本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种子宫内膜干细胞的分离培养方法及其专用培养基。
背景技术：
近年来越来越多的研究表明，在子宫内膜中具有一小群具有强大增殖能力和多向分化潜能的干细胞，使子宫内膜能够保持不断的自我更新和再生能力。鉴于子宫内膜干细胞与子宫内膜生长的密切关系，可以从体外分离培养子宫内膜干细胞，然后移植于机体内，为子宫内膜损伤或病变、子宫内膜异位、不孕症、子宫内膜癌等疾病的诊断与治疗开辟新的道路。
目前国内外对于子宫内膜干细胞的研究相对较少，子宫内膜干细胞作为成体干细胞，在人体内的数量非常稀少，smalley等发现，子宫内膜存在上皮和基质两种类型的干细胞，两种类型的细胞均可形成大克隆和小克隆。小克隆是短暂增殖细胞，其分化潜能低，排列松散，大克隆是有前体细胞起源的，具有高度分化的潜能，有小细胞紧密聚集而成。由于子宫内膜干细胞的复杂性与稀少性，严重制约了子宫内膜干细胞的研究，采用常规干细胞的分离与培养方法来体外制备子宫内膜干细胞，具有得到的细胞纯度低，干细胞数量少，具有高度分化潜能的干细胞数量更少，且传代数量少，产量低，分化严重等问题细胞，且还具有培养液成分复杂，重复性低等问题。
技术实现要素：
本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，具体技术方案如下：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1-2mm3碎块，加入消化液于37℃消化处理1-2h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4-5×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养7-10天，收取贴壁细胞，并标记为p0代细胞；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、8-15ng/mlegf和8-15ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
优选地，所述步骤3)中的p0代细胞包括p01代细胞和p02代细胞，在培养3-8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养3-4天，收取铁壁细胞并标记为p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿中，更换培养基后继续培养4-6天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
采用上述方法，得到的子宫内膜干细胞得率高、纯度高，得到的子宫内膜干细胞可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞具有高度分化的潜能。
进一步地，步骤3)中，p01代细胞培养过程中，向培养基中加入3-6ng/mllif和10-20mg/ml的n乙酰半胱氨酸(nac)；p02代细胞培养过程中，向培养基中加入8-18ng/mlbfgf和70-90ng/ml辅酶q10。
在不同的时间内，向培养基中加入特定添加剂，进一步提高了大克隆干细胞的得率。
进一步地，所述消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min-1h,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化30min-1h。
采用上述消化方式，消化分离后，细胞活率高，得到的细胞杂质少，且在培养过程中存活率高。
进一步地，所述贴壁细胞的收取方法具体如下：将含有未贴壁细胞的培养液进行移除，然后向原培养皿中加入氯化钠注射液轻轻冲洗1-2遍，向培养皿中加入含有0.125mg/ml胰蛋白酶和0.02mg/mledta的pbs缓冲液，静置1min后，显微镜观察，待镜下细胞变圆，大部分细胞脱落，向培养皿中加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清，即得待收获细胞。
优选地，步骤2)中的离心条件为1000rpm离心5min；所述步骤3)中的离心条件为1500rpm离心5min。
进一步地，所述方法还包括如下步骤：
步骤4)p1代细胞培养：将步骤3)得到的p01代细胞与p02代细胞分别加入氯化钠注射液进行重悬，得到单细胞悬液，然后将单细胞悬液加入到培养基中，按照4-5×104个/ml的浓度，在37.0±0.5℃、5.0±0.2％co2浓度的饱和湿度的条件下分别单独进行培养，至细胞融合度达到85-90％，进行细胞收获，合并后得到p1代细胞，其中氯化钠住着也与培养基的体积比为1:21；
步骤5)pn代细胞培养：取p1代细胞按照1:2-6的比例进行传代培养，传养至9代。
进一步地，p01代细胞传代培养过程中，向培养基中加入8-15ng/mllif和10-30ng/ml的tgf-β1；p02代细胞传代培养过程中，向培养基中加入10-20ng/mlbfgf和40-60ng/ml辅酶q10、8-12ng/mltgf-α。
采用上述传代培养方法，将得到的p01代细胞与p02代细胞分别单独进行培养，并向培养基中加入不同的成长因子，可保持干细胞的未分化状态，保持干细胞的活性；同时有效引导细胞增殖，大大提高了子宫内膜干细胞的产量和质量。
本发明还提供一种用于子宫内膜干细胞培养的培养基，所述培养基由dmem/f12培养液和溶质组成，溶质及其在dmem/f12培养液中的浓度为：10％胎牛血清、8-15ng/mlegf和8-15ng/mlpdgf-bb。
进一步地，所述dmem/f12培养液中还包括3-6ng/mllif和10-20mg/ml的nac的混合物，或者8-18ng/mlbfgf和70-90ng/ml辅酶q10的混合物。
本发明所提供的用于子宫内膜干细胞培养的培养基，配方简单合理，保持子宫内膜干细胞的高活率，在能有效提高细胞扩增速度的同时保持子宫内膜干细胞的未分化状态，不影响其分化性能，延长传代次数。
本发明提供了一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，根据间充质干细胞的生长特性与需求，采用的培养基成分简单，培养过程可重复性高，成功率稳定；同时对子宫内膜干细胞进行分离与培养，得到的原代细胞中，干细胞的纯度高，具有高度分化潜能的干细胞数量多，对原代细胞进行多次传代，增殖高效，分化少，第9代传代细胞依旧具有良好的增殖和分化能力。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
实施例1
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1mm3碎块，加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀，采用台盼蓝染色，计数活细胞；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养3h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养10天，每隔四天换液，然后收取贴壁细胞并标记p0代细胞；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、8ng/mlegf和15ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例2
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1mm3碎块，加入消化液于37℃消化1h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀，采用台盼蓝染色，计数活细胞；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照5×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养3h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养4天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养4天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞，对收取的p01代细胞和p02代细胞采用台盼蓝染色进行计数；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、8ng/mlegf和15ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例3
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成2mm3碎块，加入消化液于37℃消化2h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4.5×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养8h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入6ng/mllif和20mg/ml的nac，继续培养3天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入8ng/mlbfgf和90ng/ml辅酶q10，继续培养6天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、15ng/mlegf和8ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例4
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1mm3碎块，加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h，消化终止，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养5h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入3ng/mllif和10mg/ml的nac，然后继续培养4天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入18ng/mlbfgf和70ng/ml辅酶q10，然后继续培养5天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、10ng/mlegf和10ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例5
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成2mm3碎块，加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化1h,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h，消化终止，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，1000rpm离心5min，弃上清得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养5h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入5ng/mllif和15mg/ml的nac，然后继续培养4天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入12ng/mlbfgf和80ng/ml辅酶q10，然后继续培养5天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、12ng/mlegf和10ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
其中，贴壁细胞的收取方法具体如下：将含有未贴壁细胞的培养液进行移除，然后向原培养皿中加入氯化钠注射液轻轻冲洗1或2遍，向培养皿中加入含有0.125mg/ml胰蛋白酶和0.02mg/mledta的pbs缓冲液，静置1min后，显微镜观察，待镜下细胞变圆，大部分细胞脱落，向培养皿中加入消化终止液，离心、洗涤后再次离心，弃上清，即得待收获细胞。
实施例6
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1mm3碎块，加入消化液于37℃消化1h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养6h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养4天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后继续培养5天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
4)p1代细胞培养：将步骤3)得到的p01代细胞与p02代细胞分别加入氯化钠注射液进行重悬，得到单细胞悬液，然后将单细胞悬液加入到培养基中，按照4×104个/ml的浓度，在37.0±0.5℃、5.0±0.2％co2浓度的饱和湿度的条件下分别单独进行独立培养，至细胞融合度达到85-90％，进行细胞收获，然后将p01代细胞经传代后的细胞和p02代细胞经传代后得到的细胞进行合并混合，得到p1代细胞；
5)取p1代细胞按照1:2的比例进行传代培养，传养至9代。
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、13ng/mlegf和14ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例7
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，所述方法包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成2mm3碎块，加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化1h,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶和0.05mg/ml的的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h，消化终止，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，1000rpm离心5min，弃上清得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，培养5h，将培养皿中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入5ng/mllif和15mg/ml的nac，然后继续培养4天，然后收取贴壁细胞并标记p01代细胞，将培养基中未贴壁细胞移入新的培养皿，更换培养基后，向培养基中加入12ng/mlbfgf和80ng/ml辅酶q10，然后继续培养5天，收取贴壁细胞，并标记为p02代细胞；
4)p1代细胞培养：将步骤3)得到的p01代细胞与p02代细胞分别加入氯化钠注射液进行重悬，得到单细胞悬液，然后将单细胞悬液加入到培养基中，按照5×104个/ml的浓度，分别单独进行培养，向p01代细胞传代培养的培养基中加入8ng/mllif和10ng/ml的tgf-β1；向p02代细胞传代培养的培养基中加入20ng/mlbfgf和40ng/ml辅酶q10、12ng/mltgf-α，在37.0±0.5℃、5.0±0.2％co2浓度的饱和湿度的条件下培养至细胞融合度达到85-90％，进行细胞收获，合并后得到p1代细胞；
5)取p1代细胞按照1:6的比例进行传代培养，传养至9代。
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、12ng/mlegf和10ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
实施例8
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例6的区别在于，步骤4)中，p01代细胞传代培养过程中，向培养基中加入15ng/mllif和30ng/ml的tgf-β1；p02代细胞传代培养过程中，向培养基中加入10ng/mlbfgf和60ng/ml辅酶q10、8ng/mltgf-α。
实施例9
用于子宫内膜干细胞培养的培养基，由dmem/f12培养液和溶质组成，溶质及其在dmem/f12培养液中的浓度为：10％胎牛血清、8ng/mlegf和15ng/mlpdgf-bb。
实施例10
用于子宫内膜干细胞培养的培养基，由dmem/f12培养液和溶质组成，溶质及其在dmem/f12培养液中的浓度为：10％胎牛血清、15ng/mlegf和8ng/mlpdgf-bb。
对照例1
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，包括如下步骤：
1)洗涤：在无菌条件取得离体子宫内膜，用氯化钠注射液进行漂洗；
2)消化：将步骤1)所得的子宫内膜切成1mm3碎块，加入消化液于37℃消化1h，消化终止后，于氯化钠注射液中漂洗，离心分离，得到的沉淀再用氯化钠注射液进行洗涤吹打均匀后，过40μm细胞筛，收集滤液，离心弃上清，得细胞沉淀；
3)原代培养：向步骤2)所得的细胞沉淀中加入培养基，得到单细胞悬液，按照4×104个/ml的浓度，接种于培养皿中，于第4天更换培养液，培养8天后，收取贴壁细胞，得到p0代细胞。
其中所述培养基为包括10％胎牛血清、8ng/mlegf和15ng/mlpdgf-bb的dmem-f12培养基。
对照例2
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例3的区别在于，p01代细胞培养过程中，向培养基中加入6ng/mlscf和20mg/ml的nac；p02代细胞培养过程中，向培养基中加入8ng/mlhgf和90ng/ml辅酶q10。对照例3
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例3的区别在于，p01代细胞培养过程中，向培养基中加入26ng/mllif；p02代细胞培养过程中，向培养基中加入8ng/mlbfgf。
对照例4
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例3的区别在于，其中所述培养基为包括10％胎牛血清、12ng/mltgf和10ng/mlpdgf-ab的dmem-f12培养基。
对照例5
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别在于，消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/ml胶原酶ⅱ和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h。
对照例6
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别在于，消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/ml胶原酶i氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h。
对照例7
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别在于，消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/ml胶原酶i和0.2mg/mldispaseⅱ的hank's注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml透明质酶的pbs缓冲液，于37℃继续消化1h。
对照例6
一种子宫内膜干细胞的分离培养方法，与实施例4的区别在于，消化步骤的具体消化方法如下：加入含有0.05mg/ml胰蛋白酶和0.2mg/mldispaseⅱ的氯化钠注射液，于37℃摇床内消化30min,然后替换消化液为含有1mg/ml脱氧核糖酶i的氯化钠注射液，于37℃继续消化1h。
试验1：干细胞特性的检测
取采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例6、实施例7和对照例1-4的分离培养方法得到的p01代细胞、p02代细胞和第9代细胞，采用流式细胞法检测cd90和cd49f的表达，采用rt-pcr法检测oct-4的表达，检测cd90、cd49f和oct-4标记阳性率，结果见表1。
表1子宫内膜干细胞的干细胞特性检测
上述试验结果可知，实施例1与对照例1相比，在oct-4阳性率和cd90与cd49f共同阳性率均有提升，实施例2oct-4阳性率和cd90与cd49f共同阳性率在58％以上，而实施例3所得的原代干细胞oct-4阳性率和cd90与cd49f共同阳性率进一步提高到73％以上，通过本发明所提供的子宫内膜干细胞的分离培养方法，对子宫内膜干细胞进行分离与培养，得到的原代细胞中，干细胞的纯度高，具有高度分化潜能的干细胞数量多。实施例6和实施例7对得到的原代干细胞进行多次传代培养，在第9代细胞中，oct-4阳性率和cd90与cd49f共同阳性率可以达到90％以上，第9代细胞纯度高，传代过程中分化少，得到的干细胞依然保持高度的强增殖和分化能力。与实施例相比，采用对照例的分离与培养方法进行子宫内膜干细胞的培养，得到的原代干细胞中，有效干细胞含量非常低，杂细胞数量多，得到的干细胞进行传代培养，分化较为严重。
试验2：对子宫内膜干细胞扩增倍数的检测
取采用实施例7、实施例4和对照例5-7的分离培养方法进行子宫内膜干细胞培养，在消化步骤后，原代培养完毕后和传代培养完毕后，采用台盼蓝经典染色法对细胞进行计数，分别统计消化步骤后、第4代和第9代活子宫内膜干细胞的数量，结果见表2。
表2子宫内膜干细胞体外培养扩增细胞数量(×105个/ml)
注：“--”表示未做传代培养试验。
由表1可以看出，本发明子宫内膜干细胞的分离培养方法，根据子宫内膜干细胞的特性，合理选择消化液与消化方式，得到的细胞活率高，杂质少，培养过程中存活率高，相对于实施例4，对照例5-7经过消化后进行原代培养，得到的细胞数量与实施例4的差距具有统计学意义；实施例7可知，本发明所提供的子宫内干细胞的分离培养方法，可以有效的体外培养子宫内膜干细胞，且扩增培养非常高效，同时扩增后干细胞活性高，纯度高，质量好。