本发明属于皮脂腺技术领域，具体涉及一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法。
背景技术：
正常人皮脂腺细胞只能原代培养3-6代，不能满足大规模和长期皮脂腺细胞实验的需要。1999年，zouboulis等将人面部皮脂腺细胞转染猿猴病毒40大t抗原(sv40tag)，首次构建了德国人皮脂腺细胞株sz95。2003年，thiboutot等用同样方法构建了美国人皮脂腺细胞株seb-1。2008年，locelso等通过转染hpv16e6e7基因构建了英国人皮脂腺细胞株sebe6e7。目前应用较多的是sz95和seb-1细胞株，二者均保留了正常人皮脂腺主要特征，如合成脂质、表达皮脂腺标志物、发生凋亡、对雄激素和维a酸起作用。然而，这些细胞株不能完全分化，也会发生原位细胞溶解。thiboutot等用基因芯片检测了seb-1细胞、正常人皮脂腺中脂质和类固醇代谢酶类，发现5个脂质代谢酶、7个类固醇代谢酶基因表达差异无显著性。虽然sz95和sebe6e7细胞来源于皮脂腺，但其具有双潜能(皮脂腺和毛囊间表皮)分化能力。此外，近期还有学者发现绿茶提取物儿茶素没食子酸酯(egcg)可抑制igf-1诱导的sz95细胞脂质合成及促炎细胞因子(il-1、il-6、il-8)产生，提示egcg具有潜在的抗痤疮作用。因此，皮脂腺细胞株不仅被广泛用于研究皮脂腺生理及内分泌功能，而且用于探索皮脂腺相关疾病的发病机制和药物开发。
为此，我们提出一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法，为亚洲人痤疮治疗药物筛选提供了理想的细胞模型。
技术实现要素：
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法。
本发明所采用的技术方案为：
一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取人的面部皮肤，去除皮下脂肪并剥离表皮层，分离得到皮脂腺；
步骤(2)：培养皮脂腺细胞；
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株置入细胞培养皿中培养，含有sv40tag的细胞株的细胞长到95％时收集全部培养液，过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用；
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞进行培养，待细胞长到80％时，先加入步骤(3)的病毒培养液转染，再先后利用皮脂腺细胞培养液和含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液培养，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功。
进一步地，一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取人的面部皮肤，依次用pbs缓冲液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺细胞培养液中，然后去除皮下脂肪，将皮肤切成块状，加入中性蛋白酶，密封后放入温度4℃以下过夜；体视显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺；
步骤(2)：培养皮脂腺细胞：分离的皮脂腺置于具有胶原涂层的细胞培养皿中，将细胞培养皿放入5％co2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养液，待皮脂腺细胞长满后传代；
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株置入细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入dmem培养液，在5％co2细胞培养箱内于37℃下静置培养48h以上，细胞长到95％时收集全部培养液，过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用；
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞置入细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入皮脂腺细胞培养液，在5％co2细胞培养箱内于37℃下培养，待细胞长到80％时，加入病毒培养液转染6h-8h，弃掉皮脂腺细胞培养液及病毒培养液，用pbs缓冲液冲洗后，再加入皮脂腺细胞培养液继续培养48h以上；再加入含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，此后每24h更换一次上述含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，连续更换2次，待细胞长到90％时，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功。
进一步地，皮脂腺细胞培养液的配制过程为：向500ml的培养液中加入体积百分比为2％-10％的胎牛血清、体积百分比为1-2％的抗菌剂及浓度为0-10ng/ml的重组人egf。
进一步地，步骤(2)中，细胞培养皿的内径为6cm，细胞培养皿内的皮脂腺细胞培养液的体积不超过1.5ml。
进一步地，步骤(1)中，块状的尺寸为0.5cm×0.5cm。
进一步地，步骤(3)中，dmem培养液的配制过程为：向500ml的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清及体积百分比为1％的抗菌剂。
进一步地，步骤(3)中，通过滤孔孔径为0.22μm的针孔过滤器过滤。
进一步地，步骤(4)中，病毒培养液的转染时间为6h。
本发明的有益效果为：
本发明构建了皮脂腺细胞体外分化模型，随着培养时间的延长，免疫印迹显示sox9、foxo1、pparγ、srebp-1、lxr、p21及p53等的表达逐渐增多，从透射电镜观察发现：细胞逐渐融合，脂滴逐渐增多、增大，油红o脂肪染色法发现皮脂腺细胞皮脂分泌增加，这些表征都说明永生化皮脂腺细胞株构建成功，本发明的永生化皮脂腺细胞株的构建方法首次构建中国人永生化皮脂腺细胞株，可为亚洲人痤疮治疗药物筛选提供了理想的细胞模型。
附图说明
图1是本发明的皮脂腺细胞的透射电镜观察照片。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
本发明的皮脂腺细胞培养液来源于德国biochrom公司，抗菌剂来源于gibco公司，sv40tag细胞株由韩国忠南大学医学院皮肤科提供，g418由duchefabiochemiebv提供，针孔过滤器的型号为millex-gv，本发明的面部皮肤取样于中国人的面部皮肤。
实施例1：
本实施例提供一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取5名正常人面部皮肤(正常人面部皮肤：无炎症反应的面部皮肤，)，依次用pbs缓冲液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺细胞培养液中，然后去除皮下脂肪，将皮肤切成15个块状(块状的尺寸为0.5cm×0.5cm)，加入中性蛋白酶，密封后放入温度4℃以下过夜(这样处理是为了方便剥离表皮层)；体视显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺，可用镊子分离15个以上皮脂腺。其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为2％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(2)：培养皮脂腺细胞：分离的皮脂腺置于具有胶原涂层的细胞培养皿(6cm细胞培养皿内的皮脂腺细胞培养液不超过1.5ml)中，胶原涂层的培养皿上锚定的细胞数量更多，更有利于细胞的生长。将细胞培养皿放入5％co2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养液，待皮脂腺细胞长满后传代(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清、体积百分比为2％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf(表皮细胞生长因子简称egf，该重组人egf购置于美国invitrogen公司)，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株(韩国忠南大学医学院皮肤科赠送)置入10cm细胞培养皿中，向上述的细胞培养皿中加入dmem培养液10ml，其中，dmem培养液的配制过程为：向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清及体积百分比为1％的抗菌剂。上述的细胞培养皿在5％co2细胞培养箱内于37℃下静置培养48h以上，细胞长到95％(可采用相差显微镜观察细胞的生长过程)时收集全部培养液，经型号为millexgv(0.22μm)的针孔过滤器过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用。
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞置入10cm细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入皮脂腺细胞培养液10ml，在5％co2细胞培养箱内于37℃下培养，待细胞长到80％(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)时，加入病毒培养液转染6h，弃掉皮脂腺细胞培养液及病毒培养液，用pbs缓冲液冲洗后，再加入皮脂腺细胞培养液继续培养48h以上；再加入含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，此后每24h更换一次上述含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，连续更换2次，待细胞长到90％时，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功，标记为csp-sv-sebocytes。
实施例2：
本实施例提供一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取5名正常人面部皮肤，依次用pbs缓冲液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺细胞培养液中，然后去除皮下脂肪，将皮肤切成15个块状(块状的尺寸为0.5cm×0.5cm)，加入中性蛋白酶，密封后放入温度4℃以下过夜；体视显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺，可用镊子分离15个以上皮脂腺。其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为2％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(2)：培养皮脂腺细胞：分离的皮脂腺置于具有胶原涂层的细胞培养皿(6cm细胞培养皿内的皮脂腺细胞培养液不超过1.5ml)中，胶原涂层的培养皿上锚定的细胞数量更多，更有利于细胞的生长。将细胞培养皿放入5％co2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养液，待皮脂腺细胞长满后传代(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为4％的胎牛血清、体积百分比为2％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株(韩国忠南大学医学院皮肤科赠送)置入10cm细胞培养皿中，向上述的细胞培养皿中加入dmem培养液10ml，其中，dmem培养液的配制过程为：向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清及体积百分比为1％的抗菌剂。上述的细胞培养皿在5％co2细胞培养箱内于37℃下静置培养48h以上，细胞长到95％(可采用相差显微镜观察细胞的生长过程)时收集全部培养液，经型号为millexgv(0.22μm)的针孔过滤器过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用。
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞置入10cm细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入皮脂腺细胞培养液10ml，在5％co2细胞培养箱内于37℃下培养，待细胞长到80％(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)时，加入病毒培养液转染6h，弃掉皮脂腺细胞培养液及病毒培养液，用pbs缓冲液冲洗后，再加入皮脂腺细胞培养液继续培养48h以上；再加入含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，此后每24h更换一次上述含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，连续更换2次，待细胞长到90％时，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为2％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功，标记为csp-sv-sebocytes。
实施例3：
本实施例提供一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取5名正常人面部皮肤，依次用pbs缓冲液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺细胞培养液中，然后去除皮下脂肪，将皮肤切成15个块状(块状的尺寸为0.5cm×0.5cm)，加入中性蛋白酶，密封后放入温度4℃以下过夜；体视显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺，可用镊子分离15个以上皮脂腺。其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为2％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(2)：培养皮脂腺细胞：分离的皮脂腺置于具有胶原涂层的细胞培养皿(6cm细胞培养皿内的皮脂腺细胞培养液不超过1.5ml)中，胶原涂层的培养皿上锚定的细胞数量更多，更有利于细胞的生长。将细胞培养皿放入5％co2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养液，待皮脂腺细胞长满后传代(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为4％的胎牛血清、体积百分比为2％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株(韩国忠南大学医学院皮肤科赠送)置入10cm细胞培养皿中，向上述的细胞培养皿中加入dmem培养液10ml，其中，dmem培养液的配制过程为：向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清及体积百分比为1％的抗菌剂。上述的细胞培养皿在5％co2细胞培养箱内于37℃下静置培养48h以上，细胞长到95％(可采用相差显微镜观察细胞的生长过程)时收集全部培养液，经型号为millexgv(0.22μm)的针孔过滤器过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用。
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞置入10cm细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入皮脂腺细胞培养液10ml，在5％co2细胞培养箱内于37℃下培养，待细胞长到80％(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)时，加入病毒培养液转染6h，弃掉皮脂腺细胞培养液及病毒培养液，用pbs缓冲液冲洗后，再加入皮脂腺细胞培养液继续培养48h以上；再加入含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，此后每24h更换一次上述含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，连续更换2次，待细胞长到90％时，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为8％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功，标记为csp-sv-sebocytes。
实施例4：
本实施例提供一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法，包括以下步骤：
步骤(1)：分离皮脂腺：切取5名正常人面部皮肤，依次用pbs缓冲液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺细胞培养液中，然后去除皮下脂肪，将皮肤切成15个块状(块状的尺寸为0.5cm×0.5cm)，加入中性蛋白酶，密封后放入温度4℃以下过夜；体视显微镜下剥离表皮层，分离得皮脂腺，可用镊子分离15个以上皮脂腺。其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为2％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(2)：培养皮脂腺细胞：分离的皮脂腺置于具有胶原涂层的细胞培养皿(6cm细胞培养皿内的皮脂腺细胞培养液不超过1.5ml)中，胶原涂层的培养皿上锚定的细胞数量更多，更有利于细胞的生长。将细胞培养皿放入5％co2细胞培养箱内在37℃下静置培养48-72h，每48-72h更换一次皮脂腺细胞培养液，待皮脂腺细胞长满后传代(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为6％的胎牛血清、体积百分比为2％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(3)：病毒培养液的制备：将含有sv40tag的细胞株(韩国忠南大学医学院皮肤科赠送)置入10cm细胞培养皿中，向上述的细胞培养皿中加入dmem培养液10ml，其中，dmem培养液的配制过程为：向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为10％的胎牛血清及体积百分比为1％的抗菌剂。上述的细胞培养皿在5％co2细胞培养箱内于37℃下静置培养48h以上，细胞长到95％(可采用相差显微镜观察细胞的生长过程)时收集全部培养液，经型号为millexgv(0.22μm)的针孔过滤器过滤后，得病毒培养液，在4℃下保存备用。
步骤(4)：sv40tag转染：将第二或第三代的皮脂腺细胞置入10cm细胞培养皿中，向细胞培养皿中加入皮脂腺细胞培养液10ml，在5％co2细胞培养箱内于37℃下培养，待细胞长到80％(可采用相差显微镜观察皮脂腺细胞的生长过程)时，加入病毒培养液转染6h，弃掉皮脂腺细胞培养液及病毒培养液，用pbs缓冲液冲洗后，再加入皮脂腺细胞培养液继续培养48h以上；再加入含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，此后每24h更换一次上述含200μg/mlg418的皮脂腺细胞培养液，连续更换2次，待细胞长到90％时，得转染细胞株，开始第一次传代，以后每72-96h传代一次；其中，向一瓶500ml的德国biochrom公司购置的培养液中加入体积百分比为6％的胎牛血清、体积百分比为1％的抗菌剂及浓度为5ng/ml的重组人egf，即得本步骤的皮脂腺细胞培养液。
步骤(5)：步骤(4)中的转染细胞株连续传至50代得稳定转染细胞株，永生化皮脂腺细胞株构建成功，标记为csp-sv-sebocytes。
以上实施例的正常人面部皮肤选自于中国人。
总之，本发明构建了皮脂腺细胞体外分化模型，随着培养时间的延长，免疫印迹显示sox9、foxo1、pparγ、srebp-1、lxr、p21及p53等的表达逐渐增多，如图1所示，从透射电镜观察发现：细胞逐渐融合，脂滴逐渐增多、增大，这些表征均说明永生化皮脂腺细胞株构建成功。
本发明的永生化皮脂腺细胞株的构建方法首次构建中国人永生化皮脂腺细胞株，可为亚洲人痤疮治疗药物筛选提供了理想的细胞模型。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。