专利名称：抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品的制作方法
技术领域：
本发明涉及以异伞菌(Agaricus blazei Murill)萃取物和乳酸菌的加热处理菌体为有效成分的抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品。
背景技术：
众所周知，属于担子菌纲伞菌科真菌的异伞菌(Agaricus blazei Murill)是具有癌症、过敏症、糖尿病、高血压等的预防和治疗效果的成分，例如，作为抗肿瘤活性成分，可分别从其子实体分离出酸性多糖体(日本专利公开公报昭64-67194号)、中性多糖体(日本专利公开公报昭64-67195号)及蛋白多糖体(日本专利公开公报平2-78630号)，从菌丝体中分离出蛋白多糖体(日本专利公开公报昭61-47518号)，进一步从菌丝体的培养滤液中分离出蛋白多糖体(日本专利公开公报昭61-47519号)。
异伞菌作为健康食品原料被广泛利用。例如，日本专利公开公报2001-103927号揭示了在加压条件下用水性溶剂对伞菌进行萃取，然后用50％的乙醇对该萃取物进行处理，再将所得伞菌浸膏混入食品而制得的食用组合物。
日本专利公开公报2001-17130号揭示了含有伞菌的健康饮料食品，该健康饮料食品的特征是在伞菌的煎液中混入了醋和蜂蜜。
日本专利公开公报平11-32723号揭示了利用以半纤维素酶为主的酶对伞菌的菌丝体、子实体及它们的混合物或它们的培养残液进行分解处理，获得β-葡聚糖，以含有大量这种β-葡聚糖的生理活性物质为主成分的健康食品。
此外，乳酸菌也已作为健康食品被广泛摄取，具有改善肠内菌丛的平衡、减少肠内腐败物的产生、改善粪便性状和免疫激活的效果。例如，日本专利公开公报2001-48796号揭示了以粪肠球菌AD101菌株的死菌体为主成分的免疫调节剂。
日本专利公开公报平10-29946号揭示了以乳酸菌或其处理物为有效成分的体液免疫恢复剂，该恢复剂具有使因药剂而下降的体液免疫机能恢复的作用。
日本专利公开公报平6-80575号揭示了以乳酸菌菌体及/或菌体含有物为有效成分的经口免疫激活剂。
日本专利公开公报平5-252900号揭示了包含乳酸菌菌体的细胞质成分及/或细胞质成分含有物的免疫激活组合物。
发明内容
如上所述，异伞菌和乳酸菌虽然作为健康食品被广泛利用，但它们单独被摄取时的生理效果并不十分理想。
因此，本发明的目的是提供经口摄取对病原菌等的感染可显现出良好的抑制效果的抑制感染组合物及含有该组合物的饮食品。
本发明者们为了达到上述目的认真研究后发现，并用异伞菌的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体，能够对病原菌的感染显现出较强的抑制作用，从而完成了本发明。
即，本发明1是抑制感染组合物，该组合物的特征是含有作为有效成分的异伞菌(Agaricus blazei Murill)的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体。
本发明1利用异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物及乳酸菌的加热处理菌体所具备的免疫赋活活性的协同效果，提供了对病原菌等的感染显现出较强抑制作用的抑制感染组合物。
本发明1中的乳酸菌较好为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。此外，最好含有0.5～99.5质量％的前述异伞菌(Agaricus blazei Murill)的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和99.5～0.5质量％的前述乳酸菌的加热处理菌体。这样可提供能够更有效地对病原菌等的感染进行抑制的抑制感染组合物。
本发明2是提供含有上述抑制感染组合物的饮食品。
本发明2中，前述抑制感染组合物对应于1餐份的含量最好为0.01～10g。
本发明的抑制感染组合物中由于含有作为食品摄入的异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取液和乳酸菌的加热处理菌体作为有效成分，所以比以往安全性高，通过摄入上述萃取液和加热处理菌体，可对病原菌等产生良好的感染预防效果。将本发明的抑制感染组合物添加到饮食品中，可提供能够预防病原菌等的感染的饮食品。
虽然目前还未明确本发明的抑制感染组合物的抑制感染效果的作用机理，但通过同时摄入异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取液和乳酸菌的加热处理菌体，可使以巨噬细胞、NK细胞及T细胞为中心的细胞免疫系统活化，有效排除病原菌等。
图1表示感染单核细胞增生利斯特氏菌后的小鼠生存率。
图2表示感染单核细胞增生利斯特氏菌后的小鼠脾脏中的单核细胞增生利斯特氏菌数的测定结果。
图3表示通过ELISA法测定的肠系膜淋巴结细胞(MLN)培养液的上清液中的细胞因子量(IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ)。
具体实施例方式
作为本发明的抑制感染组合物的有效成分之一的异伞菌的子实体萃取物可由水、乙醇等溶剂直接萃取获得，也可用水、乙醇等溶剂萃取其干燥物而获得。例如，加入干燥异伞菌子实体质量的约20倍的水，于120℃进行30分钟萃取，然后对所得萃取液进行适当浓缩和干燥。
此外，可在含有碳源及氮源的培养基中对异伞菌的种菌进行培养，然后直接萃取而获得异伞菌的菌丝体培养物的萃取物，或者如前所述对其干燥品进行萃取。
本发明还可使用市售的异伞菌子实体及/或菌丝体培养物的萃取物。
作为本发明的抑制感染组合物的另一有效成分的乳酸菌的加热处理菌体是对乳酸菌体进行加热处理而获得的死菌体，例如可通过以下方法获得。
在ロゴサ培养基中，于30～45℃对乳酸菌培养12～72小时后，通过离心分离等适当手段回收菌体。对回收的菌体进行水洗和浓缩，在80～115℃对该浓缩的菌体悬浮液进行30分钟～3秒钟的加热处理后，通过喷雾干燥和冷冻干燥等适当手段进行干燥而获得上述死菌体。上述乳酸菌包括粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、唾液链球菌嗜热亚种等。本发明最好使用具有更强的免疫赋活活性的粪肠球菌(ATCC 19433，ATCC 14508，ATCC 23655)。可使用的粪肠球菌的加热处理菌体包括EF POWER、EF-2001(商品名，康贝株式会社制)和FK-23(商品名，ニチニチ制药株式会社制)等市售品。
本发明的抑制感染组合物中最好包含0.5～99.5质量％的前述异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和99.5～0.5质量％的前述乳酸菌的加热处理菌体。更好是包含10～90质量％的异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和90～10质量％的乳酸菌的加热处理菌体。各有效成分的含量如果在上述范围之外，则协同抑制感染效果不理想。
本发明的抑制感染组合物中除了包含上述基本成分之外，还可包含赋形剂、甜味剂、酸味剂、维生素和矿物质。此外，对其形态无特别限定，可以是粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、溶液剂等，可根据使用目的的不同作适当选择。
本发明的抑制感染组合物的有效摄入量是成人1天0.01～10g，更好为0.05～2g。
本发明的抑制感染组合物可添加到各种饮食品中，例如，饮料、冻胶、糖果、口香糖、可加热食品、快餐食品等。上述抑制感染组合物的添加量对应于1餐份较好为0.01～10g，更好为0.05～2g。抑制感染组合物的添加量如果不足0.01g，则即使摄入也不能够获得足够的抑制感染效果，如果超过10g，则成本过高。
以下，通过实施例对本发明进行具体说明。以下例子中的试样使用作为异伞菌的子实体萃取物的“仙生露”(商品名，协和工程株式会社制)和作为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的加热处理菌体的“EF-2001”(商品名，康贝株式会社制)。
试验例(粪肠球菌的加热处理菌体的急性口服毒性试验)以OECD Guidelines for the Chemicals 401(1981)为基准，用小鼠进行急性口服毒性试验。
具体来讲，将粪肠球菌的加热处理菌体悬浮于精制水中，调制出试验溶液(250mg/mL)。
对4周龄的ICR系小鼠(雌雄各20只，从日本エスエルシ-株式会社购入)预备饲养约1周后，将它们分为试验组(雌雄各10只)和对照组(雌雄各10只)，用胃探子给试验组的小鼠强行一次经口服用上述试验溶液，粪肠球菌的加热处理菌体量按照5000mg/kg体重的标准换算。同时给对照组灌入精制水(雄性小鼠0.7mL，雌性小鼠0.6mL)。然后，在设定为室温23±2℃，照明时间12小鼠/天的饲养室内进行饲养。试验期间，小鼠可自由摄入水和饲料(商品名“小鼠、大鼠用固形饲料；ラボMR ストク”，日本农产工业株式会社制)。
灌入上述试验溶液和精制水后，1天观察1次(观察期为14天)，两组都未出现死亡例。观察期结束后对所有小鼠进行解剖，其主要脏器也未见异常。此外，灌入试验溶液和精制水后第7天和第14天测定小鼠体重，通过t检验法以显著性水平5％进行组间的比较，其结果如表1所示。
表1
用平均值±标准差(n＝10)表示体重从表1可看出，不论雌雄各组均未见体重增加有差异。从上述结果可看出，一次经口摄入粪肠球菌的加热处理菌体的小鼠的LD50值在5000mg/kg体重以上。
实施例1将40只7周龄的BALB/c雌性小鼠(从日本クレア株式会社购入)分为4组(每组10只)，分别用胃探子给试验组的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏(干燥子实体0.3mg/只)和粪肠球菌的加热处理菌体(10μg/只)的混合物，给比较组1的小鼠强行经口服用粪肠球菌的加热处理菌体(20μg/只)，给比较组2的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏(干燥子实体0.6mg/只)，给对照组的小鼠强行经口服用PBS(0.2mL/只)，1周内每天1次。
然后，在小鼠腹腔内注射单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，达到2×105CFU/只，观察各组小鼠的生存率。试验期间，小鼠可自由摄入水及饲料(商品名“粉末饲料CE-2”，日本クレア株式会社制)。
其结果如图1所示。从图1可看出，试验组、比较组1和2与对照组相比，显现出非常高的生存率。特别是试验组的小鼠没有1只死亡，这说明单核细胞增生利斯特氏菌的感染和增殖得到了抑制。
实施例2与实施例1同样，从试验前1周开始每天1次使各组小鼠强行经口服用试样，然后使小鼠感染单核细胞增生利斯特氏菌。然后，摘取小鼠的脾脏，测定脾脏感染的单核细胞增生利斯特氏菌数的变化。具体来讲，在感染后的第1、3、5、7天摘取脾脏，将脾脏磨碎后，悬浮于PBS中，对悬浮液进行逐步稀释后，将其移入“单核细胞增生利斯特氏菌的增菌培养基”(商品名，MERCK公司制)中进行培养(25℃，48小时)，测定出现的菌落数，其结果如图2所示。
从图2可看出，感染后第3天以后对照组的单核细胞增生利斯特氏菌数量增加，而试验组、比较组1和2的菌数减少，特别是试验组的菌数减少比例较大。
从这些结果可看出，经口同时摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体与它们分别单独摄入相比，前者显现出更好的抑制感染效果。
实施例3通过以下方法对经口同时摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体时的抑制感染作用机理进行探讨。
(1)CD3阳性αβ型T细胞的表面抗原解析检疫·验收结束后，将经过了1周预备饲养的BALB/c小鼠(雌性7周龄，从日本チャ-ルズリバ-株式会社购入)分为2组(每组3只)，分别用胃探子给试验组的小鼠强行经口服用异伞菌的子实体萃取浸膏(干燥子实体0.2mg/只)和粪肠球菌的加热处理菌体(20μg/只)的混合物(0.2mL/只)，给对照组的小鼠强行经口服用PBS(0.2mL/只)，1周内每天1次。然后，从小鼠的尾静脉注射入单核细胞增生利斯特氏菌，达到1.4×104CFU/只。在饲养期间，小鼠可自由摄入水和饲料(商品名“粉末饲料CE-2”，日本クレア株式会社制)。
接种单核细胞增生利斯特氏菌后的第5天杀死各组的小鼠，摘取其肠系膜淋巴结，用毛玻璃夹住肠系膜淋巴结，使其悬浮于含有10％FBS的RPMI-1640培养液(商品名，Invitrogen制)，洗涤后用不锈钢筛网除去多余的组织片，分别调制试验组及对照组的肠系膜淋巴结细胞(以下称为MLN)。
使各MLN悬浮于含有10％的FBS的RPMI-1640培养液中，达到5×105个/mL，在6孔板(Corning Costar Co.制)的每1个孔中加入1mL培养液。然后，在每1个孔中混入经过作为刺激物的丝裂霉素C(协和发酵工业制)处理过的来自未经处理的BALB/c小鼠的脾细胞(5×105个)及单核细胞增生利斯特氏菌的加热死菌体(1.0×106CFU)，于37℃在5％的CO2存在下培养48小时。上述未经处理的小鼠是指未服用过供试物质且未经过细菌接种的小鼠。
用以下的3种标记抗体(抗体全部由Becton Dickinson PharMingen公司购入)对各MLN进行染色，进行细胞表面抗原的解析。
1)Cy-chrome(Cy)标记抗CD3εmAb/FITC标记抗TCRαβmAb/PE标记抗CD4mAb/biotin标记抗CD8mAb2)Cy标记抗CD3εmAb/FITC标记抗TCRαβmAb/PE标记抗CD69mAb/biotin标记抗CD8mAb3)Cy标记抗CD3εmAb/FITC标记抗TCRαβmAb/PE标记抗CD122mAb/biotin标记抗CD8mAb即，在调制成1.0×105个MLN的悬浮液中添加5μL上述1)表示的标记抗体，于4℃保温45分钟后，用含有5％FBS的Hank’s缓冲液洗涤2次，再添加5μL的SA-RED613(商品名，Invitrogen公司制)，于4℃保温45分钟后，用含有5％FBS的Hank’s缓冲液洗涤3次。接着，通过流动细胞测定仪(Epics XL，Beckman Coulter Inc.制)进行MLN的表面抗原解析，求得CD4-CD8+细胞与CD4+CD8-细胞的比例，比较CD8阳性率，其结果如表2所示。
表2
从表2可看出，试验组的CD8阳性率比对照组的约高2倍左右，这说明摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体提高了CD8阳性率。
此外，以CD69(初期活性标记)及CD122(IL-2受体β链)为指标研究CD8阳性T细胞活化的有无。即，使用上述2)和3)表示的标记抗体，通过与上述同样的方法进行细胞的表面抗原解析，其结果如表3所示。
表3
从表3可看出，试验组的CD69及CD122阳性率都比对照组的高，这说明摄入异伞菌的子实体萃取浸膏和粪肠球菌的加热处理菌体促进了CD8阳性T细胞的活化。
(2)细胞因子的产量与上述同样调制对照组及试验组的MLN，添加刺激物，于37℃在5％CO2存在下进行48小时的培养。
培养结束后回收培养上清液，用ELISA法测定培养上清液中的细胞因子量(IL-2、IL-10、IL-12、IFN-γ)。用从Endogen Inc.公司购入的测定盒测定IL-2、IL-12和IFN-γ，用从AN’ALYZA TECHNE Co.公司购入的测定盒测定IL-10，其结果如图3所示。
从图3可看出，试验组的作为T辅助细胞1(Th-1)型细胞因子的IFN-γ及IL-12的产量非常高，作为T辅助细胞2(Th-2)型细胞因子的IL-10的产量非常低。
用RT-PCR法研究细胞因子特异性mRNA的表达量，结果发现试验组的Th-1型细胞因子I1-12、IFN-γ及TNF-α的mRNA的表达量增加。Th-2型细胞因子IL-10的mRNA的表达量无差别。
一般，被单核细胞增生利斯特氏菌等细胞内寄生细菌感染的机体内巨噬细胞和NK细胞被活化，分别产生IL-12及IFN-γ。这些细胞因子又使细菌抗原特异性的CD8阳性T细胞活化，其结果是具有细胞毒性(CTL)的CD8阳性T细胞完成细菌排除。此外，由T细胞产生的TNF-α具有使中性粒细胞和巨噬细胞等吞噬细胞聚集在感染部位的作用。
即，从上述结果可看出，通过并用异伞菌的子实体浸膏和粪肠球菌，更促进了巨噬细胞和NK细胞的活化，使IL-12及IFN-γ等的产量增加，同时还促进了单核细胞增生利斯特氏菌特异性CD8阳性细胞的活化，细菌排除也较对照组快。
如上所述，本发明提供了具有良好抑制感染效果的组合物，该组合物含有异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和粪肠球菌的加热处理菌体作为有效成分。此外，还提供了可预防病原菌等的感染的饮食品，该饮食品中添加了本发明的抑制感染组合物。
本发明的抑制感染组合物由于来源于食品，所以安全性较高，摄入后预期可促进以细胞免疫为中心的机体防御系统的活化，具有预防病原菌等的感染的效果。
权利要求
1.抑制感染组合物，其特征在于，含有作为有效成分的异伞菌(Agaricusblazei Murill)的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体。
2.如权利要求1所述的抑制感染组合物，其中，前述乳酸菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
3.如权利要求1或2所述的抑制感染组合物，其中，含有0.5～99.5质量％的前述异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和99.5～0.5质量％的前述乳酸菌的加热处理菌体。
4.饮食品，所述饮食品含有权利要求1～3中任一项所述的抑制感染组合物。
5.如权利要求4所述的饮食品，其中，1餐份含有0.01～10g前述抑制感染组合物。
全文摘要
本发明提供了经口摄入后对病原菌等的感染显现出良好抑制效果的抑制感染组合物和含有该组合物的饮食品。所述组合物含有作为有效成分的异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和乳酸菌的加热处理菌体。前述乳酸菌最好为粪肠球菌。最好含有0.5～99.5质量%的前述异伞菌的子实体及/或菌丝体培养物的萃取物和99.5～0.5质量%的前述乳酸菌的加热处理菌体。
文档编号C12N1/20GK1386510SQ0212160
公开日2002年12月25日 申请日期2002年5月21日 优先权日2001年5月21日
发明者武川和琴, 菅辰彦 申请人:康贝株式会社