞(kantyka等人，《生物化学》，第92卷第11期，第1644-1656页(kantykaetal.，biochimie，92(11)，1644-1656))中的蛋白质超家族。

最近，已证实人丝氨酸蛋白酶抑制剂在谷蛋白相关障碍中起重要作用。弹力素是人丝氨酸蛋白酶抑制剂，其显示出对各种形式的弹性蛋白酶和蛋白酶的有效抑制能力(ying和simon，1993年，《生物化学》，第32卷第7期，第1866-1874页(ying&simon，1993，biochemistry，32(7)，1866-1874))。弹力素在胃肠道的整个上皮中表达，并且其表达和诱导在患有炎性肠病和乳糜泻的患者中有所减少(baranger、zani、labas、dallet-choisy和moreau，2011年；motta等人，2012年)。最近，已将弹力素鉴定为转谷氨酰胺酶2(tg2)的交联活性的底物(baranger等人，2011年，《公共科学图书馆：综合》，第6卷第6期，第e20976页(barangeretal.，2011，plosone，6(6)，e20976)；motta等人，《科学转化医学》，第4卷，第158期，第158ra144-158ra144页(mottaetal.，sciencetranslationalmedicine，4(158)，158ra144-158ra144))。体外数据显示，添加弹力素适度抑制转谷氨酰胺酶2(tg2)，因此抑制抗消化33-mer醇溶蛋白肽的脱酰胺作用，其是乳糜泻中先天性免疫应答的潜在触发因素中的一种(mccarville等人，2015年，《药理学新见》，第25卷，第7-12页(mccarvilleetal.2015，currentopinioninpharmacology，25，7-12))。

已证实，由重组乳酸乳球菌(lactococcuslactis)产生的弹力素的递送减少了谷蛋白诱导的病变并且使小鼠谷蛋白敏感症模型中的肠道炎症正常化(galipeau等人，2014年，《美国胃肠病学杂志》，第109卷第5期，第748-756页(galipeauetal.，2014，theamericanjoumalofgastroenterology，109(5)，748-756))。然而，提出的这种疗法基于经基因修饰的微生物(gmo)，并因此与食品应用不相容，因为消费者对gmo的接受度非常低。

最近，丝氨酸蛋白酶抑制剂已在原核细胞中报道。经由电脑模拟分析表明在不同双歧杆菌(bifidobacterium)菌种中存在编码丝氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白的基因。由长双歧杆菌长亚种(b.longumsubsplongum)(称为长双歧杆菌(b.longum))ncc2705编码的蛋白显示出与人丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的抗蛋白酶活性(ivanov等人，2006年，《生物化学杂志》，第281卷第25期，第17246-17252页(ivanovetal2006，journalofbiologicalchemistry，281(25)，17246-17252))。

长双歧杆菌ncc2705根据布达佩斯条约于2001年1月29日保藏于巴斯德研究所，保藏号为cncmi-2618。

最近已证实，通过产生丝氨酸蛋白酶抑制剂可改善小鼠谷蛋白敏感症模型中谷蛋白诱导的病理生理学的长双歧杆菌ncc2705(cncmi-2618)显示出其作为谷蛋白相关障碍的解决方案的潜力(mccarville等人，2017年，《应用与环境微生物学》，第83卷第19期，第e01323-17页(mccarvilleetal.，2017，appl.envoron.microbiol.vol.83，no.19，e01323-17))。

技术实现要素：

本发明人已惊讶地发现，当添加到长双歧杆菌菌株cncmi-2618(长双歧杆菌ncc2705)的生长培养基中时，特定糖可增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达。

因此，在本发明的第一方面，提供了选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖用于增加长双歧杆菌菌株cncmi-2618中的丝氨酸蛋白酶抑制剂表达的用途。

在本发明的另一方面，提供了一种增加长双歧杆菌菌株cncmi-2618中的丝氨酸蛋白酶抑制剂表达的方法，其中所述方法包括使长双歧杆菌菌株cncmi-2618在培养基中生长，其特征在于所述培养基包含选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖。

根据本发明的另一方面，提供了通过使长双歧杆菌菌株cncmi-2618在培养基中生长的方法产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618，其特征在于所述培养基包含选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖。

相对于在不存在乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合的情况下生长的长双歧杆菌菌株cncmi-2618，根据本发明的长双歧杆菌菌株cncmi-2618与更高的丝氨酸蛋白酶抑制剂产量相关联。

在一个实施方案中，该糖为乳糖。

根据本发明，可在包含浓度为例如0.02重量％至0.50重量％的选自乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合的糖的培养基中培养长双歧杆菌菌株cncmi-2618。

例如，可在包含浓度为0.05重量％至0.15重量％、0.08重量％至0.12重量％或约0.10重量％的选自乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合的糖的培养基中培养长双歧杆菌菌株cncmi-2618。

根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，其包含根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌菌株cncm1-2618。

在一个实施方案中，该组合物为食品、医疗食物、管饲或营养补充剂。

在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。

在一个实施方案中，该组合物为药物组合物，其中药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌菌株cncm1-2618，或包含所述长双歧杆菌菌株cncmi-2618的组合物，其用于治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的或涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性降低的病症。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618，或包含所述长双歧杆菌菌株cncmi-2618的组合物，其用于治疗或预防谷蛋白相关障碍。

根据本发明的一个方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618，或包含所述长双歧杆菌菌株cncmi-2618的组合物，其用于治疗或预防乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎或小麦过敏。

根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618，或包含所述长双歧杆菌菌株cncmi-2618的组合物，其用于治疗或预防炎性肠病。

还应当理解，当糖与长双歧杆菌菌株cncmi-2618组合施用时，糖还可增加体内长双歧杆菌菌株cncmi-2618中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产量。

因此，根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌菌株cncmi-2618和(ii)选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖的组合。

根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌菌株cncmi-2618和(ii)选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖的组合，其用于治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症。

在一个实施方案中，该组合是长双歧杆菌菌株cncmi-2618和乳糖的组合。

根据本发明的另一方面，还提供了长双歧杆菌菌株cncmi-2618，其用于治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症，其中长双歧杆菌菌株cncmi-2618与选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖组合施用。

根据本发明的另一方面，提供了选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合的糖，其用于治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症，其中糖与长双歧杆菌菌株cncmi-2618组合施用。

附图说明

图1-在180分钟浓度为0.1％的糖诱导后长双歧杆菌ncc2705中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的相对转录水平。柱条指示与仅在mrsc中的生长相比，用于特定样品的丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna的相对量。黑柱条代表显著诱导。从至少2个不同的实验(95％置信区间)获得标准偏差。

图2-8小时、12小时和16小时后在不同的生长培养基中发酵的长双歧杆菌ncc2705的丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna水平。不同比例的葡萄糖被乳糖和果糖替代，如y轴所示，并且糖百分比总量保持稳定在5.5％。基于8小时后在5.5％葡萄糖中的长双歧杆菌ncc2705生长来计算这些值。黑柱条代表显著诱导。

具体实施方式

组合物

本发明的组合物可为食品、医疗食物、管饲、营养组合物或营养补充剂的形式。术语“营养补充剂”是指旨在补充个体的一般饮食的产品。

在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。

该组合物可为医疗食物的形式。如本文所用，术语“医疗食物”是指专门配制用于医疗疾病或病症的膳食管理的食物产品。医疗食物可以在医疗监督下施用。医疗食物可用于口服摄取或管饲。

该组合物可为管饲的形式。术语“管饲”是指旨在通过饲管将营养物质直接引入个体的胃肠道的产品。管饲可通过例如穿过个体的鼻子放置的饲管(诸如鼻胃管、鼻窦管和鼻空肠管)或者直接放置到个体的腹部中的饲管(诸如，胃造口术、胃空肠吻合术或空肠造口术饲管)来施用。

该组合物可以呈药物组合物的形式并且可包含一种或多种合适的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

用于本文所述组合物的此类合适的赋形剂的示例可见于由awade和pjweller编辑的《药物赋形剂手册》，第2版，1994年(“handbookofpharmaceuticalexcipients”，2ndedition，(1994)，editedbyawadeandpjweller)中。

用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且描述于例如a.r.gennaro编辑的《remington的药物科学》，mack出版公司，1985年(“remington′spharmaceuticalsciences”，mackpublishingco.(a.r.gennaroedit.1985)中。

合适的载体的示例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的示例包括乙醇、甘油和水。

可参照预期的施用途径和标准药物实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂的选项。药物组合物可包含以下物质作为载体、赋形剂或稀释剂或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含以下物质：任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂和/或增溶剂。

合适的粘结剂的示例包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的示例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。

可以在组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至风味剂。防腐剂的示例包括苯甲酸钠、山梨酸以及对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂包括在食品工业中作为标准使用的适合人类或动物食用的那些。典型的营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂对于本领域的技术人员来说是熟悉的。

组合物可为片剂、糖衣丸、锭剂、胶囊、胶丸、粉末、颗粒、溶液、乳液、悬浮液、包衣颗粒、喷雾干燥颗粒或丸剂的形式。

在一个另选的实施方案中，组合物可为用于局部施用的组合物的形式，诸如用于局部施用的凝胶、霜剂、膏剂、乳液、悬浮液或溶液。

对于本领域的技术人员显而易见的是，理想的剂量将取决于待治疗的个体、其健康状况(例如性别、年龄或体重)以及施用途径。理想使用的剂量将因此改变，但可由本领域的技术人员容易地确定。

然而，一般来讲，优选的是本发明的组合物每日剂量包含10⁶至10¹⁰cfu和/或10⁶至10¹⁰个长双歧杆菌菌株cmi-2618细胞。其还可包含每克组合物干重10⁶至10¹¹cfu和/或10⁶至10¹¹个长双歧杆菌菌株cmi-2618细胞。

糖

用于本发明的糖选自乳糖、果糖和棉子糖或它们的组合。乳糖是存在于乳中并且由葡萄糖和半乳糖组成的二糖。果糖是存在于许多植物中的单糖。棉子糖是也存在于植物中的三糖，并且由半乳糖、葡萄糖和果糖组成。

可在包含浓度为例如0.02重量％至0.50重量％的乳糖、果糖或棉子糖或它们的混合物的培养基中培养长双歧杆菌菌株cncmi-2618。例如，可在包含浓度为0.05重量％至0.15重量％、0.08重量％至0.12重量％或约0.10重量％的乳糖、果糖或棉子糖或它们的混合物的培养基中培养长双歧杆菌菌株cncmi-2618。

可将乳糖、果糖、棉子糖或它们的混合物添加到常规培养基中，该常规培养基包含至多8重量％，优选至多6重量％，例如4重量％-6重量％的适于维持长双歧杆菌生长的另一种糖，诸如但不限于葡萄糖或蔗糖。适于长双歧杆菌生长的常规培养基是本领域技术人员众所周知的。

在一个实施方案中，可在包含浓度为0.03重量％至0.40重量％、0.04重量％至0.30重量％或0.05重量％至0.20重量％的糖的培养基中培养长双歧杆菌菌株cncmi-2618。

在一个实施方案中，培养基可包含浓度为0.03重量％至0.15重量％、0.04重量％至0.15重量％、0.05重量％至0.15重量％、0.06重量％至0.15重量％、0.07重量％至0.15重量％、0.08重量％至0.15重量％、0.09重量％至0.15重量％或0.10重量％至0.15重量％的乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合。

在一个实施方案中，培养基可包含浓度为0.05重量％至0.14重量％、0.05重量％至0.13重量％、0.05重量％至0.12重量％或0.05重量％至0.11重量％的乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合。

在一个实施方案中，培养基可包含浓度为0.06重量％至0.14重量％、0.07重量％至0.13重量％、0.08重量％至0.12重量％、0.09重量％至0.11重量％或约0.10重量％的乳糖、果糖或棉子糖或它们的组合。

在一个实施方案中，乳糖以上述浓度使用。

在一个实施方案中，果糖以上述浓度使用。

在一个实施方案中，棉子糖以上述浓度使用。

用于产生培养物粉末的方法

属于菌种长双歧杆菌的菌株在厌氧条件下生长。厌氧条件下的发酵方法是公知的。根据待生长的微生物，技术人员能够鉴定发酵培养基的合适组分并基于常识调整发酵条件。发酵培养基通常包含

-氮源，诸如酵母提取物；

-碳源，诸如糖；

-微生物所需的各种生长因子(例如矿物质、维生素等)以及

-水。

用于长双歧杆菌的典型生长培养基的非限制性示例为补充有0.05％半胱氨酸的mrs(deman、rogosa和sharpe)培养基(mrsc)。

发酵优选以两个步骤进行，发酵剂发酵在主发酵步骤之前进行。发酵培养基对于发酵剂发酵和主发酵可以是不同的，或者可以是相同的。

该方法的第二步是生物质的浓缩。这也可使用本领域技术人员已知的方法进行，诸如例如离心或过滤。基于生物质的总干重(即发酵培养基和产生的微生物的总量)计，浓缩后生物质的总固体含量优选地为10重量％至35重量％，优选地为14重量％至35重量％。

任选地，浓缩可在洗涤步骤之前或与洗涤步骤组合以去除发酵培养基的残余物和/或在发酵期间产生的化合物。例如，可通过浓缩生物质，将浓缩的生物质重悬于缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或类似组合物中并重新浓缩生物质来进行洗涤。

例如，可应用全文以引用方式并入的wo2017/001590中描述的方法。

组合

在本发明的一个方面，提供了(i)长双歧杆菌菌株cncmi-2618和(ii)选自乳糖、果糖和棉子糖的糖的组合。

如本文所用，术语“组合”是指长双歧杆菌菌株cncmi-2618和乳糖、果糖或棉子糖的组合施用，其中长双歧杆菌菌株cncmi-2618和糖可同时或依次施用。

如本文所用，术语“同时”或“同时地”用于表示同时(即，在同一时间)施用两种试剂(长双歧杆菌菌株cncmi-2618和糖)。

术语“依次”或“依次地”用于表示两种试剂一个接一个地施用，其中可以先施用长双歧杆菌菌株cncmi-2618，或者可以先施用糖。

试剂可作为单独的制剂或作为单个组合制剂来施用。

当化合物被共同配制时，即共同配制在相同的组合物或制剂中时，它们只能被同时施用。当化合物被配制在单独的组合物或制剂中时，它们可以被同时施用或依次施用。相同制剂或单独制剂中的试剂的同时施用也可被描述为两种化合物的共同或联合施用。

在一个实施方案中，长双歧杆菌菌株cncmi-2618和糖是混合的。在另一个实施方案中，长双歧杆菌菌株cncmi-2618和糖以试剂盒的形式存在，该试剂盒含有这两种试剂的制剂以及任选向对其有需要的个体同时或依次施用该制剂的说明。

治疗

根据本发明产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618或包含该菌株的组合物可用于治疗或预防谷蛋白相关障碍或涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂活性降低的病症。

例如，根据本发明产生的长双歧杆菌菌株cncmi-2618或包含该菌株的组合物可用于治疗或预防炎性肠病、乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎和小麦过敏。

优选地，该疾病是谷蛋白相关障碍。谷蛋白相关障碍涵盖由谷蛋白引发的疾病。术语“与谷蛋白敏感症相关的病症”和“谷蛋白相关障碍”在本文中可互换使用。谷蛋白相关障碍包括乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎和小麦过敏。

乳糜泻

乳糜泻是最常见的免疫介导的障碍之一。它是世界范围内的病症，尤其流行于美国和欧洲，在那里约1％的个体的抗体测试呈阳性。乳糜泻是一种复杂的障碍，由各种免疫、遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起。它是通过摄入小麦谷蛋白和其它相关的谷物蛋白(诸如黑麦和大麦蛋白)引发的。与乳糜泻相关联的症状是儿童的生长迟缓、易怒和青春期延迟，以及许多胃肠症状如不适、腹泻、粪便潜血、脂肪痢肠胃气胀。

临床证据显示，与乳糜泻病变密切相关的ii类人白细胞抗原(hla-dqii)在约95％的乳糜泻患者中表达。在肠腔中，谷蛋白被部分消化，形成抗蛋白水解33-mer谷蛋白肽。在穿过小肠屏障后，通过带负电荷的转谷氨酰胺酶2(tg2)将它们去酰胺化(sollid，2000年，《免疫学年鉴》，第18卷第1期，第53-81页(sollid，2000，annualreviewofimmunology，18(1)，53-81))，然后它们与hla-dq2.5/8的带正电结合位点结合(dieterich等人，1997年，《自然医学》，第3卷第7期，第797-801页(dieterichetal.，1997，naturemedicine，3(7)，797-801))。显示那些特异性谷蛋白肽的hla-dq2.5/8向辅助t细胞和其它免疫细胞发送信号，在小肠中引起进一步损伤。针对谷蛋白的抗体和针对结缔组织组分(tg2)的自身抗体也与乳糜泻进展相关联(alaedini和green，2005年，《内科医学年鉴》，第142卷第4期，第289-298页(alaedini&green，2005，annalsofinternalmedicine，142(4)，289-298))。

非乳糜泻谷蛋白敏感症

非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(lundin和alaedini，2012年)。非乳糜泻谷蛋白敏感症的发病尚未被充分了解。已表明，除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5％-13％之间的谷蛋白相关障碍的最常见综合征(catassi等人，2013年，《营养物质》，第5卷第10期，第3839-385页(catassietal.，2013，nutrients，5(10)，3839-385))。非乳糜泻谷蛋白敏感症的诊断通过排除其它谷蛋白相关障碍来进行。

疱疹样皮炎

疱疹样皮炎是一种慢性起泡皮肤自身免疫性病症，其特征在于存在皮肤病变，该皮肤病变具有广泛且对称的分布，主要在摩擦较大的区域中，并且主要影响两个肘部、膝盖、臀部、踝部，并且也可影响头皮和身体的其它部位。这些病变是水泡-结痂型的，并且当它们剥落时，它们发展成有色区域或者慢性且强烈的灼热、瘙痒和起泡皮疹。

发病年龄是可变的。它可始于儿童和青少年时期，但也可在其生命的任何年龄不明显地影响两种性别的个体。

患有疱疹样皮炎的人具有不同程度的肠病变，范围从较温和的粘膜损伤到存在绒毛萎缩。

小麦过敏

小麦过敏的胃肠症状类似于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症的胃肠症状，但在暴露于小麦和症状发作之间存在不同的间隔。在食用含小麦的食品后小麦过敏会快速发作(从几分钟到几小时)，并且可导致过敏症。

谷蛋白共济失调

谷蛋白共济失调是谷蛋白相关障碍。患有谷蛋白共济失调时，在小脑中发生损伤，小脑是大脑的平衡中心，控制协调和复杂运动如行走、说话和吞咽。谷蛋白共济失调是散发性特发性共济失调的最常见起因之一。它占据未知来源共济失调的40％和所有共济失调的15％。

谷蛋白共济失调是由于遗传易感性个体摄入谷蛋白而引发的免疫介导的疾病。在患有散发性特发性共济失调的所有患者的鉴别诊断中应考虑它。治疗的效果取决于从共济失调发病直到诊断所消耗的时间。由于个体暴露于谷蛋白所导致的小脑中神经元的死亡是不可逆的。

早期诊断和用不含谷蛋白的饮食治疗可改善共济失调并阻止其进展。少于10％的患有谷蛋白共济失调的人呈现任何胃肠症状，但约40％具有肠损伤。谷蛋白共济失调的敏感标记物包括抗醇溶蛋白抗体。免疫球蛋白a(iga)在小肠中和在肠外位点处紧靠转谷氨酰胺酶2(tg2)沉积证明是另外可靠的。

施用

本文所述的长双歧杆菌菌株cncmi-2618或组合物优选地经肠施用。

经肠施用可以是口服、胃和/或直肠施用。

一般来讲，本文所述的组合或组合物的施用可例如通过口服途径或另一种途径进入胃肠道，例如可通过管饲施用。

在一个另选的实施方案中，本文所述的组合或组合物的施用可以是局部施用。

个体可以是哺乳动物，诸如人类、犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊、牛科动物、绵羊、猪、鹿科动物和灵长类动物。优选地，个体是人类。

现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。

除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如sambrook，j.，fritsch，e.f.和maniatis，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress；ausubel，f.m.等人(1995andperiodicsupplements)currentprotocolsinmolecularbiology，ch.9，13and16，johnwiley&sons；roe，b.、crabtree，j.和kahn，a.，(1996)dnaisolationandsequencing：essentialtechniques，johnwiley&sons；polak，j.m.和mcgee，j.o’d.，1990年，“insituhybridization：principlesandpractice”，oxforduniversitypress；gait，m.j.(1984)oligonucleotidesynthesis：apracticalapproach，irlpress；以及lilley，d.m.anddahlberg，j.e.(1992)methodsinenzymology：dnastructuresparta：synthesisandphysicalanalysisofdna，academicpress。这些一般性文本中的每一个以引用的方式并入本文。

实施例

实施例1-方法

blncc2705(长双歧杆菌菌株cncmi-2618)在biolector中生长(生长条件-厌氧，37℃，mrs+5mml-半胱氨酸(mrsc))。

使用配有ph传感器和溶解氧(do)传感器的48孔微量滴定板在biolector(德国m2p-labsaachen公司(m2p-labsaachen，germany))中培养菌株。连续摇动以防止细菌聚集，并且每隔15分钟进行测量。用透气膜将板密封，并且厌氧培养室提供明确的厌氧放气条件。在整个生长过程中使用biolectionhmi软件在线监测发酵参数如生物质、ph和溶解氧(do)。生长参数为：

接种率(％)2

每个壁的体积(ml)1

发酵时间(h)16

温度(℃)37

供应的外部气体n²

外部气体压力(巴)2

摇动频率(rpm)400

测量循环时间(分钟)15

将以下碳水化合物分别添加到培养物中：

单糖-葡萄糖、n-乙酰基-葡糖胺、果糖、半乳糖。

二糖-乳糖、蜜二糖、蔗糖

多糖-棉子糖，

所有糖均购自西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich)。

然后将长双歧杆菌ncc2705在相同条件下进一步培养180分钟，之后收集样品(500μl)并测量丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna水平。每次发酵至少重复进行两次。

如图1所示，乳糖、果糖和棉子糖显示增加了长双歧杆菌ncc2705的丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna水平。

丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna检测和定量

总rna分离-将500μl细菌培养物悬浮在1ml的rna保护细菌试剂(德国凯杰公司(qiagen，germany))中并在5000g下短暂离心10分钟以收获细胞用于总rna提取。

使用配有蛋白酶k(德国凯杰公司(qiagen，germany)，产品编号19131)的rneasy总rna小量提取试剂盒(德国凯杰公司(qiagen，germany)，产品编号74101)提取总rna并使用rnase-freednaseset(德国凯杰公司(qiagen，germany)，产品编号79254)进一步处理。然后将总rna在40μl水中洗脱。

rna质量控制和定量-使用qiaxceladvanced系统(德国凯杰公司(qiagen，germany))，通过电泳分析rna样品的质量控制和定量。

将1μlrna样品和rna尺寸标记物分别与相同体积的rna变性缓冲液混合，并于70℃温育2分钟，然后在冰上冷却1分钟。通过qxrna稀释液将样品稀释至10μl以便分析和测量。使用23s与16s的比率进行rna质量的评估。选择比率值介于1.6至2.3之间的rna进行后续的qrt-pcr。

使用配有带rox(invitrogen，产品编号11746-500)的superscriptiiiplatinumsybrgreen一步法qrt-pcr试剂盒的abiprism7900ht系统，在一步反应中进行cdna合成和pcr两者。

用sybr绿色荧光染料检测pcr产物并用rox参比染料归一化。

以下引物用于cdna合成：对于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因：正向5’-accaatcgctgctaagttcg-3’，反向5’-tcgctggcaagagagtagtc-3’；对于ldh：正向5’-cgaacgccatctacatgctc-3’和反向5’-aagatctggttctcttgcag-3’。基于长双歧杆菌ncc2705创建用于丝氨酸蛋白酶抑制剂的引物，并在长双歧杆菌atcc15707中检查dna同源性。通过解离曲线分析验证可靠性。

mrna倍数表达分析方法-使用pfaffl方法计算相对转录变化(pfaffl，2012年，martinfilion，hg.，《应用微生物学中的定量实时pcr》，第53-62页(pfaffl，2012，martinfilion，hg.，quantitativereal-timepcrinappliedmicrobiology，53-62))，其公式示于公式1中：

公式1

实施例2-结果

为了优化乳糖对blncc2705丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导的影响，执行剂量响应。在盛有mrsc培养基的10lbiostarbplus发酵罐中进行发酵，该培养基补充有0.05％半胱氨酸作为碱，并且将不同浓度的乳糖(0.05％、0.1％、1％、2％和2.75％)添加至该培养基中。将葡萄糖补充到不同配方中以达到最终总糖的5.5％的总量。使用8hmrsc生长的blncc2705培养物作为碱计算丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna诱导倍数(图2)。

如图2所示，在添加0.1％乳糖的情况下观察到通过使用乳糖在发酵结束时(16h)达到的最高丝氨酸蛋白酶抑制剂mrna水平。

仅供接收办公室使用

仅供国际专利局使用