专利名称：一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法
技术领域：
本发明涉及一种体外分离人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞的试剂盒及干细胞分离方法，属于生物医学技术应用领域。
背景技术：
现有技术中，用于人类血液细胞分离的方法包括免疫磁珠法、流式细胞仪法、血细胞分离机法和培养扩增法等方法。免疫磁珠法将已知的抗体包被在磁珠微粒上，使磁珠微粒与人类血液混合。呈抗原抗体阳性的细胞粘附在磁珠上，通过一条磁性管道，磁珠被吸附在管壁上；其它没有结合磁珠的细胞都流走后，去除管道磁性，搜集所有含有磁珠的细胞。存在问题造价高，中低收入患者不适用。对细胞本身活性有损伤，影响细胞治疗疗效。流式细胞仪法分选原理流式细胞计的分选功能是由细胞分选器完成的。总的过程由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉，某些类型的仪器也有采用捕获管来进行分选的。存在问题，一台流式细胞仪造价300-500万元，标记用抗体 1500-5000元一支，造价高，标记物有致癌性，应用于临床不安全，只能适用于科研。血细胞分离机法主要用于分离外周血，先给患者注射动员剂，然后使患者外周血经过血细胞分离机循环过滤，得到一定范围直径的细胞，用于细胞治疗。存在问题打动员剂增加治疗负担， 分离后细胞液体积过大，患者承担一定的生命危险。培养扩增法采集人类血液后，加入试剂置于培养箱扩增，1周后清洗使用。存在问题污染率高，干细胞向未知方向分化为未知干细胞，时间长。现有技术中，已经公开的涉及骨髓和血液分离专利文献申请号200510130326. 7，名称一种分离细胞的方法及专用细胞分离液。该分离细胞的方法缺点上述方法针对鸡，牛，人血液需要做各种调整，准确度堪忧，由于添加了表面活性剂，分离出的细胞未知，只能用于简单的细胞试验使用。申请号200610035900. 5，名称一种干细胞分离液及其用于干细胞分离的方法。 该干细胞分离液和干细胞分离的方法的缺点需要配制工作液，需要调节密度，只能搜集密度在1.083g/ml范围内的细胞，即搜集到的细胞较杂，而可用于治疗所需要的目标细胞数量少，并且对于脐带血来说，使用该方法去除红细胞不净，最终临床应用的时候会导致患者产生排异反应。
申请号200610114475. 9名称用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒使用该试剂盒的缺点使用该试剂盒直接分离血液中的干细胞，数量不足以临床治疗使用，所以该方法进行了细胞培养，培养的细胞污染率高，体外模拟体内环境使细胞扩增，导致培养出的细胞有形态没功能，不能用于临床治疗。申请号200610106875. 5名称一种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法。缺点此试剂盒及其应用方法所用的HIST0PAGUE 1077为密度1. 077g/ml的淋巴细胞分离液， 经此分离后的细胞绝大多数为淋巴细胞，这样导致细胞中能够用于治疗的干细胞占少数， 影响临床疗效。申请号200710137781. 9名称骨髓脐带血干细胞体外分离试剂盒及其应用方法。缺点该试剂盒的使用中添加了 Iin抗体，导致成本大大提高，投入到临床使用后，给中低收入患者造成经济负担，导致患者看不起病，接受不起细胞治疗，并且使用了 Iin抗体对细胞清洗造成了较大负担，此种物质进入人体后会发生何种变化还是未知数。
背景技术：
中需要解决的技术问题治疗成本高。完成细胞分离工作的仪器设备(如血细胞分离机及流式细胞仪)价格昂贵，导致治疗成本升高，增加了患者的治疗费用，不利于项目的推广和普及。细胞活性低。免疫磁珠法和流式细胞仪法筛选出来的均是被标记了的细胞，这些分选方法均存在筛选细胞范围小、细胞负重后活性降低以及标记物留在人体内会变成什么还是未知等问题。细胞液体积大。使用血细胞分离机分离的一般为外周血，且需要采集前打2-7天动员剂，将骨髓中干细胞动员到外周血里，经血细胞分离机分离后筛选出的细胞液体积较大，一般都超过 50ml，且红细胞去除不干净。最后得到的细胞悬液体积大、质量不佳，只能用于自体皮下注射。获取细胞时间过长。培养扩增一周后才能用于临床治疗，时间过长会延误治疗的最佳时机，影响治疗效果，培养期间造成污染率提高。传统的分离方法仅限于实验室及科研使用。许多分离方法操作过程繁琐，对人员的专业要求较高，既费时又费力。从实验方法到临床应用还需要技术改进。不能产业化。实验成本高、操作环节中污染机率大、细胞液的保存运输条件不备，导致提取的细胞液数量有限，满足不了临床治疗的大量需求。以上专利文献公开的试剂盒或其使用方法存在的缺点。以上相关专利文献公开的试剂盒或方法存在原料来源复杂，配制繁琐，对于分离哪种血液针对性不强(因为人类血和动物血细胞存在一定差异)，获得的分离液用与治疗难以控制等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞分离试剂盒及使用试剂盒分离人类骨髓干细胞、脐带血干细胞或外周血干细胞的方法，提高人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞的分离数量和回收率，同时克服现有技术中造价高，有标记物，需要打动员剂造成患者痛苦，获取时间长，繁琐不适用临床等缺陷。为临床治疗提供干细胞分离效率更高的人类骨髓、脐带血或外周血干细胞分离试剂盒，提高骨髓、脐带血或外周血的利用效率。为实现本发明的目的，发明人设计了多种方案，在进行了大量的试验和对试验数据进行统计和分析后，惊奇的发现在分离干细胞的过程中，加入适量脑蛋白水解物(市售) 有助于提高目标干细胞的回收数量，而对目标干细胞的存活率不产生不利影响。本发明提供的试剂盒及其使用方法能够分离人类骨髓、脐带血或外周血中的干细胞，具体是将试剂盒中1号2号3号试剂组合应用，体外分离人类骨髓、人类脐带血或外周血，得到其中的干细胞。本发明的试剂盒由1号液、2号液和3号液组成，所述百分比(％ )均为重量百分比(W/W)，密度单位g/ml，1号液、2号液和3号液的溶剂均为水。1号液(稀释剂)0. 1% -30%氯化钠注射液或pH7-7. 5的磷酸盐缓冲液(PBS) 液，分别加入0. 1% -20%的脑蛋白水解物，溶剂为水。2号液(沉淀剂)0· -30%羟乙基淀粉或0. 1% -30%甲基纤维素水溶液。3号液(分层液)由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 0-1. 2g/ml的分层液组成，配有500ml大容量培养液瓶，免除临床现有少量多次分离干细胞的繁琐过程，大大降低了污染机率。其中，上述1号液和2号液经过100°C _130°C，10分钟-50分钟灭菌，检测其内毒素含量彡0. 5EU/ml，装瓶。上述3号液经过100°C -130°C, 10分钟-50分钟灭菌，检测其内毒素含量彡IEU/ ml,装瓶。本发明优选的技术方案为1号液0. 3-12%氯化钠注射液或pH7. 1-7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入0. 3-15% 的脑蛋白水解物形成的溶液。2号液0. 5-18%羟乙基淀粉或0. 2_8%甲基纤维素。3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 01-1. 088g/ml的分层液。本发明更加优选的技术方案为1号液0. 5-2%氯化钠注射液或pH7. 2_7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入0. 8_6%的脑蛋白水解物形成的溶液；2号液1. 5-12%羟乙基淀粉或0. 3_5%甲基纤维素；3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 035-1. 080g/ml的分层液。本发明最优选的技术方案为1号液0. 9%氯化钠注射液或pH7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入3%的脑蛋白水解物形成的溶液。2号液6%羟乙基淀粉或0. 5%甲基纤维素。
3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 075g/ml的分层液。本发明所述的人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒的使用方法为将含有枸橼酸钠抗凝液的骨髓、脐带血加入到含有1号液的大容量培养液瓶中，再加2号液混勻，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后铺到3号液上层，然后离心分出干细胞层， 搜集干细胞层后用生理盐水清洗，待用。从以上人类骨髓、脐带血或外周血干细胞分离试剂盒技术方案中可以看出，与现有技术中分离干细胞的方法不同，在本发明的技术方案中去除了人类骨髓、人类脐带血或外周血中的红细胞，血浆，血小板，血红蛋白，粒细胞等，经过本发明分离的干细胞回收率能够达到85%以上。并且干细胞存活率检测大于98%本项发明优点1、分离血液针对性强只分离人类骨髓、脐带血或外周血。2、原料简单易得，成本低廉，并且加入了简单易得的脑蛋白水解物提高干细胞分离回收数量。3、干细胞得率高，完全满足临床需求。4、干细胞处理试剂盒内1号，2号和3号液内毒素均符合临床使用要求，不会造成患者发热等现象。5、在最低的价格，最简便的分离方法下分离出治疗所需要的干细胞。6、对环境及干细胞本身不会造成任何污染，是临床上迫切需要的一种分离干细胞的试剂盒及方法。是目前分离提取方法中可操作性强、临床安全性高、便于临床推广的最好技术方案；同时本试剂盒易于存储运输、可产业化生产、使用方便快捷。经由本发明人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒分离的干细胞具有造价低，保留原有干细胞活性，干细胞液体积小，干细胞种类齐全，分离操作时间短1小时左右即可完成，干细胞数量能够满足临床治疗的需要等优点。
图1是使用本发明的干细胞处理试剂盒，分离人类骨髓得到的干细胞的显微照片；图2是使用本发明的干细胞处理试剂盒，分离人类脐带血得到的干细胞的显微照片；图3是使用本发明的干细胞处理试剂盒，分离人类外周血得到的干细胞的显微照片。
具体实施例方式实施例1 分离人类脐带血试剂盒组成1号液稀释剂PBS液氯化钠4g，氯化钾0. Ig, 12水磷酸氢二钠1. 445g，磷酸二氢钾0. Ig先用少量水溶解上述试剂，然后加水至500ml，即得，用前用5. 6%碳酸钠调节PH至7-7. 5。加入3%脑蛋白水解物(市售，配制成3%的水溶液)。2号液沉淀剂6%羟乙基淀粉(市售)3号液分离液将聚蔗糖与泛影葡胺制成密度1. 075g/ml的分离液。上述1号液和2号液经过100°C _130°C，10分钟-50分钟灭菌，检测其内毒素含量彡0. 5EU/ml，装瓶。上述3号液经过100°C _130°C，10分钟-50分钟灭菌，检测其内毒素含量彡lEU/ml，装瓶。操作方法将含有枸橼酸钠抗凝液的实验用人类脐带血(ml数见表1)平均分成两份，取其中一份加入到含有20-350ml的1号液中，再加入4_200ml2号液，摇勻1_8分钟，放置3分钟-3小时，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟离心1-20分钟，搜集下层细胞液，用生理盐水稀释后铺在号液3液上，以500-4000转/分钟离心1-60分钟，收集中间干细胞层后，用生理盐水清洗1-5次，再用生理盐水稀释至临床使用体积即得，甲组数据。取实验用另一半脐带血，按照市售分离试剂说明书提供的方法分离，得到乙组，如下表所示甲组为本发明设计的干细胞处理试剂盒组，乙组为市售分离试剂组，从数据上显示，甲组数量明显高于乙组。表1 人类脐带血使用本发明干细胞处理试剂盒及市售分离试剂分离出的干细胞数量比较
权利要求
1.一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理试剂盒，所述的干细胞处理试剂盒由1 号液、2号液和3号液组成，所述百分比(％)均为重量百分比(W/W)，密度单位g/ml，l号液、2号液和3号液的溶剂均为水；1号液0. 1% -30%氯化钠注射液或PH7-7. 5的磷酸盐缓冲液，分别加入0. 1% -20% 的脑蛋白水解物形成的溶液；2号液0. 1% -30%羟乙基淀粉或0. 1% -30%甲基纤维素； 3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 0-1. 2g/ml的分层液组成。
2.根据权利要求1所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于1号液0. 3-12%氯化钠注射液或pH7. 1-7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入0. 3-15%的脑蛋白水解物形成的溶液；2号液0. 5-18%羟乙基淀粉或0. 2-8%甲基纤维素； 3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 01-1. 088g/ml的分层液。
3.根据权利要求1所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于1号液0. 5-2%氯化钠注射液或pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入0. 8_6%的脑蛋白水解物形成的溶液；2号液1. 5-12%羟乙基淀粉或0. 3-5%甲基纤维素； 3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 035-1. 080g/ml的分层液。
4.根据权利要求1所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于1号液0. 9%氯化钠注射液或pH7. 4的磷酸盐缓冲液，分别加入3%的脑蛋白水解物形成的溶液；2号液6%羟乙基淀粉或0. 5%甲基纤维素； 3号液由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度为1. 075g/ml的分层液。
5.根据权利要求1至4所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于其中，所述的1号液到3号液是经过温度为100°C -130°C，时间为10分钟-50分钟灭菌的液体。
6.根据权利要求5所述的干细胞处理试剂盒，其特征在于其中，所述的1号液到3号液是经过温度为105°C -120°C，时间为15分钟-20分钟灭菌的液体。
7.一种人类骨髓、脐带血或外周血干细胞处理的方法，所述方法包括将骨髓、脐带血或外周血样品加入到含有1号液的大容量培养液瓶中，再加2号液混勻，静置，待分层后吸取上层细胞液离心浓缩后铺到3号液上层，然后离心分出干细胞层。
8.根据权利要求7所述的人类骨髓、脐带血或外周血干细胞分离的方法，其特征在于离心分离的离心机转速为500-4000转/分钟。
全文摘要
本发明涉及一种人类骨髓、脐带血或外周血中干细胞处理试剂盒及干细胞分离方法，所述试剂盒由1号液、2号液和3号液组成，在现有技术的基础上，本发明在1号液中加入了脑蛋白水解物，有效提高了处理样品的干细胞回收数量。使用本发明的试剂盒分离人类骨髓、脐带血或外周血针对脐带血样品，分离后细胞回收总数提高了5.9-15.8％，分离后CD34干细胞回收总数提高了5.0-8.8％；针对骨髓样品，分离后细胞回收总数提高了8.7-21％，分离后CD34干细胞回收总数提高了8.4-11％。针对外周血样品，分离后细胞回收总数提高了23.1-46.7％，分离后CD34干细胞回收总数提高了10.8-25.6％，目标干细胞分离回收率的提高，可以有效节约人类骨髓、脐带血或外周血样品，提高样品的使用效率。
文档编号C12N5/0789GK102154201SQ201110026680
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者唐明淇 申请人:唐明淇