本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法。
背景技术：
免疫细胞治疗已成为全世界医疗领域内对难治性疾病(如恶性肿瘤)进行治疗的新的重要医疗手段，比如采用car-t细胞对b细胞淋巴瘤进行治疗。对科学界和医疗界而言，获得质量稳定可靠、功能优良的免疫细胞对获得良好的临床治疗效果非常关键。
人vγ9vδ2t细胞是仅存在于灵长类和人中的一类具有抗肿瘤、抗感染功能的t细胞亚群。人vγ9vδ2t细胞可用于患有肿瘤、难治性传染病及免疫功能失衡疾病的人群的免疫细胞治疗或免疫功能重建。
目前对人vγ9vδ2t细胞的扩增方法主要有两大类：
第一类现有扩增技术是在外周血单核细胞(pbmcs)的培养基中添加il-2和tcrγδ的单克隆抗体。这种方法的主要缺点是外周血中的两类γδt细胞(vδ1细胞亚群和vδ2细胞亚群)都被扩增，而vδ1细胞亚群具有免疫抑制功能，因此不适用于免疫细胞治疗。
第二类现有扩增技术是在pbmcs的培养基中添加il-2和磷酸盐小分子化合物如唑来膦酸。这种方法可以得到纯度较高的vδ2亚群的γδt细胞，可以用于免疫细胞治疗，这是目前国内外扩增人外周血人vγ9vδ2t细胞的常用方法。但是该方法的缺点是：细胞培养扩增的周期为14天左右，扩增出来的人vγ9vδ2t细胞抗凋亡能力不强，存活时间较短(能继续存活7天左右)，对肿瘤细胞的杀伤能力不强等。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法，能够显著增强人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力以及靶细胞杀伤能力。
为实现以上目的，本发明提供一种人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法，包括：
步骤1、从人体外周血中提取外周血单个核细胞；
步骤2、提供人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基，采用所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基包括人vγ9vδ2t细胞培养基以及添加于所述人vγ9vδ2t细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人vγ9vδ2t细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2；
所述步骤1与步骤2的顺序能够调整或者同时进行；
步骤3、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养48-96小时；
步骤4、采用所述人vγ9vδ2t细胞培养基对细胞进行换液，后续培养过程均采用所述人vγ9vδ2t细胞培养基进行；
步骤5、从所述步骤3开始培养8-14天后，获得人vγ9vδ2t细胞培养体系，在所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中加入纳米硒粒子处理6-24小时；
步骤6、去除所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中未被所述人vγ9vδ2t细胞吸收的纳米硒粒子。
可选的，所述纳米硒粒子的粒径为10～300nm。
可选的，所述步骤5中，将所述纳米硒粒子添加至所述人vγ9vδ2t细胞培养体系后，所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中纳米硒粒子的浓度为0.1～10μmol/ml。
可选的，所述纳米硒粒子以悬浮液的形式加入所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中，所述悬浮液包括磷酸缓冲溶液以及分散于所述磷酸缓冲溶液中的纳米硒粒子。
可选的，所述步骤6中，去除所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中未被所述人vγ9vδ2t细胞吸收的纳米硒粒子的方法包括：将含有纳米硒粒子的所述人vγ9vδ2t细胞培养体系置于离心管中进行离心，人vγ9vδ2t细胞在离心管底部形成沉淀，未被吸收的纳米硒粒子悬浮于培养基中，之后去除沉淀上方的液体，采用磷酸缓冲溶液对沉淀于底部的人vγ9vδ2t细胞进行清洗。
可选的，所述离心的转速为1500-2500r/min，离心时间为5-20分钟。
可选的，所述膦酸类化合物包括唑来膦酸、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
可选的，所述步骤2中，所述细胞悬液的细胞密度为3～4×106个/ml。
可选的，所述步骤2中，所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-200μm；所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基与所述人vγ9vδ2t细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-200ng/ml。
可选的，所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。
本发明的有益效果：
与常规的人vγ9vδ2t细胞扩增培养方法相比，本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法具有以下技术效果：
(1)增强人vγ9vδ2t细胞的抗凋亡能力，延长人vγ9vδ2t细胞的存活时间；
(2)提高人vγ9vδ2t细胞中抗肿瘤相关杀伤分子(如nkg2d、ifn-γ)的表达水平，并且能抑制人vγ9vδ2t细胞中pd-1分子的表达，从而增强人vγ9vδ2t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；
(3)显著增强人vγ9vδ2t细胞在体内抑制肿瘤生长、转移的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的存活情况对比图；
图2a为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子nkg2d表达水平与抑制分子pd-1表达水平的对比图；
图2b为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子ifn-γ与tnf-α表达水平的对比图；
图3为采用纳米硒预处理的vγ9vδ2t细胞在体外对癌细胞的杀伤情况示意图；
图4a为采用纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤大小的抑制效果及淋巴转移情况示意图；
图4b为采用纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤体积的抑制效果示意图；
图4c为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤重量的抑制效果示意图。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明首先提供一种人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法，包括：
步骤1、从人体外周血中提取外周血单个核细胞(pbmc)。
具体的，所述步骤1中，采用ficoll分离液把人体外周血中的外周血单个核细胞分离出来。
步骤2、提供人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基，采用所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行重悬，得到细胞悬液；
所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基包括人vγ9vδ2t细胞培养基以及添加于所述人vγ9vδ2t细胞培养基中的膦酸类化合物；所述人vγ9vδ2t细胞培养基包括基础培养基以及添加于所述基础培养基中的白介素-2(il-2)。
所述步骤1与步骤2的顺序能够调整或者同时进行。
步骤3、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养48-96小时。
步骤4、采用所述人vγ9vδ2t细胞培养基对细胞进行换液，后续培养过程均采用所述人vγ9vδ2t细胞培养基进行。
步骤5、从所述步骤3开始培养8-14天后，获得人vγ9vδ2t细胞培养体系，在所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中加入纳米硒粒子处理6-24小时。
步骤6、去除所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中未被所述人vγ9vδ2t细胞吸收的纳米硒粒子。
具体的，所述步骤1中，所述基础培养基为rpmi-1640培养基。rpmi是roswellparkmemorialinstitute的缩写，代指洛斯维·帕克纪念研究所。rpmi是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号，其中含有10％胎牛血清。
可选的，所述膦酸类化合物包括唑来膦酸(zoledronate,zol)、依替膦酸、伊班膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、利塞膦酸、米罗磷酸中的一种或多种。
在本发明的一实施例中，所述膦酸类化合物为唑来膦酸。
具体的，所述步骤2中，所述细胞悬液的细胞密度为3～4×106个/ml。
具体的，所述步骤2与步骤3的目的在于：通过采用含有膦酸类化合物的人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基对所述外周血单个核细胞进行培养，选择性的对所述外周血单个核细胞中的人vγ9vδ2t细胞进行扩增，并且抑制其它细胞的生长，使其它细胞凋亡。
可选的，所述细胞培养容器为24孔板、48孔板或96孔板。
所述步骤4的目的在于对所述步骤3选择性扩增出的纯度较高的人vγ9vδ2t细胞进行进一步扩增培养，以增加人vγ9vδ2t细胞的数量。
具体的，所述步骤2中，所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基中，膦酸类化合物的浓度为1-200μm；
所述人vγ9vδ2t细胞刺激扩增培养基与所述人vγ9vδ2t细胞培养基中，白介素-2的浓度为1-200ng/ml。
已知的是，1μm＝1μmol/l。
优选的，所述步骤3中，将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中培养72小时。
具体的，所述步骤4的后续培养过程中，每隔48-72小时对细胞进行换液。
具体的，所述步骤3与步骤4的总培养时间通常为8-14天(优选为10-12天)，也即是说，8-14天为一个扩增培养周期，一个扩增培养周期结束时细胞培养体系中的人vγ9vδ2t细胞数量充足，纯度达到90％以上，且细胞杀伤力较强，适用于细胞治疗。
众所周知的是，硒是一种过渡非金属元素，为人体必需微量元素。
具体的，所述纳米硒粒子的粒径为10～300nm，所述纳米硒粒子的纯度在99.9％以上。
具体的，所述步骤5中，将所述纳米硒粒子添加至所述人vγ9vδ2t细胞培养体系后，所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中纳米硒粒子的浓度为0.1～10μmol/ml，例如0.5μmol/ml、1μmol/ml、3μmol/ml、5μmol/ml、7μmol/ml、8μmol/ml、10μmol/ml等。
具体的，所述步骤5中，所述纳米硒粒子以悬浮液的形式加入所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中，所述悬浮液包括磷酸缓冲溶液以及分散于所述磷酸缓冲溶液中的纳米硒粒子，优选的，所述磷酸缓冲溶液的ph为7.2。
具体的，所述步骤5中，可以将纳米硒粒子直接添加至细胞培养板上的细胞培养体系中，也可以将细胞培养板上的细胞培养体系转移至其它容器中后再添加纳米硒粒子。
具体的，所述步骤5中，添加至所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中的至少部分纳米硒粒子会被所述人vγ9vδ2t细胞吸收。
可选的，所述步骤5中，在所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中加入纳米硒粒子处理的时间为6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时。
具体的，所述步骤6中，去除所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中未被所述人vγ9vδ2t细胞吸收的纳米硒粒子的方法包括：将含有纳米硒粒子的所述人vγ9vδ2t细胞培养体系置于离心管中进行离心，人vγ9vδ2t细胞在离心管底部形成沉淀，未被吸收的纳米硒粒子悬浮于培养基中，之后去除沉淀上方的液体，采用磷酸缓冲溶液对沉淀于底部的人vγ9vδ2t细胞进行清洗，清洗之后的细胞可直接用于细胞治疗。
具体的，所述离心的转速为1500-2500r/min，离心时间为5-20分钟。
优选的，所述离心的转速为2000r/min，离心时间为10分钟。
具体的，采用磷酸缓冲溶液对沉淀于底部的人vγ9vδ2t细胞进行清洗的次数可以为多次，每次采用磷酸缓冲溶液对沉淀于底部的人vγ9vδ2t细胞进行重悬后，再离心去上方液体，之后继续重悬、离心重复数次。
本发明的人vγ9vδ2t细胞扩增及预处理方法中，未注明具体条件的操作方法均按常规条件(如《精编分子生物学实验指南》(f.m.奥斯伯，r.e.金斯顿，j.g.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004))中所述的方法进行。
本发明的关键技术在于在所述人vγ9vδ2t细胞的扩增培养周期结束时采用纳米硒粒子对扩增得到的人vγ9vδ2t细胞进行预处理，经过大量实验(图1至图4c记载的各项实验)证明，采用纳米硒粒子预处理的人vγ9vδ2t细胞的衰老速度减缓，杀伤能力增强，从而抗肿瘤能力得到显著增强。
图1为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的存活情况对比图。
图1中，“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”表示按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法的步骤1至步骤4培养得到的人vγ9vδ2t细胞，“纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”表示按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法的步骤1至步骤5培养得到的人vγ9vδ2t细胞，上述两种细胞的步骤1至步骤4的培养条件相同。
从图1中可以看出，与“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”相比，“纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”的存活率明显更高，衰老速度较慢。也即是说，在人vγ9vδ2t细胞的培养体系中添加纳米硒粒子后能够显著延缓人vγ9vδ2t细胞的衰老速度。
图2a为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子nkg2d表达水平与抑制分子pd-1表达水平的对比图；图2b为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞与未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞的关键杀伤分子ifn-γ表达水平与tnf-α表达水平的对比图。
图2a及图2b中“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”与“纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”与图1中“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”与“纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”的含义相同，即培养方法、培养条件相同。
图2a及图2b中，纵坐标中的“对比”为“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”的各因子表达水平，所述各因子包括关键杀伤分子nkg2d、ifn-γ、tnf-α以及抑制分子pd-1。
已知的是，nkg2d、ifn-γ、tnf-α均为免疫细胞的杀伤性功能因子，其表达水平越高，表示细胞的杀伤能力越强；pd-1分子是表达在免疫细胞中使免疫细胞失去杀伤活性的一种功能抑制性分子，也即是说，pd-1分子的表达水平越低，细胞的杀伤能力越强。
从图2a及图2b中可以看出，与“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”相比，“纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”的关键杀伤分子nkg2d、ifn-γ的表达水平升高，抑制分子pd-1的表达水平降低。也即是说，在人vγ9vδ2t细胞的培养体系中添加纳米硒粒子后能够显著提高vγ9vδ2t细胞的杀伤能力。
图3为采用纳米硒预处理的vγ9vδ2t细胞在体外对癌细胞的杀伤情况示意图，所述癌细胞指的白血病k562细胞。
图3中，“单纯癌细胞”表示癌细胞的培养体系中没有加入其它物质；“单纯纳米硒处理的癌细胞”表示癌细胞的培养体系中加入了纳米硒粒子；“单纯t细胞处理的癌细胞”表示癌细胞的培养体系中加入了按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法步骤1至步骤4培养得到的人vγ9vδ2t细胞，该人vγ9vδ2t细胞没有经过纳米硒粒子处理。
“用纳米硒预处理t细胞后再处理癌细胞”表示癌细胞的培养体系中加入了按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法步骤1至步骤7培养得到的人vγ9vδ2t细胞，所述人vγ9vδ2t细胞经过纳米硒粒子处理。
图3中，“1”表示“单纯t细胞处理的癌细胞”与“用纳米硒预处理t细胞后再处理癌细胞”这两个实验组中，人vγ9vδ2t细胞与癌细胞的数量比为1:1；“10”表示人vγ9vδ2t细胞与癌细胞的数量比为10:1。
“单纯t细胞处理的癌细胞”与“用纳米硒预处理t细胞后再处理癌细胞”这两个实验组的主要步骤包括：首先将癌细胞用活细胞荧光染料csfe(5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯)染色标记；然后将人vγ9vδ2t细胞与用csfe标记癌细胞进行共孵育，再通过可标记死细胞的荧光染料(propidiumiodide，碘化丙啶)染色，利用流式细胞仪进行检测，即可分析癌细胞被杀伤的比例。
图3中，纵坐标表示癌细胞死亡率，从图3可以看出，采用纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞对癌细胞的杀伤能力明显高于未经纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞对癌细胞的杀伤能力。尤其是在1:1的情况下，即1个人vγ9vδ2t细胞对应1个癌细胞的条件下，“单纯t细胞处理的癌细胞”这一实验组中，人vγ9vδ2t细胞对癌细胞的杀伤率只有约9％，而“用纳米硒预处理t细胞后再处理癌细胞”这一实验组中，人vγ9vδ2t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力提高到约25％。
图4a至图4c为体内肿瘤抑制实验的结果示意图，其中，图4a为采用纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤大小的抑制效果及淋巴转移情况示意图，图4b为采用纳米硒处理的人vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤体积的抑制效果示意图，图4c为采用纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞在体内对肿瘤重量的抑制效果示意图。
体内肿瘤抑制实验的主要步骤包括：建立人源化小鼠的三阴型乳腺癌模型，将人vγ9vδ2t细胞或者盐水(对照)通过尾静脉注射治疗患癌小鼠，每三天注射一次细胞，每次注射不少于50万个细胞，连续治疗5次。对照实验中对患癌小鼠注射的生理盐水的体积与细胞治疗实验中对患癌小鼠注射的人vγ9vδ2t细胞的体积相同。
图4a中，“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”表示按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法的步骤1至步骤4培养得到的人vγ9vδ2t细胞，“纳米硒预处理的vγ9vδ2t细胞”表示按照本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法的步骤1至步骤7培养得到的人vγ9vδ2t细胞，上述两种细胞的步骤1至步骤4的培养条件相同。
从图4a可以看出，“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”对乳腺癌肿瘤大小的抑制效果不明显，但是乳腺癌肿瘤细胞没有转移。
“纳米硒预处理的vγ9vδ2t细胞”对乳腺癌肿瘤大小的抑制效果显著，并且乳腺癌肿瘤细胞没有转移。
“对照(盐水)”不具有抑制乳腺癌肿瘤大小的效果，并且乳腺癌肿瘤细胞转移至淋巴系统生成体积较大的肿瘤。
图4a、图4b、图4c中，“常规γδt治疗组”与“未经纳米硒处理的vγ9vδ2t细胞”为同一实验组，“纳米硒预处理的γδt细胞”与“纳米硒预处理的vγ9vδ2t细胞”为同一实验组，“对照(盐水)”与“盐水对照”为同一实验组。
图4b展示了对“常规γδt治疗组”、“纳米硒预处理的γδt细胞”、“盐水对照”3组实验的肿瘤体积的测量值的对比情况，从图4b可以看出，“纳米硒预处理的γδt细胞”实验组的肿瘤体积最小。
图4c展示了对“常规γδt治疗组”、“纳米硒预处理的γδt细胞”、“盐水对照”3组实验的肿瘤重量的测量值的对比情况，从图4c可以看出，“纳米硒预处理的γδt细胞”实验组的肿瘤重量最小。
以上图4a、图4b、图4c的结果显示，采用本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法得到的人vγ9vδ2t细胞能够有效的抑制乳腺癌细胞的生长，特别是能够100％抑制乳腺癌转移的发生。采用纳米硒预处理的人vγ9vδ2t细胞对小鼠乳腺肿瘤生长的抑制效果非常显著，能够显著减小肿瘤组织的体积，并减轻肿瘤组织的重量。
上述图1至图4c的实验中，涉及到纳米硒预处理实验时，所述人vγ9vδ2t细胞培养体系中添加的纳米硒粒子的浓度均为4～6μmol/ml。
综上所述，本发明通过在人vγ9vδ2t细胞的扩增培养周期结束时采用纳米硒粒子对扩增的人vγ9vδ2t细胞进行预处理，与常规方法培养的人vγ9vδ2t细胞相比，本发明培养的人vγ9vδ2t细胞具有更强的抗凋亡能力以及靶细胞(例如肿瘤细胞或者被病原体感染的细胞等)杀伤能力，对肿瘤的体内生长具有显著抑制作用。所述人vγ9vδ2t细胞在肿瘤、难治性传染病及免疫功能失衡的免疫细胞治疗中均具有非常广阔的应用前景，因此本发明的人vγ9vδ2t细胞的扩增及预处理方法具有非常广阔的市场前景和极高的产业化价值。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。