专利名称：一种慢病毒载体及其介导的分泌脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞系的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种慢病毒载体及其介导的高效、持久分泌脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞系的制备方法，属于医学生物技术领域。
背景技术：
人骨髓中包含两种类型的干细胞，一种为造血干细胞，为各种血细胞的再生提供来源；另一种为间充质干细胞，可以为造血干细胞提供适于生长的微环境，在骨髓中具有支持造血，促进血细胞生长发育的功能。另外，间充质干细胞还可以(1)自我更新，从骨髓中刚分离出的或冻存后复苏的间充质干细胞具有较强的增殖能力，可在短期内迅速扩增，以达到进行治疗或研究的足够数量。(2)多向分化潜能，间充质干细胞在体外不同的诱导条件下，可分化为骨细胞、软骨细胞、和脂肪细胞等不同类型的中胚层来源的细胞；在体内生理和病理条件下，间充质干细胞还可实现跨系分化，分化为神经细胞(包括神经元和胶质细胞)和内脏具有分泌功能的腺上皮细胞。(3)免疫调制，间充质干细胞对于移植物抗宿主病、移植免疫、多种自身免疫病等超敏反应状态，以及免疫缺陷等过低的免疫力都具有调节作用，是免疫系统的功能趋于正常。(4)如前所述，间充质干细胞在骨髓腔中可以为造血干细胞提供微环境，若异位移植到其它组织，则可分泌各种营养因子，并通过与局部组织细胞的接触作用，形成有利局部细胞存活，抑制局部细胞凋亡微环境，因而具有细胞保护功能。 因为骨髓间充质干细胞具有以上特性和功能，且可来源于自体，避免潜在的免疫排斥造成的不良后果，加之对骨髓移植的基础、临床研究的丰富经验，近年来自体骨髓间充质干细胞或经过ex vivo基因工程改造的骨髓间充质干细胞已经逐渐成为治疗疾病的新型工具。人脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)不但在中枢神经系统内广泛分布，还分布于视网膜，外周运动神经元，肾脏和前列腺组织。它在中枢神经系统发育过程中，对神经元的分化和生长发育起重要作用；在成体中，是神经元维持生存及正常生理功能所必需。更重要的是，BDNF还具有防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。本发明专利用慢病毒载体制备高效、持久分泌人BDNF的人骨髓间充质干细胞系， 旨在利用BDNF在病理条件下对神经的保护、营养作用，以及间充质干细胞的免疫调制或微环境的维持作用，此种细胞系的建成，将对各种原因造成的眼部退行性变疾病，神经系统退行性变、神经损伤以及自身免疫性神经系统疾病起到改善的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种慢病毒载体及其介导的高效、持久分泌脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞系的制备方法，使转导后的人骨髓间充质干细胞稳定高效表达人脑源性神经营养因子(BDNF)。本发明是通过以下技术方案实现的
一种表达分泌型人脑源性神经营养因子(BDNF)的慢病毒表达载体。一种慢病毒载体介导的分泌BDNF的骨髓间充质干细胞系的制备方法，包括以下步骤(1)慢病毒表达载体的构建利用PCR的方法，扩增人BDNF。人的BDNF基因结构复杂，有十几种剪接体，但绝大多数剪接体的变异都是在非编码的启动子区，并不影响其所编码的蛋白质序列。所以在设计引物时，采取在剪接体中出现频率最多的BDNF编码序列为模板(GenBank accession number BC029795,全名 Homo sapiens brain-derived
neurotrophic factor)。上游引物5，-GC GCTAGCCACC ACCATGACCATCCTTTTCCTTACT A-3，(SEQ IDN0. 2)，最前面的GC为保护碱基，下划线部分为加入的酶切位点Nhel，阴影区 GCCACC为Kozak序列，这个序列与酶切位点GCTAGC的最后两个碱基共用GC，这一设计有效地利用了序列，减少了引物的冗长。再以后是BDNF的cDNA起始密码子ATG之后的一段序列。下游引物5，-GCCTCGAGCTATCTCCCCTTTTAATG-3，(SEQ ID NO. 3)，同理，GC 为保护碱基， 下划线部分为加入的XhoI酶切位点，CTA为终止密码子TAG的互补序列，扩增后的人BDNF 克隆入慢病毒表达载体，并将重组慢病毒表达质粒命名为lenti-BDNF。(2)慢病毒的包装用优化参数的磷酸钙转染法包装慢病毒，并用超速离心法浓缩病毒颗粒，测定包装病毒的滴度；所述优化参数的磷酸钙转染法是指利用磷酸钙法转染 293T细胞，2X转染缓冲液的pH值7. 07-7. 13，转染后4_7小时换液，换液后48-60小时收集细胞上清液，再用细胞上清液转导人骨髓间充质干细胞系。(3)用包装后的慢病毒颗粒，用逆转染法转导人骨髓间充质干细胞，转导后细胞可高效分泌人BDNF，是未转导人骨髓间充质干细胞的336倍，且随着细胞的生长和传代，细胞分泌BDNF的功能得以长期维持。本发明的有益效果为(1)本发明利用人BDNF本身的信号肽，并采用出现频率最高的剪接体的序列为模板，并加入Kozak序列，将编码人BDNF的cDNA克隆入慢病毒表达载体，后续试验证明，这一策略完全可以实现BDNF稳定的高效表达；(2)本发明通过优化转染前细胞密度，2X转染缓冲液的pH值，转染后换液时间，以及CaCl2浓度，摸索出高效、低成本磷酸钙转染并包装病毒的方法，病毒滴度达109IU/ml以上。(3)本发明通过逆转染的方法， 用包装后的慢病毒颗粒，转导人骨髓间充质干细胞，这样可以达到快速(比正常转染节省1 天时间)转导。而且转导后的人骨髓间充质干细胞可以高效(比未转导的干细胞高出330 多倍)、持续分泌(直至转导后72天，分泌仍未显下降趋势)BDNF。
图1为人骨髓间充质干细胞在体外培养1.5天(A)，3天(B)，7天(C)，10天⑶ 的情况。图2为表达分泌型人BDNF的慢病毒表达载体构建。图2_A为人BDNF的PCR扩增产物，加上酶切位点和Kozak序列，长度为760bp (SEQ ID NO. 1)。图2_B为PCR鉴定人 BDNF克隆入A-T载体的阳性菌株，可见筛选的菌株均为阳性。图2-C为筛出的A-T阳性菌株NheI和XhoI双酶切鉴定，其中小片段为切出的BDNF片段。图2-D为纯化的慢病毒载体 (大片段)和插入的BDNF片段(小片段)。图2-E为PCR鉴定BDNF克隆入慢病毒的阳性菌株(3个阳性克隆)。
图3为慢病毒转导后64小时，ELISA检测的非浓缩与浓缩慢病毒颗粒转导的人骨髓间充质干细胞分泌BDNF的情况。图4为转导后25天，34天，39天，72天，western blot检测细胞培养上清液中BDNF 的分泌情况。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，不以任何方式限制此发明，凡依照本发明公开内容所进行的任何本领域的等同替换或显而易见的变化或变动，均属于本发明的保护范围。实施例1 人骨髓间充质干细胞的培养一、方法1.人骨髓间充质干细胞的复苏(此步骤目的是去除死细胞和不贴壁的细胞)(1)人骨髓间充质干细胞的完全培养基包括α -MEM(Invitrogen/GIBCO, USA)， 16. 5% 的胎牛血清(Atlanta Biologicals, USA)，2_4mM 的谷氨酰胺(Invitrogen/GIBCO, USA)和青/链霉素(终浓度为分别为100单位/ml和100 μ g/ml, Invitrogen/GIBCO)。在 37°C预热并放入直径为15cm的细胞培养皿(Corning，USA)。将人骨髓间充质干细胞从干冰中取出后37°C水浴快速解冻至95%融化时，将其迅速取出，用5ml的无菌移液器均勻、缓慢地加入加有培养基的细胞培养皿。(2)在37°C,5%C02细胞培养箱培养24小时后，吸取上清以去除不贴壁的或死细胞，PBS漂洗2遍，以去除培养基中的残留的血清。胰酶消化细胞37°C 2-7分钟，加血清或
完全培养基终止反应。(3)吸取细胞到无菌50ml离心管中，室温离心450_500g，10分钟，重悬细胞沉淀， 计数。2.人骨髓间充质干细胞的扩增(1)将人骨髓间充质干细胞以60个细胞/cm2的密度种植与直径为15cm的细胞培养板，即每板包括约IO4个细胞。根据细胞计数的结果，将细胞浓度调整为IO4细胞/ml，亦即每个培养平板加Iml细胞悬液。(2)在15ml细胞培养板内先加入37°C预热的完全培养基24ml，再均勻、缓慢加入 Iml细胞悬液，并呈8字形水平移动细胞培养板，使细胞均勻分布。(3)每3天换新鲜培养基，并及时在相差显微镜下监测细胞生长状况。二、结果培养1. 5天后(如图1-A)，人骨髓间充质干细胞贴壁生长，胞体较小， 成卵圆形；培养3天后，人骨髓间充质干细胞呈细长梭形，并伸出细长的突起，个别细胞呈扁片状，呈与周围细胞融合趋势(如图1-B)；培养7天后，细胞继续长大，多数细胞呈扁片状，但细胞尚未融合(如图1-C)；培养第10天，细胞逐渐融合，呈典型的波纹状生长(如图 1-D)。实施例2 编码人脑源性神经生长因子cDNA的慢病毒表达载体构建一、方法 1. PCR扩增含有酶切位点编码人BDNF的cDNA序列 引物设计后，人BDNF的基因模板购自美国Openbiosystem公司(Catlog#MHS1010-7430336)，用高保真性 DNA 聚合酶 pfu (Stratagene，USA)，以下述方法行
PCR
组分体积(μ )
Nuclease free H2O78. 2
IOXbuffer10
dNTP(25mM each)0. 8
模板(0. 1 μ g/ μ 1)1
上游引物(10 μ Μ)4
下游引物( ο μ Μ)4
Cloned pfu (2. 5u/μ 1)2
总体积100
权利要求
1.一种表达分泌型人脑源性神经营养因子的慢病毒表达载体。
2.—种慢病毒载体介导的分泌BDNF的骨髓间充质干细胞系的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤(1)慢病毒表达载体的构建利用PCR的方法，扩增人BDNF的cDNA序列，扩增后的人 BDNF克隆入慢病毒表达载体，重组慢病毒表达载体命名为Ienti-BDNF ；(2)用优化参数的磷酸钙转染法包装慢病毒，并用超速离心法浓缩病毒颗粒，测定包装病毒的滴度；(3)用包装后的慢病毒颗粒，用逆转染法转导人骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述慢病毒载体介导的分泌脑源性神经营养因子的骨髓间充质干细胞系的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)用优化参数的磷酸钙转染法包装慢病毒是指利用磷酸钙法转染293T细胞，2X转染缓冲液的pH值7. 07-7. 13，转染后4_7小时换液， 换液后48-60小时收集细胞上清液，再用细胞上清液转导人骨髓间充质干细胞系。
全文摘要
本发明公开了一种慢病毒载体及其介导的分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的骨髓间充质干细胞系的制备方法，包括以下步骤(1)慢病毒表达载体的构建利用PCR的方法，扩增人BDNF的cDNA序列，扩增后的人BDNF克隆入慢病毒表达载体，重组慢病毒表达载体命名为lenti-BDNF；(2)用优化参数的磷酸钙转染法包装慢病毒，并用超速离心法浓缩病毒颗粒，测定包装病毒的滴度；(3)用包装后的慢病毒颗粒，用逆转染法转导人骨髓间充质干细胞。本发明通过优化转染前细胞密度，2X转染缓冲液的pH值，转染后换液时间，以及CaCl2浓度，摸索出高效、低成本磷酸钙转染并包装病毒的方法。转导后的人骨髓间充质干细胞可以高效、持续分泌BDNF。
文档编号C12R1/91GK102174578SQ20111002653
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者孙国玲, 张琰, 李筱荣, 王飞 申请人:天津医科大学眼科中心