抗CK20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗ck20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术：

细胞角蛋白(cytokeratin，ck)是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一。分为ck1～ck20等20种。细胞角蛋白主要分布于上层组织细胞中，但是在骨髓、血液、淋巴结等表达能力较弱，肿瘤细胞能够保留其来源的胚层特性，细胞角蛋白已经成为肿瘤细胞较为敏感和特异的标志物，被用来检测恶性肿瘤细胞。蛋白细胞角蛋白20(cytokeratin20，ck20)是ⅰ型细胞角蛋白的一种，相对分子质量为48000，编码dna总长18kb，含8个外显子，7个内含子。

ck20的合成首先出现于第8周胚胎的粘膜上皮中，后广泛分布于杯状细胞和绒毛细胞中。在ck系列中ck20具有严格的上皮组织特异性。正常组织中，如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞、造血细胞ck20表达都均为阴性，其阳性表达仅见于肠粘膜细胞、胃粘膜及幽门腺体细胞、十二指肠粘膜、泌尿系伞状细胞、表皮merkel细胞。ck20的表达在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等改变时持续表达阳性。ck20表达阳性的肿瘤见于：结肠直肠癌、胃腺癌及未分化癌、泌尿道移行细胞癌、胆道腺癌、胰管细胞腺癌、皮肤merkel细胞癌等。ck20表达阴性见于：乳腺粘液腺癌和小叶腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液腺癌、肾细胞癌、肺腺癌及鳞状细胞癌、鳞状细胞癌(子宫颈、咽、食道、皮肤)、肉瘤、恶性淋巴瘤等。ck20的分布特点使其成为良好的肿瘤标志物，也用来被鉴别肿瘤组织来源。

制备抗ck20单克隆抗体可用来研究ck20蛋白，并能够利用其检测组织及细胞中ck20的表达来对肿瘤的发生或迁移进行鉴别诊断。但目前高质量的ck20单抗大多依赖于国外进口，检测成本较高，且单抗获取的背景资料不清晰。因此，本研究原核表达人ck20蛋白，免疫小鼠，制备ck20单克隆抗体，并进行鉴定，旨在提供一种背景资料清晰、性质稳定的国产化单抗，用于ck20的检测及研究。

技术实现要素：

发明人提供了一种抗ck20蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是seqidno.4和seqidno.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别ck20蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中seqidno.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为cgmccno.16204的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系10f6b12a9，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2018年07月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗ck20蛋白为小鼠igg2a亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗ck20蛋白单克隆抗体的制备方法，选取ck20蛋白氨基酸序列第411位至第424位氨基酸并与载体蛋白klh偶联作为免疫原。

发明人还提供了一株分泌抗ck20蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系10f6b12a9，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmccno.16204。

发明人还提供上述任一所述的抗ck20蛋白单克隆抗体，在ck20蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案依据ck20蛋白与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的氨基酸序列第411-424位蛋白(seqidno.1)，区域作为抗原肽。在n端添加巯基修饰并偶联klh，作为免疫源对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗ck20蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系10f6b12a9,以及由该细胞系所分泌的抗ck20蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达ck20蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为纯化后ck20单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2为胃组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

图3为结肠组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

图4为结肠癌组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

具体实施方式

实施例1重组ck20蛋白片段的制备

一、基因克隆

从uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号p35900的ck20蛋白序列作为标准序列。依据其与dna结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定ck20氨基酸序列第411位至第424位序列，其对应的核苷酸序列为seqidno.1。合成以上ck20蛋白，在其n端添加巯基修饰并与载体蛋白klh偶联，提高其免疫原性，作为免疫原备用。

实施例210f6b12a9杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中获得的ck20蛋白-klh偶联物稀释至1mg/ml，然后与等体积的完全弗氏佐剂(cfa,sigma公司)混合乳化，对18-20g的balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(ifa,sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用pbs溶液混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1ml预热至37℃的peg(sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与peg充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4ml预热至37℃的无血清dmem(hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10ml预热无血清dmem培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清dmem培养基，定容至50ml，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mlhat(sigma公司)培养基重悬细胞，并用hat培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/ml，所有溶液转移至96孔板中，200μl/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％co2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加hat培养基，50μl/孔。

三、elisa筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μl培养液上清进行首次细胞筛选(elisa、ihc-p及其他方法检测)，同时往培养孔中补加hat培养基至200μl。elisa检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加ht培养基，2ml/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至co2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株10f6b12a9。将此细胞株转入t-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

将细胞株培养至对数生长期后用无血清培养基洗涤并重悬，计数2×10⁶个/ml。悬浮的细胞溶液腹腔注射事先用石蜡油致敏10天的balb/c小鼠，每只小鼠注射0.5ml。饲养小鼠7天后开始采集腹水。收集的腹水于4℃、8000rpm离心10min，吸取上清溶液收集于离心管中，即为腹水，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用rproteinasepharosefastflow(ge公司)亲和层析柱从腹水中纯化抗体主要分为：①装柱，将购买的proteina填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1mtris溶液，ph7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1m柠檬酸溶液，ph4.5)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将细胞上清稀释成1μg/ml包被酶标板,每孔加100μl，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbs-t)洗板3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa的pbs-t溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1ml杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。用封闭液1：400稀释hrp标记的羊抗鼠(κ,λ，igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体(southernbiotech公司)，每孔分别加入0.1ml，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)底物(a、b等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μl1nhcl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的od值。结果显示，本发明单克隆抗体为igg1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被ck20蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，pbs-t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，pbs-t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/ml)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。hrp标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs-t洗3次。每孔加入100μltmb(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl1.0n盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出od值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台od值”对应的抗体浓度a。利用下列公式计算出亲和常数为7.16l×mol^-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对ck20蛋白-klh偶联物进行12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用常规湿转法将凝胶蛋白转移到pvdf膜。将膜置于5％bsa-tbst溶液中(蛋白面朝下)，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用tbst洗掉5％bsa-tbst，加入本发明制备的ck20的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用tbst洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。

再次用tbst洗膜，加入ecl显色试剂盒，实验结果如图1，ck20单克隆抗体检测人ck20蛋白的免疫印迹图所示。由图1可见，条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。

实施例6组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备过程

对样本组织进行he切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％apes丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、ihc染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，pbs冲洗3×3分钟。滴加3％h2o2孵育10分钟，pbs冲洗3×3分钟。甩去pbs，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，pbs冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，pbs冲洗3×3分钟，甩去pbs，用新鲜配置的dab显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，pbs返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)和对照抗体-市售抗ck20蛋白单克隆抗体(鼠单抗ks20.8)在67例结直肠癌、58例胃癌、53例卵巢癌，45例肺癌上进行同步检测，结果如下表所示。

结果显示:抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)特异性强。同时，与市售抗体ck20(ks20.8)的阳性和阴性结果一致，说明本抗体在肿瘤组织的特异性同市售抗体相当。

而部分病例中，使用抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)的阳性染色强度高于使用对照试剂，说明抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)的敏感性高于市售抗体。

而用抗ck20蛋白单克隆抗体(10f6b12a9)和对照抗体-市售抗ck20蛋白单克隆抗体(鼠单抗ks20.8)，在包括30种正常组织的组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

图2为胃组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

图3为结肠组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

图4为结肠癌组织免疫组化染色结果图(左为10f6b12a9的ck20，右为市售ck20)。

序列表

<110>福州迈新生物技术开发有限公司

<120>抗ck20蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130>2018

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>14

<212>prt

<213>智人(homosp)

<400>1

lysvalvalsersergluvallysgluvalglugluasnile

1510

<210>2

<211>423

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>2

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gtgcaacttgttgagactggtggaggattggtgcagcctaaagggtcattgaaactctca120

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tatgccgattcagtgaaagacaggttcaccatctccagagatgattcacaaagcatgctc300

tatctgcaaatgaacaacttgaaaactgaggacacagccttgtatttctgtgtgagaggc360

cttgtttattactccggtattgttccttactggggccaagggactctggtcactgtctct420

gca423

<210>3

<211>384

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>3

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ccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccct240

gctcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggag300

gctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttacccacacacgttcgga360

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<210>4

<211>141

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>4

metleuleuglyleulystrpvalphephevalvalphetyrglngly

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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130135140

<210>5

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<213>人工序列(artificial)

<400>5

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151015

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115120125